CC BY
20
[©c^c^TJTiiicuCs [©CoXarr^DMiT^j
УДК 616-08;615.9:623.459;615
ВЛИЯНИЕ ВЫСОКООЧИЩЕННОЙ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, КОНЪЮГИРОВАННОЙ С КОЛЛОИДНЫМ ЗОЛОТОМ, НА АКТИВНОСТЬ В-ЭСТЕРАЗ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ДИИЗОПРОПИЛФТОРФОСФАТА
Ю.И. Великородная1, В.А. Антонов1, А.Я. Почепцов1, И.А. Дворяшина1,2
ФГУП «Научно-исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии» Федерального медико-биологического агентства;
2ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии
Было изучено применение иммобилизованной на наночастицах бутирилхолинэстеразы в качестве средства профилактики при остром отравлении высокотоксичным фосфорорганическими соединениями в дозе, равной ЛД50, в опытах in vivo. Введение препарата за 24 часа до воздействия диизопропилфторфосфата предупреждало развитие симптомов острой интоксикации и защищало мышей от гибели. Кроме того, профилактическое введение препарата бутирилхолинэстеразы, конъюгированной с коллоидным золотом, достоверно замедляло падение активности бутирилхолинэстеразы и ацетилхолинэстеразы в плазме крови и оказывало протективное воздействие на холинэстеразы в головном мозге.
Ключевые слова: холинэстеразы, высокоочищенная холинэстераза, коллоидное золото, фосфорорганическое соединение, профилактика.
DOI 10.19163/1994-9480-2019-4(72)-69-72
EFFECT OF HUMAN HIGHLY PURIFIED BUTIRYLHOLINESTERASE OF CONJUGATED WITH COLLOID GOLD ON B-ESTERASE ACTIVITY AFTER EXPOSURE BY DIISOPROPYL FLUOROPHOSPHATE
Yu.I. Velikorodnaya1, V.A. Antonov1, A.Ja. Pocheptsov1, I.A. Dvoryashina12
1
FSUE «Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology» of the Federal Medical and Biological Agency;
2FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation,
Department of histology, embryology, cytology
The use of butyrylcholinesterase immobilized on nanoparticles as a means of preventing acute poisoning with highly toxic organophosphates at a dose LD50 in experiments in vivo was studied. Entering of the drug 24 hours before exposure to diisopropyl fluorophosphate prevented the development of symptoms of acute intoxication and protected mice from death. In addition, the prophylactic administration of butyrylcholinesterase conjugated to colloidal gold significantly slowed the decrease in the activity of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase in the blood plasma and had a protective effect on cholinesterase in the brain.
Key words: cholinesterase, highly purified cholinesterase, colloidal gold, organophosphorus compound, prevention.
Холинэстеразы и карбоксилэстераза относятся к группе В-эстераз - серинового надсемейства эсте-раз, которые ингибируются фосфорорганическими соединениями (ФОС) [7]. К настоящему времени разработаны 4 вида антидотов, имеющих собственные механизмы защиты эстераз: антагонисты ацетил-холина (атропин), реактиваторы (оксимы), обратимые ингибиторы холинэстераз (гетероциклические соединения) и антиконвульсанты. Однако каждый из них не обладает универсальным действием по отношению к токсикантам и не может служить в качестве профилактического средства.
На данном этапе одним из наиболее перспективных препаратов, обладающих антитоксическим действием в отношении ФОС, признана сывороточная бутирилхолинэстераза (БХЭ), благодаря способности «перехватывать» токсиканты до того, как они достигнут холинэргических синапсов [9]. Однако для стехиометрической нейтрализации ФОс необходимо введение значительных количеств фермента, например, около 3-4 мг высокоочищенной
БХЭ на кг веса пациента, чтобы противодействовать нескольким LD5o ФОС [11]. Ввиду этого возникла идея модифицировать фермент таким образом, чтобы он мог инактивировать несколько молекул ФОС, что существенно повысило бы его эффективность.
Одним из способов увеличения активности фермента при одновременном сохранении его каталитических свойств является иммобилизация белка на инертном носителе, в качестве которого могут выступать наночастицы золота. В предыдущих работах нами было продемонстрировано, что конъюгация БХЭ с коллоидным золотом (КЗ) увеличивала каталитическую активность фермента [10] и удлиняла время его циркуляции в крови по сравнению с нативной формой БХЭ [1].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучение высокоочищенной бутирилхолин-эстеразы, иммобилизованной на наноразмерных частицах золота в качестве средства профилактики
при остром отравлении высокотоксичными ФОС в опытах in vivo.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Высокоочищенную бутирилхолинэстеразу (воБХЭ) выделяли из плазмы человека по усовершенствованной методике, включающей препаративную анионную и аффинную хроматографии, после которых на выходе получали фермент, содержащий минимум балластных веществ. Основные этапы выделения и иммобилизация воБХЭ на 15 нм коллоидном золоте были описаны нами в работе [1]. В результате, активность конъюгата воБХЭ с КЗ (воБХЭ-КЗ) оказалась на 23 % выше по сравнению с нативной формой фермента.
Эксперимент по изучению профилактических свойств иммобилизованной формы воБХЭ проводился на белых беспородных мышах-самцах весом 30-35 г. Исследования проводились в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных. Мышей содержали в помещениях с искусственным освещением (8.00 -20.00 ч. - свет, 20.00 - 8.00 ч. - темнота) при 2022 °С в условиях свободного доступа к воде и пище.
В качестве токсического агента использовали диизопропилфторфосфат (ДИПФ) (Sigma), относящийся к группе веществ I класса опасности и обладающий выраженным антихолинэстеразным действием. Для уточнения параметров острой токсичности имеющегося в наличии реактива пользовались методом пробит-анализа по Финни. Была определена ЛД50 ДИПФ, которая составила 1,8 мг/кг (при t > 0,95).
В эксперименте были задействованы 3 группы животных по 12 особей в каждой. I группа - контрольная. Животным на всех этапах эксперимента вводили физраствор. II группа - животным вводили дозу препарата воБХЭ-КЗ по 1 мл внутрибрюшинно с каталитической активностью фермента 1 Ед. Через 24 часа животным этой группы внутримышечно вводили ДИПФ в дозе, равной ЛД50. III группа -животным вводили по 1 мл физраствора внутри-брюшинно, затем через 24 часа ДИПФ в дозе, равной ЛД50.
Через 24 часа после введения ДИПФ у животных контрольных и подопытных групп отбирали кровь из подъязычной вены в пробирки, обработанные гепарином, и центрифугировали при 5000 об./мин в течение 20 мин, полученную плазму переливали в пробирки Эппендорфа. Все биохимические реакции проводили в течение 24 часов после забора крови.
После декапитации животных производили забор образцов тканей печени и головного мозга, которые гомогенизировали на льду в лизирующем Трис-HCl буфере (0,1 М, pH 7,8, 1% Triton X-100, 2 mM ЭДТА). Затем гомогенаты центрифугировали (х9000 g) при 4 °С в течение 20 мин и в надосадоч-ной жидкости определяли активность эстераз.
Определение активности АХЭ и БХЭ в плазме крови и гомогенатах производилось по оригинальному методу Ellman [8], адаптированному для планшетного фотометра SYNERGY HTX (BioTek) и 48-луночных планшетов. В качестве субстрата для АХЭ использовали 0,5 мМ ацетилтиохолин-йодид (Sigma), для БХЭ - 5 мМоль бутирилтио-холинйодид (Sigma).
Активность карбоксилэстеразы (КЭ) определяли методом Ecobichon с применением а-нафтил-ацетата в качестве субстрата [5]. Реакционная смесь состояла из 560 мкл лизирующего буфера, 40 мкл стокового раствора 5 мМ а-нафтилацетата в абсолютном спирте и 20 мкл образца плазмы/ гомогената. Изменение оптической плотности (А) при длине волны 322 нм измеряли с помощью планшетного фотометра SYNERGY HTX (BioTek) каждые 15 секунд в течение 2 минут и рассчитывали ДА/мин. Активность КЭ рассчитывали по молярному коэффициенту абсорбции а-нафтола при 322 нм (2*10-3 М*см-1) и выражали в виде нмоль/мин*мл плазмы или мг ткани.
Все биохимические реакции ставились в троекратных повторах при 37 °С. Затем для каждого отдельного случая определялось среднее значение, которое и использовалось для статистических расчетов.
Статистический анализ проводили в программе «Statistika 7.0». Рассчитывались параметры среднего арифметического значения (М) и стандартного отклонения (SD). Сравнения между группами проводили с помощью непараметрического анализа с использованием U критерия Манна - Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе мониторинга за состоянием подопытных животных после введения ДИПФ у мышей III подопытной группы наблюдали симптомы, характерные для действия большинства высокотоксичных ФОС. Через 10-15 минут после введения токсиканта отмечали последовательное развитие гиподинамии, тонических и клонических судорог двигательной мускулатуры, гиперсаливацию, затруднение дыхания вследствие паралича диафрагмы и дыхательных мышц. На высоте развития этих симптомов 3 мыши погибли в срок от 2 до 3 часов. У животных II группы, которым в качестве средства профилактики вводили воБХЭ-КЗ, выживаемость составила 100 %, а наблюдаемые симптомы интоксикации были смазаны и непродолжительны.
Изучение активности холинэстераз в плазме крови экспериментальных животных через 24 часа после введения ФОС показало, что введение иммобилизованной формы воБХЭ оказывало з ам е тное защитное воздействие на эндогенные холинэстеразы. Как видно из представленной табл., после воздействия ДИПФ активность БХЭ и АХЭ в плазме крови снижалась в 6 и 3,4 раза
[©C^C^TJTiilCUCS [©CoXrirr^DMiT^j
соответственно, а профилактическое введение препарата воБХЭ-КЗ достоверно замедляло падение до 3,5 и 2,7 раза соответственно.
Изменение активности исследуемых эстераз в плазме крови и гомогенатах тканей у мышей после воздействия ДИПФ (М ± SD)
При сравнении активности эритроцитарной формы АХЭ между II и III экспериментальными группами также прослеживалась положительная тенденция в сохранении активности фермента после п рофилактического введения препарата воБХЭ-КЗ, хотя эти данные и не были статически значимыми.
Анализ тканевых форм холинэстераз у мышей контрольной и экспериментальных групп выявил определенные закономерности в активности БХЭ и АХЭ. Так, после воздействия ДИПФ без профилактического введения воБХЭ-КЗ у мышей снижалась активность БХЭ и АХЭ в продолговатом мозге, а также АХЭ в коре больших полушарий. Введение же воБХЭ, конъюгированной с КЗ, поддерживало активность БХЭ в головном мозге, но для поддержания активности АХЭ в нервной ткани такого количества препарата оказалось недостаточно.
Сравнение активности КЭ в опытных группах животных и контроле показало одинаковое снижение фермента в плазме крови и ткани печени после воздействия ДИПФ, однако профилактическое введение препарата воБХЭ-КЗ положительно влияло на активности КЭ в тканях головного мозга.
Различные виды БХЭ (лошадиная, свиная, человеческая, рекомбинантная) достаточно давно используются для предотвращения и лечения последствий, связанных с воздействием высокотоксичных ФОС. Однако, как уже отмечалось выше, для достижения нужной эффективности необходимо вводить большие дозы чужеродного белка, что может негативно сказаться на иммунной системе, особенно если речь идет о «нечеловеческой» БХЭ. Иммобилизация воБХЭ на наночастицах золота, как можно увидеть из представленных результатов исследования, помогает даже при использовании небольшого количества препарата достигать значительных результатов. Кроме того, при изучении биологических свойств золотых наночастиц было обнаружено, что они сами способны выступать в роли искусственного фермента (artificial enzyme), выполняющего, в числе прочих, и функцию эстераз [6].
Несмотря на то, что данное количество вводимого препарата воБХЭ, конъюгированной с КЗ, не способно полностью защищать АХЭ в головном мозге, это казалось некритично для выживания животных. Согласно последним данным БХЭ может выступает в качестве «резервного» фермента при недостаточной активности АХЭ, а совместная локализация АХЭ и БХЭ в холинергических нейронах указывает на потенциальную взаимосвязь между их действиями [2].
Помимо синергетического влияния на АХЭ, эндогенная воБХЭ способна положительно регулировать и активность КЭ в головном мозге, но не в плазме крови и ткани печени. Скорее всего, такой выборочный эффект обусловлен разницей изо-форм, представленных в органах. В печени КЭ представлена в основном двумя изоформами: CES1 и CES2, которые вовлечены в процессы
Исследуемый объект, ед. измерения Группа животных
Эсте-разы I контроль (n = 12) II ДИПФ (n = 9) III КЗБХЭ+ДИПФ (n = 12)
Плазма крови, мкмоль/мин* мл 1,429 ± 0,687 0,237 ± 0,134* р = 0,000032 0,405 ± 0,044*f *р = 0,000032 tр = 0,0046
Печень, нмоль/мин* мг ткани 1,37 ± 0,42 1,113 ± 0,336 1,212 ± 0,124
БХЭ Кора больших полушарий, нмоль/мин* мг ткани 0,252 ± 0,089 0,236 ± 0,033 0,228 ± 0,015
Продолговатый мозг, нмоль/мин* мг ткани 0,289 ± 4,877 0,249 ± 0,027* р = 0,004918 0,261 ± 0,040
Плазма крови, нмоль/ мин*мл 25,653 ± 5,341 7,519 ± 2,215* р = 0,000032 9,639 ± 2,323*t *р = 0,000034 tр = 0,0376
Эритроциты, мкмоль/мин* 106Ег 3,04 ± 0,54 0,347 ± 0,314* р = 0,000028 0,570 ± 0,271* р = 0,000032
АХЭ Печень, нмоль/мин* мг ткани 0,480 ± 0,317 0,463 ± 0,093 0,467 ± 0,058
Кора больших полушарий, нмоль/мин* 2,088 ± 0,715 0,486 ± 0,076* р = 0,000032 0,472 ± 0,021* р = 0,000031
мг ткани
Продолговатый мозг, нмоль/мин* мг ткани 3,213 ± 13,115 0,831 ± 0,110* р = 0,000032 0,913 ± 0,112* р = 0,000032
Плазма крови, мкмоль/ мин*мл 129,427 ± 13,089 69,115 ± 14,002* р = 0,000032 64,688 ± 12,324* р = 0,000032
Печень, нмоль/мин* мг ткани 4,148 ± 0,465 2,560 ± 0,775* р = 0,000053 2,490 ± 0,368* р = 0,000032
КЭ Кора больших полушарий, нмоль/мин* мг ткани 0,150 ± 0,095 0,127 ± 0,032 0,157 ± 0,037t р = 0,0465
Продолговатый мозг, нмоль/мин* мг ткани 0,168 ± 0,043 0,115 ± 0,043* р = 0,000854 0,177 ± 0,078t р = 0,0165
Статистически значимые различия по сравнению с *контролем, "'между экспериментальными группами.
детоксикации и участвуют в липидном обмене [4]. В нервной ткани млекопитающих обнаружены другие изоформы КЭ: CES3 и CES3L, которые у мышей экспрессируются во всех отделах головного мозга и также выступают в качестве защитного фактора нервных клеток по отношению к токсическим веществам [3].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что профилактическое введение даже минимальных доз высокоочищенной бутирил-холинэстеразы, конъюгированной с коллоидным золотом, оказывает профилактическое воздействие, в первую очередь, на холинэстеразы плазмы крови, которые первыми оказываются на пути ФОС, тем самым снижая токсическую нагрузку на БХЭ и АХЭ головного мозга.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Соколов О.И., Селиванов Н.Ю., Селиванова О.Г. и др. / Sokolov O.I., Selivanov N.Ju., Selivanova O.G. i dr. Сравнительный анализ каталитической активности высокоочищенной бутирилхолинэстеразы человека в нативной и конъюгированной с наночастицами золота формах в опытах in vivo / Sravnitel'nyj analiz kataliti-cheskoj aktivnosti vysokoochishhennoj butirilholinjesterazy cheloveka v nativnoj i konjugirovannoj s nanochasticami zolota formah v opytah in vivo [Comparative analysis of the catalytic activity of highly purified human butyrylcholin-esterase in native and gold nanoparticle conjugated forms in vivo experiments] // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета / Vestnik Vol-gogradskogo gosudarstvennogo medicinskogo universiteta [Journal of Volgograd State Medical University]. - 2017. -Т. 64, № 4. - С. 90-95.
2. Darvesh S., Hopkins D.A. Differential distribution of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase in the human thalamus // J. Comp. Neurol. - 2003. - Vol. 463, № 1. -P. 25-43.
3. Holmes R.S., Cox L.A., VandeBerg J.L. // Genetica. -2010. - Vol. 138, № 7. - P. 695-708.
4. Hosokawa M. Structure and catalytic properties of carboxylesterase isozymes involved in metabolic activation of prodrugs // Molecules. - 2008. Vol. 13, № 2. - P. 412-431.
5. Karanth S., Pope C. Carboxylesterase and a-esterase activities during maturation and aging: relationship to the toxicity of chlorpyrifos and parathion in rats // Toxicol Sci. - 2000. - Vol. 58, № 2. - P. 282-289.
6. Lin Y., Ren J., Qu X. Nano-gold as artificial enzymes: hidden talents // Adv. Mater. - 2014. - Vol. 26, № 25. -P. 4200-4217.
7. Montella I.R., Schama R., Valle D. The classification of esterases: an important gene family involved in insecticide resistance - a review // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. - 2012. -Vol. 107, № 4. - P. 437-449.
8. Reiner E., Sinko G., Skrinjaric-Spoljar M., SimeonRudolf V. Comparison of protocols for measuring activities of human blood cholinesterases by the Ellman method // Arh. Hig. Rada Toksikol. - 2000. - Vol. 51, № 1. - P. 13-18.
9. Saxena A., Sun W., Fedorko J.M., et al. Prophylaxis with human serum butyrylcholinesterase protects guinea pigs exposed to multiple lethal doses of soman or VX // Biochemical Pharmacology. - 2011. - Vol. 81. - P. 164-169.
10. Sokolov O.I., Selivanov N.Y., Bogatyrev V.A., et al. A new selective inhibitor of mouse blood plasma carboxy-lesterase // Reports of Biochemistry and Biophysics. -2016. - Vol. 468, № 1. - P. 232-234.
11. Sun W., Luo C., Tipparaju P., et al. Effect of polyethylene glycol conjugation on the circulatory stability of plasma-derived human butyrylcholinesterase in mice // Chemico-Biological Interactions. - 2013. - Vol. 203, № 1. -P. 172-176.
Контактная информация
Великородная Юлия Ивановна - зав. лабораторией патоморфологии, ФГУП Научно-
исследовательский институт гигиены, токсикологии и профпатологии ФМБА России, e-mail: [email protected]
