CC BY
12УДК 57.04 :575.8
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АТРОПИНА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ACHE И BCHE ПРИ ОТРАВЛЕНИИ КРЫС МАЛАТИОНОМ
А.В. Бабкин1, И.С. Бердинских1, Н.С. Осечкина2, Г.В. Назаров1, М.А. Юдин1, В.Н. Быков1
Научно-исследовательский испытательный институт (военной медицины) Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация 2Федеральное государственное учреждение науки «Институт Токсикологии» Федерального медико-биологического агентства России, 192019, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация
На модели отравления крыс малатионом в дозе 1 ЛД50 охарактеризована экспрессия генов Ache и Bche в образцах тканей на фоне лечения атропином. Отравление малатионом вызывает достоверное снижение относительного уровня экспрессии генов Ache и Bche в головном мозге и печени. Уменьшение экспрессии исследованных генов составило более 50 % и сохранялось на этом уровне в течение 14 суток. Установлено, что лечение атропином оказывает протективное действие к снижению уровня экспрессии в головном мозге. Полученные данные указывают на взаимосвязь эффективности лечения с показателями экспрессии изучаемых генов.
Ключевые слова: экспрессия гена, ген Ache, ген Bche, малатион, атропин.
Введение. До настоящего времени оценка активности холинэстеразы (ХЭ) остается наиболее точным критерием диагностики поражения фос-форорганическими соединениями (ФОС) по степени тяжести, а также показателем адекватности проведения терапии. Малатион используется в качестве модельного ФОС при экспериментальном исследовании динамики развития интоксикации и эффективности проводимой терапии [1].
Показано, что различный эстеразный статус определяет устойчивость организма к воздействию ФОС и, в том числе малатиона [2]. Так значительная активность бутирилхолинэстеразы (БХЭ) в плазме крови мышей обусловливает более высокую резистентность животных данного вида к отравлению ФОС, по сравнению с крысами [3]. Несоответствие профиля ферментативной активности у обезьян и человека завышает параметры защитной эффективности и лечебного эффекта препаратов при экстраполяции результатов на человека [4].
С угнетением ацетилхолинэстеразы (АХЭ) связывают нарушения нервно-мышечной передачи и развитие холинопозитивной симптоматики при поражении ФОС. В тоже время первичный контакт токсиканта при попадании в организм происходит с БХЭ плазмы крови [5]. Данное обстоятельство указывает на необходимость исследования активности обоих ферментов при диагностике отравлений ФОС.
Помимо эстеразного статуса, устойчивость к воздействию ФОС может быть обусловлена уровнем экспрессии целевых генов в постинтоксикационном периоде отравлений. Известно, что ферментативная активность ХЭ определяется молекулярно-генетическими особенностями, в том числе уровнем экспрессии генов Ache и Bche, кодирующих АХЭ (шифр фермента КФ 3.1.1.7) и БХЭ (шифр фермента КФ 3.1.1.8). Анализ информационных источников показал, что к настоящему времени недостаточно полно рассмотрена динамика изменения экспрессии генов Ache и Bche
Бабкин Александр Владимирович (Babkin Aleksandr Vladimirovich), научный сотрудник НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация, babkinnik@yandex.ru
Бердинских Ирина Сергеевна (Berdinskih Irina Sergeevna), научный сотрудник НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация , irina_berdinskih@mail.ru.
Осечкина Наталья Сергеевна (Osechkina Natalya Sergeevna), научный сотрудник ФГУН «Институт Токсикологии» ФМБА России, 192019, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация, dunats@rambler.ru.
Назаров Георгий Валерьевич (Nazarov Georgiy Valerevich), доктор химических наук, доцент, начальник отдела НИИИ ВМ ВМедА им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации, 195043, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация, denis-100@list.ru. Юдин Михаил Анатольевич (Yudin Mikhail Anatol'evich), кандидат медицинских наук, доцент, заместитель начальника отдела НИИИ (ВМ) ВМедА им. С.М. Кирова, 195043, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация, mikhail.judin@gmail.com.
Быков Владимир Николаевич (Bykov Vladimir Nikolaevich), доктор медицинских наук, профессор, начальник НИИЦ (МБЗ) НИИИ (ВМ) ВМедА им. С.М. Кирова, 195043, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация, bykov_imm@yahoo.com.
Токсикологический вестник №Ô (135)
на экспериментальных моделях отравления животных некоторыми ФОС [6, 7, 8]. Также отсутствует информация о характере влияния мала-тиона на уровень экспрессии генов Ache и Bche в постинтоксикационном периоде, остаются не исследованными особенности экспрессии рассматриваемых генов на фоне терапии.
Цель данного исследования - изучение влияния атропина на экспрессию генов Ache и Bche в образцах тканей крыс на фоне отравления мала-тионом.
Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздрав-соцразвития России от 23 августа 2010 г № 708 н) на белых нелинейных крысах-самцах массой 180240 г, содержавшихся в условиях вивария (питомник «Рапполово», Ленинградская область). За 12 ч до начала эксперимента животных лишали доступа к пище. Для моделирования отравления животным однократно внутрижелудочно (в/ж) вводили малатион в дозе 1 ЛД50 (410 мг/кг). В качестве антидота отравлений ФОС животным вводили атропин в дозе 2 мг/кг [9]. Животным без лечения вводили стерильную воду для инъекций из расчета 1 мл/кг. Наблюдение за животными согласно «Руководства...» осуществляли в течение 14 суток [9].
Тотальную РНК для анализа экспрессии выделяли из образцов головного мозга, печени и крови крыс с использованием автоматической станции «NorDiag Arrow» (Швеция). Выделенную РНК переводили в кДНК по протоколу High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems (США).
Экспрессию генов Ache и Bche в образцах тканей крыс оценивали через 1, 7 и 14 суток после введения малатиона в дозе 1 ЛД50 методом ПЦР-РВ, по отношению к гену-рефери 18s-rRNA на амплификаторе «7900HT Fast Real-Time PCR System», Applied Biosystems (США), с использованием тест-систем Applied Biosystems (Rn00596883_m1 и Rn00576087_m1). Термоциклирование осуществляли по следующей программе: 50°С - 120 секунд - 1 цикл; 95°С - 600 секунд - 1 цикл; (95°С - 15 секунд, 60°С - 60 секунд) - 45 циклов.
Относительный уровень экспрессии генов (УЭ, %) определяли по формуле [10]:
УЭ = количество мРНк определяемого гена / количество мРНК гена 18s-rRNA 100%
Статистическую обработку результатов производили в программе Statistica 8.0 с использованием критерия Крускала-Уоллиса.
Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований у всех экспериментальных животных не было выявлено экспрессии генов Ache и Bche в образцах крови, в то же время установлен значимый уровень экспрессии указанных
генов в образцах головного мозга и печени.
УЭ генов Ache и Bche в головном мозге крыс до (интактные) и через 1, 7 и 14 суток после отравления малатионом в дозе 1 ЛД50 (с лечением атропином (опыт) и без лечения (контроль)) показаны на рисунке 1.
Анализ результатов (рис. 1, а) показал, что у животных контрольной группы через 1, 7 и 14 суток после отравления малатионом в дозе 1 ЛД50 выявлено достоверное снижение УЭ гена Ache в головном мозге.
У крыс, получавших лечение атропином 2 мг/кг, изменения УЭ гена Ache через 1, 7 и 14 суток после отравления малатионом достоверно (р<0,05) не отличались от интактной группы.
Установлено, что УЭ гена Bche в головном мозге интактных крыс превышает показатель экспрессии гена Ache в 2,8 раза. По этому показателю характерен широкий разброс внутри одной популяции крыс (рис.1, б).
При исследовании УЭ гена Bche в головном мозге крыс выявлено достоверное снижение ее в среднем в 1,5-2 раза после отравления малатио-ном в дозе 1 ЛД50. В этой группе снижение уровня экспрессии прослеживалось на протяжении всего срока наблюдения.
Применение атропина оказывало положительное влияние на УЭ Bche в головном мозге. Несмотря на существенное снижение показателя через 1 сутки после отравления малатионом в дальнейшие сроки отмечали восстановление экспрессии (7 сутки) и ее рост в 1,5 раза (14 сутки) по сравнению с интактными животными. Через 14 суток после начала эксперимента экспрессия Bche в головном мозге на фоне введения атропина была достоверно (р<0,05) выше, чем у не леченных животных.
УЭ генов Ache и Bche в печени крыс до (интакт-ные) и через 1, 7 и 14 суток после отравления ма-латионом в дозе 1 ЛД50 (с лечением атропином (опыт) и без лечения (контроль)) показаны на рисунке 2.
У крыс через 1, 7 и 14 суток после отравления малатионом в дозе 1 ЛД50, независимо от того вводился атропин или нет, выявляли достоверное снижение УЭ гена Ache в печени (рис. 2, а). Уменьшение уровня экспрессии данного гена в печени составило около 50 % и сохранялось на протяжении всего срока регистрации показателей.
Схожие результаты наблюдались и при анализе экспрессии гена Bche в печени крыс (рис. 2, б). Установлено, что у крыс контрольной группы (без лечения атропином) через 1, 7 и 14 сутки после введения малатиона в дозе 1 ЛД50 выявляли статистически значимое снижение УЭ гена Bche в печени. Уменьшение УЭ данного гена составило более 70 % и сохранялось на протяжении все-
го срока регистрации показателей. Применение атропина компенсировало снижение УЭ гена Bche в печени через 1 сутки после введения токсиканта. Через 7 и 14 суток после введения ма-латиона у опытных животных также выявляли снижение УЭ гена Bche.
Из результатов настоящего исследования можно заключить, что у животных после отравления малатионом выявлено достоверное снижение УЭ гена Ache и Bche в головном мозге и печени. Максимум снижения в 3 раза отмечен по окончании 1 суток интоксикации для экспрессии гена Ache. В отношении экспрессии гена Bche снижение относительно интакных значений составило 1,5-2 раза. Установлено, что УЭ гена Bche интактных
крыс превышает показатель экспрессии гена Ache около 3 раз. Снижение экспрессии указанных выше генов при отравлении малатионом, вероятно, может объясняться его влиянием на транскрипционный аппарат клетки, функциональная активность которого в печени выше, чем в других органах [11,12]. Малатион, действуя как «негативный» регулятор транскрипции генов Ache и Bche, может приводить к терминации данного процесса и, как следствие, к снижению уровня мРНК.
На фоне терапии атропином 2 мг/кг изменения экспрессии генов Ache и Bche в головном мозге крыс через 1, 7 и 14 суток после отравления мала-тионом от интактной группы достоверно не от-
Рис. 1 - Относительный уровень экспрессии генов Ache (а) и Bche (б) в головном мозге крыс после применения атропина на фоне отравления малатионом, Медиана (25; 75 перцентиль)
Примечание: * - значимое (p<0,05) различие с группой «интактные»; # - значимое (p<0,05) различие групп: «опыт» и «контроль»; n - количество животных в группе
Токсикологический вестник №б (135)
личались. Атропин не влиял на уровень экспрессии гена Аche в печени. Уменьшение УЭ данного гена составило до 70 % и сохранялось на этом уровне на протяжении всего срока регистрации показателей. Схожие результаты наблюдались и при анализе экспрессии гена Bche в печени крыс. Однако применение атропина компенсировало снижение УЭ гена Bche в печени только через 1 сутки после введения токсиканта. Через 7 и 14 суток после введения малатиона у опытных животных наблюдалось снижение УЭ гена Bche. Выявленная закономерность может объясняться «позитивным» влиянием атропина на регуля-торные элементы генов Ache и Bche (промоторы, энхансеры) и факторы транскрипции, которые
инициируют процесс транскрипции и приводит к наработке и увеличению мРНК в клетке [13].
Полученные данные указывают на способность атропина предупреждать резкое снижение экспрессии генов Ache и Bche в головном мозге в острый период отравления и указывают на целесообразность учета УЭ при разработке перспективных средств терапии отравлений ФОС. Вместе с тем, знания об уровне экспрессии генов Ache и Bche могут быть использованы при определении критериев оценки эффективности терапии и построения прогноза исхода интоксикации.
Заключение. Таким образом, в результате проведенного исследования изучено влияние атропина на уровень экспрессии генов Аche и bche на
Рис. 2 - Относительный уровень экспрессии генов Ache (а) и Bche (б) в печени крыс после применения атропина на фоне отравления малатионом, Медиана (25; 75 перцентиль)
Примечание: * - значимое (p<0,05) различие с группой «интактные»; # - значимое (p<0,05) различие групп: «опыт» и «контроль»; n - количество животных в группе
фоне отравления крыс малатионом. При отравлении крыс малатионом выявлено достоверное снижение УЭ гена Ache и Bche в головном мозге и печени. Установлено, что применение атропина препятствует снижению УЭ генов Ache и Bche в головном мозге крыс через 1, 7 и 14 суток после отравления малатионом и предупреждает
снижение УЭ гена Bche в печени у животных через 1 сутки интоксикации. Показатели уровней экспрессии изучаемых генов возможно использовать при оценке и прогнозировании эффективности перспективных средств лечения отравлений ФОС (реактиваторы ХЭ, гепатотропные препараты и т.д.).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Шилов В.В. и др. Изучение эффективности лекарственных средств на модели экспериментальной нейропатии при отравлении малатионом.// Медицина труда и промышленная токсикология. 2013; 8: 13-18.
2. AurbekN. Suitability of human butyrylcholinesterase as therapeutic marker and pseudocatalytic scavenger inorganophosphate poisoning: A kinetic analysis. Toxicology. 2009; 259: 133-139.
3. Naik R.S. et al. Development and validation of a simple assay for the determination of cholinesterase activity
in whole blood of laboratory animals.// J. Appl. Toxicol. 2013; 33 (4): 290-300.
4. BaharF.G. et al. Species difference of
REFERENCES:
1. Shilov V.V. et al. Study of the effectiveness of drugs in experimental models of poisoning neuropathy in malathion. //Occupational medicine and industrial ecology. 2013; 8: 13-18 (in Russian).
2. Aurbek N. Suitability of human butyrylcholinesterase as therapeutic marker and pseudocatalytic scavenger inorganophosphate poisoning: A kinetic analysis. //Toxicology. 2009; 259: 133-139.
3. Naik R.S. et al. Development and validation of a simple assay for the determination of cholinesterase activity
in whole blood of laboratory animals.// J. Appl. Toxicol. 2013; 33 (4): 290-300.
esterase expression and hydrolase activity in plasma.// J. Pharm. Sci. 2012; 101 (10): 3979-3988.
5. BajgarJ. et al. Changes of cholinesterase activities in the rat blood and brain after sarin intoxication pretreated with butyrylcholinesterase. //Drug. Chem. Toxicol. 2007; 30 (4): 351-359.
6. БабкинА.В. и др. Ассоциация полиморфных вариантов гена Bche с активностью бутирилхолинэстеразы крыс после отравления малатионом. // Токсикологический вестник. 2014; 5: 16-20.
7. Lopez-Granero C. et al. Chlorpyrifos-, diisopropylphosphorofluoridate-, and
4. Bahar F.G. et al. Species difference of esterase expression and hydrolase activity in plasma.// J. Pharm. Sci. 2012; 101 (10): 3979-3988.
5. Bajgar J. et al. Changes of cholinesterase activities in the rat blood and brain after sarin intoxication pretreated with butyrylcholinesterase. Drug. Chem. Toxicol. 2007; 30 (4): 351-3
6. Babkin A.V. et al. Association of Bche gene polymorphic variants with activity of rat butyrylcholinesterase after exposure to malathion.// Toxicological Review. 2014; 5: 16-20 (in Russian).
7. Lopez-Granero C. et al. Chlorpyrifos-, diisopropylphosphorofluoridate-, and parathion-induced behavioral and
parathion-induced behavioral and oxidative stress effects: are they mediated by analogous mechanisms of action. // Toxicol. Sci. 2013; 131 (1): 206-216.
8. Xing, H. et al. Alterations in mRNA expression of acetylcholinesterase in brain and muscle of common carp exposed to atrazine and chlorpyrifos. //Ecotoxicol. Environ. Saf. 2010; 73 (7): 1666-1670.
9. Миронов А.Н. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть М.: Гриф и К; 2012.
10. Осечкина Н.С. и др. Влияние экспрессии и полиморфизма генов, кодирующих ГАМК-рецепторы, на тяжесть депримирующего действия этанола у
oxidative stress effects: are they mediated by analogous mechanisms of action. // Toxicol. Sci. 2013; 131 (1): 206-216.
8. Xing, H. et al. Alterations in mRNA expression of acetylcholinesterase in brain and muscle of common carp exposed to atrazine and chlorpyrifos. //Ecotoxicol. Environ. Saf. 2010; 73 (7): 1666-16
9. MironovA.N. Guidelines for pre-clinical trials of drugs.Part Moscow. 2012 (in Russian).
10. Osechkina N.S. et al. The expression's influence and polymorphism of genes, which encode gaba-receptors, on heft ethanol influence in laboratory rats. // Toxicological Review. 2014; 6: 22-28 (in Russian).
крыс.// Токсикологический вестник. 2014; 6: 22-28.
11. Rhee J. S. et al. Effect of pharmaceuticals exposure on acetylcholinesterase (AchE) activity and on the expression of AchE gene in the monogonont rotifer Brachionuskoreanus. //Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2013; 158 (4): 216-224.
12. Zhen H. Toxic effects of HgCl2 on activities of SOD, AchE and relative expression of SOD, AChE, CYP1A1 of zebrafish.//Ecotoxicology. 2014; 23 (10): 1842-1845.
13. Charoenying T. et al. Effects of paraoxon on neuronal and lymphocytic cholinergic systems. //Toxicol. Pharmacol. 2011; 31 (1): 119-128.
11. Rhee J. S. et al. Effect of pharmaceuticals exposure on acetylcholinesterase (AchE) activity and on the expression of AchE gene in the monogonont rotifer Brachionuskoreanus. //Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2013; 158 (4): 216-224.
12. Zhen H. Toxic effects of HgCl2 on activities of SOD, AchE and relative expression of SOD, AChE, CYP1A1 of zebrafish. //Ecotoxicology. 2014; 23 (10): 1842-1845.
13. Charoenying T. et al. Effects of paraoxon on neuronal and lymphocytic cholinergic systems.//Toxicol. Pharmacol. 2011; 31 (1): 119-128.
A.V Babkin1, I.S. Berdinskih1, N.S. Osechkina2, G.V. Nazarov1, M.A. Yudin1, V.N. Bykov1
A STUDY OF ATROPINE INFLUENCE ON ACHE AND BCHE GENES EXPRESSION IN RATS
EXPOSED TO MALATHION POISONING
Scientific Research Test Institute of Military Medicine of Medical Military Academy named after S.M. Kirov (The Russian Federation Department of Defense), 195043, Saint-Petersburg, Russian Federation
2Federal State Scientific Institution «Institute of Toxicology «Federal Medico-Biological Agency» Russia, 192019, Saint Petersburg, Russian Federation
Levels of expression of Ache and Bche genes in tissue samples were investigated in rats exposed to malathion in dose of 1 LD50 and following atropine treatment. Malathion poisoning causes statistically significant decrease in levels of expression of Ache and Bche genes in brain and liver. The decrease of expression of these genes was greater than 50 % and remained at this level during 14 days. It was shown that atropine treatment prevents decrease in Ache gene expression in brain. These findings suggest the possibility of gene expression level assessment in brain during the screening of promising treatments for OP poisoning.
Keywords: gene expression, gene Ache, gene Bche, malathion, atropine.
Переработанный материал поступил в редакцию 16.09.2015 г.
