CC BY
17УДК 57.044 : 615.9
АССОЦИАЦИЯ
ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА БОНЕ С АКТИВНОСТЬЮ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ КРЫС ПОСЛЕ ОТРАВЛЕНИЯ МАЛАТИОНОМ
А.В. Баб-кип1, И.С. БердинскиХ , Н.С. Осечкина? , Г.В. Назаров1, М.А. Юдин', В.Н. Быков? А.М. Сарана2
'Научно-исследовательский испытательный институт военной медицины Военно-медицинской академии им С.М Кирова 195043, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
2СПб ГБУЗ «Городская больница № 40», 197706, г. Сестрорецк, г. Санкт-Петербург, Российская ффедерация
На модели отравления крыс малатионом в дозе 1 ЛД50 исследована ассоциация полиморфизмов гена В^е с активностью бутирилхолинэстеразы. Изучено распределение генотипов 6 полиморфных вариантов гена В^е. Показана достоверная (р<0,05) ассоциация вариантов Т>С ^РГО ге198598583), G>T ^РГО ге106118718), А>Т ^РГО Ы07226860) с активностью бутирилхолинэстеразы в ткани печени через 1 сутки после отравления, а их распространенность характеризуется сцепленным типом наследования. Наибольшая корреляционная связь активности фермента в печени прослежена для аллельных вариантов А>Т (Ы07226860) и G>T (Ы06118718). У крыс с гомозиготным вариантом генотипа активность фермента была достоверно больше (на 30%) по сравнению с гетерозиготным генотипом.
Ключевые слова: генетический полиморфизм, ген Вс^е, активность бутирилхолинэстеразы, отравление, малатион.
Введение. Бутирилхолинэстераза (БХЭ) выполняет многие функции в организме человека и животных: участвует в передаче нервных импульсов [1] и гидролизует избыток ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах [2]. Изменение активности фермента наблюдается при различных патологических состояниях и, в первую очередь, заболеваниях печени, анемии, новообразованиях, кахексии и хронических инфекциях. БХЭ образует комплекс с рядом токсикантов, относящихся к классу фосфорорганических соединений (ФОС), включая пестициды (малатион, хлорпирифос, диазинон) и отравляющие вещества (зарин, зоман, Vx) [3]. При отравлении этими ядами наблюдается выраженное снижение активности фермента [4].
При любом варианте поражения ФОС первичный контакт яда с холинэстеразой плазмы крови происходит в сосудистом русле, субстратом которой является бутирилхолин. Это обстоятельство позволяет рассматривать БХЭ в своем роде «буферной системой» между ядом и органами-мишенями. За счет такого действия БХЭ предохраняет АХЭ нервно-мышечных синапсов от ингибирования ФОС, а ее активность может служить критерием адекватности проведения терапии и исхода интоксикации ФОС [5].
До настоящего времени лечение отравлений рядом ФОС и, в первую очередь, малатионом сопряжено с недостаточной эффективностью средств антидотной терапии (атропин) и реак-тивационной способностью дипироксима, рекомендованного для применения в гражданском
здравоохранении. Особенности протекания отравлений малатионом и недостаточный биологический отклик в ответ на прием фармакологических средств может обусловливаться полиморфизмом генов, обеспечивающих регуляцию холинергической системы. О вероятной роли генетических различий также указывают данные об индивидуальности течения интоксикации и степени ингибирования БХЭ у животных одного и того вида.
Показано, что активность БХЭ может определяться структурными особенностями гена, кодирующего наработку этого фермента. Ген Bche локализован на длинном плече второй хромосомы (локус 2q32) и содержит значительное число однонуклеотидных замен (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) [6]. Встречаются сведения о влиянии полиморфизма гена Bche на ферментативную активность БХЭ человека [7, 8, 9, 10]. В то же время влияние полиморфизма гена Bche на активность БХЭ, а также ее восстановление при воздействии малатионом ранее не было исследовано.
В связи с этим целью настоящей работы было исследование ассоциации полиморфных вариантов гена Bche белых беспородных крыс с активностью БХЭ после отравления малатионом.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена в соответствии с Национальными и Международными Правилами работы с лабораторными животными, а ее выполнение санкционировано Комиссией по биоэтике (IACUC), утвержденной начальником Института от 19.11.2009
Бабкин Александр Владимирович (Babkin Aleksandr Vladimirovich), научный сотрудник НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г Санкт-Петербург, [email protected] Бердинских Ирина Сергеевна (Berdinskih Irina Sergeevna), научный сотрудник НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г Санкт-Петербург, [email protected] Осечкина Наталья Сергеевна (Osechkina Natalya Sergeevna), младший научный сотрудник НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г. Санкт-Петербург, [email protected] Назаров Георгий Валерьевич (NazarovGeorgiy Valerevich), доктор химических наук, доцент, начальник отдела НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г Санкт-Петербург, [email protected]
Юдин Михаил Анатольевич (Judin Mikhail Anatol'evich), кандидат медицинских наук, доцент, заместитель начальника отдела НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г Санкт-Петербург, [email protected]
Быков Владимир Николаевич(Bykov Vladimir Nikolaevich), доктор медицинских наук, доцент, начальник центра НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г Санкт-Петербург, bykov_ [email protected].
Сарана Андрей Михайлович (Sarana Andrey Mikhailovich), кандидат медицинских наук, доцент, начальник отделения реабилитации СПб ГБУЗ «Городская больница № 40», г Сестрорецк, 197706, г Санкт-Петербург
16
Токсикологический вестник n<->5 (128)
г. Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах-самцах массой 180-240 г., содержавшихся в условиях вивария (питомник РАМН «Рапполово», Ленинградская область). За 12 ч до начала эксперимента животных лишали пищи. Для моделирования отравления животным однократно внутрижелудочно (в/ж) вводили малатион в дозе 1 ЛД50 (410 мг/кг). В качестве антидота отравлений ФОС всем животным на первых признаках интоксикации внутримышечно вводили атропин в дозе 2 мг/кг, пересчитанной по методике межвидового переноса доз согласно «Руководства...» [11]. При экстраполяции на человека доза атропина соответствовала 20 мг/чел. (лечение тяжелых форм отравлений ФОС). Контрольной группе вводили стерильную воду для инъекций из расчета 1 мл/кг. Наблюдение за животными осуществляли в течение 1 сут.
В этот срок исследовали биохимические и генотипические маркеры интоксикации. Скорость ферментативного гидролиза бутирилтиохолин йодида (субстанции Sigma) определяли в крови, гомогенатах печени и головного мозга при температуре 37,4 °С в среде 0,04 М фосфатного буфера при рН = 7,5 в условиях постоянства концентрации субстрата (метод Эллмана) [12]. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Hitachi U-2900 при длине волны 412 нм.
Выделение ДНК осуществляли из образцов периферической крови с использованием автоматической станции для выделения нуклеиновых кислот «NorDiag Arrow» (Швеция) и коммерческого набора «Arrow Blood DNA Kit 500» (Швеция) по протоколу «DNA Blood 500». Концентрацию выделенной ДНК определяли с использованием спектрофотометра «BioSpec-nano» (Япония).
Для определения полиморфизмов гена Bche проводили полимеразно-цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе «QuantStudio 12K Flex», «Applied Biosystems» (США), с использованием коммерческих праймеров и зондов, нанесенных производителем на пластины «OpenArray». С использованием робота «OpenArray AccuFill System» на пластины «OpenArray» наносили реакционную смесь для генотипирования TaqMan® OpenArray® Genotyping Master Mix, деионизованную воду и образцы ДНК [13]. Термоциклирование пластин «OpenArray» проводили по следующей программе: 95 °С - 600 с - 1 цикл; (92 °С - 15 с, 60 °С - 60 с) - 40 циклов. При анализе данных ПЦР-РВ использовали программное обеспечение «HOME Genotyper».
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы Sta-tistica 8.0. Проверка соответствия распределения показателей активности БХЭ в печени нормальному распределению была проведена с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения уровней активности БХЭ при носительстве различных генотипов использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение. На основании информационно-теоретического поиска определен перечень вариаций гена Bche, ответственных за ферментативную активность БХЭ. Установлено, что частоты полиморфных вариантов гена Bche (SNPID rs198598583, rs106414162, rs107226860, rs106296908, rs106118718, rs105196691) оказывают наиболее выраженное влияние на активность БХЭ. Два из них расположены в экзонах (кодирующей области гена), 3 других в интронах (неко-дирующей части гена), а также еще 1 расположен в 3'- области гена [6]. Анализ образцов ДНК, выделенных из периферической венозной крови крыс, позволил выявить частоты полиморфных вариантов гена Bche (табл. 1).
У исследуемых животных показано отсутствие разнообразия среди генетических вариантов G>A (rs106414162), A>G (rs106296908), C>T (rs105196691) гена Bche. Следовательно, можно предположить, что данные полиморфизмы гена Bche не оказывают влияния на активность фермента БХЭ.
В противоположность этому полиморфизмы T>C (rs198598583), G>T (rs106118718), A>T (rs107226860) формировали различные генотипы с относительно схожими частотами. В оцениваемой выборке не наблюдали ни одного животного с гомозиготными генотипами по «редким» аллелям, что может объясняться малой частотой их представленности в популяции крыс.
Полученные данные позволили выделить три основных полиморфизма гена Bche, которые могут влиять на ферментативную активность БХЭ в организме крыс: T>C (rs198598583), G>T (rs106118718), A>T (rs107226860). Среди исследованной выборки животных проведен анализ ассоциации вариантов гена Bche с активностью БХЭ, при этом только для ткани печени показана корреляция показателей. Для всех трех вариантов полиморфизма гена Bche было характерно сцепленное наследование.
Результаты активности БХЭ печени в зависимости от полиморфизма гена Bche через 1 сутки после отравления крыс малатионом в дозе 1 ЛД50 и терапии атропином (2 мг/кг, в/м) представлены на рисунке 1.
Для исследованных групп характерно отсутствие межгрупповых отличий по гетерозиготному или гомозиготному вариантам полиморфизма гена ВсИе. У крыс с гомозиготным вариантом генотипа, независимо от полиморфизма гена ВсИе, активность фермента была достоверно (при р<0,05) выше на 30 % по сравнению с БХЭ животных с гетерозиготным генотипом.
Особенности эстеразного статуса позволили предположить о ведущей роли гомозиготных вариантов гена ВсИе в восстановлении активности БХЭ в ткани печени на фоне ее тотального ингибирования (до 80%) малатионом в течение 1-2 ч после отравления.
Полученные данные свидетельствуют о наличии ассоциации всех трех исследованных вариантов гена ВсИе с активностью БХЭ в печени через 1 сутки после отравления крыс малатионом в дозе 1 ЛД50. По уровню статистической значимости наибольшая корреляционная связь активности БХЭ в печени прослеживалась для крыс с генотипом А>Т (^107226860) и G>T (^106118718).
Результаты изучения особенностей протекания отравления ФОС и эстеразного статуса в зависимости от полиморфизма генотипа гена ВсИе у животных подтверждаются данными оценки зависимости полиморфизма гена, кодирующего БХЭ, с ее ферментативной активностью у человека. Так, у носителей мутации (А^, ^1799807) активность БХЭ значительно ниже, а в ряде случаев практически не прослеживается [9]. Данный факт может быть обусловлен наработкой фермента с измененной пространственной структурой эстеразного участка. Показано, что точечная мутация ^>А, М803274), определяющая так называемый «К-вариант» БХЭ, приводит к снижению активности фермента в среднем до 30% от внутрипопуляционной нормы [7]. В то же время существуют варианты гена, кодирующего БХЭ человека, ассоциированного с повышенной активностью БХЭ. Так, например, у носителей «йоханнесбургского» варианта, выявленного в южноафриканской популяции, наблюдаются более высокие показатели активности БХЭ по сравнению с общей популяцией в среднем в 2-3 раза [8]. Показано, что у лиц с вариантом БХЭ, устойчивой к ингибированию 0,05 мМ раствором фторида натрия, обнаруживались одна или две мутации в гене БХЭ (Тк271Ые^ ^28933389; Gly418Val ^28933390) [10].
Проведенное исследование продемонстрировало достоверную (р<0,05) ассоциацию вариантов Т>С (М98598583), G>T (^106118718), А>Т (^107226860) гена ВсИе с активностью БХЭ в печени после отравления малатионом в дозе 1 ЛД50 и терапии атропином (2 мг/кг, в/м). Носители гетерозиготных генотипов (СТ, АТ и GT соответственно) обладали более низкой ферментативной активностью БХЭ в печени через 1 сутки после введения ФОС, в сравнении с носителями гомозиготных генотипов по «диким» аллелям. Следовательно, можно предположить, что крысы с гомозиготными генотипами по «диким» аллелям должны быть более устойчивы к воздействию ФОС. Варианты гена ВсИе Т>С (М98598583) и G>T (Ы06118718) предположительно наследуются сцепленно, то есть генотипу ТТ соответствует генотип GG. Поэтому влияние на активность БХЭ в печени через 1 сутки после отравления малатионом в дозе 1 ЛД50 одного из полиморфных вариантов может объясняться влиянием второго варианта.
Эти и другие особенности генетического профиля с активностью БХЭ имеют принципиальное значение при разработке средств фармакологической коррекции поражений ФОС. Данные исследования полиморфизма гена ВсИе в острый период отравления крыс малатионом на уровень активности БХЭ позволяют сформировать новые подходы для оценки эффективности существующих средств лечения поражений ФОС, равно как и определить новые направления для разработки средств лечения, основанных на инженерной биотехнологии, используя при этом биологическую модель отравления на крысах.
Заключение. В ходе экспериментальных исследований установлено, что полиморфные варианты Т>С (^198598583), G>T (Ы06118718), А>Т (^107226860) гена ВсИе определяют активность БХЭ в печени крыс через 1 сутки после отравления малатионом в дозе 1 ЛД50. Наибольшая корреляционная связь активности фермента в печени прослежена для аллельных вариантов А>Т (^107226860) и G>T (^106118718) и гомозиготным вариантом генотипа.
Наличие полиморфизма в гене ВсИе обуславливает различный профиль активности БХЭ и, предположительно, различную реакцию животных одного и того вида в ответ на введение малатиона в дозе 1 ЛД50. Результаты изучения полиморфизма гена, кодирующего БХЭ после выполнения дополнительных исследований, могут быть использованы для обоснования схем применения рекомендованных средств лечения отравлений ФОС, а также разработки новых средств патогенетической терапии.
17
Таблица 1
Частота встречаемости полиморфных вариантов гена Bche у крыс после отравления малатионом
в дозе 1 ЛД50 и терапии атропином (2 мг/кг, в/м)
№ п/п Полиморфные варианты гена Bche
NN NM MM
1 T>C (rs198598583) 13 (44,8) 16 (55,2) 0 (0)
2 G>A (rs106414162) 29 (100) (0) 0 (0)
3 A>T (rs107226860) 12 (41,4) 17 (58,6) 0 (0)
4 A>G (rs106296908) 29 (100) (0) 0 (0)
5 G>T (rs106118718) 13 (44,8) 16 (55,2) 0 (0)
6 C>T (rs105196691) 29 (100) (0) 0 (0)
Примечание: 1 - NN - гомозигота по «дикому» аллелю, NM - гетерозигота, MM - гомозигота по «редкому» аллелю; 2 - в скобках указана частота встречаемости полиморфных вариантов гена Bche.
18
Токсикологический вестник №5 (128)
Рис. 1. Активность БХЭ в печени крыс через 1 сутки после отравления малатионом (1 ЛДОТ) и терапии атропином (2 мг/кг, в/м) в зависимости от полиморфизма в>Т (ге106118718) (А), Т>С (ге198598583) (Б), А>Т (ге107226860) (В) гена ВсИе
19
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Giasobini E. Cholinesterases: new roles in brain function and in Alzheimer's disease. Neurochem. Res. 2003; 28: 515-522.
2. GirardE. et al. Butyrylcholinesterase and the control of synaptic responses in acetylcholinesterase knockout mice. Life Sci. 2007; 80 (24-25): 2380-2385.
3. Broomfield C.A. et al. Protection by butyrylcholinesterase against organophosphorus poisoning in nonhuman primates. J Pharmacol Exp Ther. 1991; 259 (2): 633-638.
4. Дёгтева С.Д., Старостина В.К Холинэстераза: методы анализа и диагностическое значение. Новости «Вектор-Бест». 2008; 1 (47): 5-7.
5. Bajgar J. et al. Changes of cholinesterase activities in the rat blood and brain after sarin intoxication pretreated with butyrylcholinesterase. Drug Chem. Toxicol. 2007; 30 (4): 351-359.
6. SNP of Bche gene. Available at: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/snp?LinkName=gene_snp&from_
uid=65036 (accessed 1 May 2014).
7. Bartels C. F. et al. DNA mutation associated with the human butyrylcholinesterase K-variant and its linkage to the atypical variant mutation and other polymorphic sites. Am. J. Hum. Genet. 1992; 50: 1086-1103.
8. Krause A, Lane A.B., Jenkins T.A A new high activity plasma cholinesterase variant. J Med Genet. 1988; 25(10): 677-681.
9. McGuire M C. et al. Identification of the structural mutation responsible for the dibucaine-resistant (atypical) variant form of human serum cholinesterase. Proc. Nat. Acad. Sci. 1989; 86: 953-957.
10. Nogueira C. P. et al. Identification of two different point mutations associated with the fluoride-resistant phenotype for human butyrylcholinesterase. Am. J. Hum. Genet. 1992; 51: 821-828.
11. Миронов АН. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М., 2012.
12. Ellman G.L., Courtney KD, Andres V. Jr., Featherstone RM A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 1961; 7: 88-95.
13. TaqMan® OpenArray® Genotyping. Getting Started Guide (2010). Available at: http://tools.lifetechnologies. com/content/sfs/manuals/cms_058198.pdf (accessed 1 May 2014).
REFERENCES:
1. Giasobini E. Cholinesterases: new roles in brain function and in Alzheimer's disease. Neurochem. Res. 2003; 28: 515-522.
2. Girard E. et al. Butyrylcholinesterase and the control of synaptic responses in acetylcholinesterase knockout mice. Life Sci. 2007; 80 (24-25): 2380-2385.
3. Broomfield C.A. et al. Protection by butyrylcholinesterase against organophosphorus poisoning in nonhuman primates. J Pharmacol Exp Ther. 1991; 259 (2): 633-638.
4. Djogteva S.D., Starostina V.K Cholinesterase: methods of analysis and diagnostic importance. Novosti «Vektor-Best». 2008; 1 (47): 5-7 (in Russian).
5. Bajgar J. et al. Changes of cholinesterase activities in the rat blood and brain after sarin intoxication pretreated with butyrylcholinesterase. Drug Chem. Toxicol. 2007; 30 (4): 351-359.
6. SNP of Bche gene. Available at: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/snp?LinkName=gene_snp&from_
uid=65036 (accessed 1 May 2014).
7. Bartels C. F. et al. DNA mutation associated with the human butyrylcholinesterase K-variant and its linkage to the atypical variant mutation and other polymorphic sites. Am. J. Hum. Genet. 1992; 50: 1086-1103.
8. Krause A, Lane A.B., Jenkins T. A. A new high activity plasma cholinesterase variant. J Med Genet. 1988; 25(10): 677-681.
9. McGuire M C. et al. Identification of the structural mutation responsible for the dibucaine-resistant (atypical) variant form of human serum cholinesterase. Proc. Nat. Acad. Sci. 1989; 86: 953-957.
10. Nogueira C. P. et al. Identification of two different point mutations associated with the fluoride-resistant phenotype for human butyrylcholinesterase. Am. J. Hum. Genet. 1992; 51: 821-828.
11. MironovAN. Guidelines for pre-clinical trials of drugs. Part 1. Moscow. 2012 (in Russian).
12. Ellman G.L. Courtney KD.. Adres V. Jr.,
Featherstone RM A new and rapid colorimetric
determination of acetylcholinesterase activity. Biochem.
Pharmacol. 1961; 7: 88-95.
13. TaqMan® OpenArray® Genotyping. Getting
Started Guide (2010). Available at: http://tools.
lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_058198.
pdf (accessed 1 May 2014).
A.V Babkin1,I.S. Berdinskih', N.S. Osechkind, G.V NazaroV, M.A. Judiri, V.N. BykoV , A.M. Sarana1
ASSOCIATION OF BCHE GENE POLYMORPHIC VARIANTS WITH BUTYRYLCHOLINESTERASE ACTIVITY IN RATS POISONED WITH MALATHION
'Scientific Research Test Institute of Military Medicine, S.M. Kirov Medical Military Academy, 195043, Saint-Petersburg, Russian Federation 2City Hospital № 40, 197706 Sestroretsk, Saint-Petersburg, Russian Federation
The association of Bche gene polymorphisms with butyrylcholinesterase activity was investigated on a model of rats poisoned with malathion at a dose of 1 LD50. The genotype distribution of six polymorphic variants of Bche gene was studied. An authentic association (p <0.05) of variants T>C (SNPID rs198598583), G>T (SNPID rs106118718), A>T (SNPID rs107226860) with butyrylcholinesterase activity in the liver tissue a day after poisoning was shown; the prevalence of those polymorphic variants is associated with linked type of inheritance. The highest linkage correlation of the enzyme activity in the liver was observed in variants A>T (rs107226860) and G>T (rs106118718). Enzyme activity in rats with a homozygous genotype was authentically higher ( by 30 %) compared to the heterozygous genotype. Key words: gene polymorphism, Bche gene, butyrycholinesterase activity, intoxication, malathion
Материал поступил в редакцию 9.07.2014 г
20
