АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ С РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ЖЕНЩИН МОСКОВСКОГО РЕГИОНА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Коллектив авторов, 2012 УДК 618.19-006.6-092:612.6.05

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ С РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ЖЕНЩИН МОСКОВСКОГО РЕГИОНА

А.М. Бурденный1, Т.П. Казубская2, доктор медицинских наук, Э.А. Брага3, доктор биологических наук, В.В. Носиков1, доктор биологических наук, В.И. Логинов3, кандидат биологических наук

1ФГБУН«Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН», Москва,

2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва,

3Государственный Научный центр РФ «ГосНИИ генетика», Москва

Е. mail: burdennyy@gmail.com

Изучена ассоциация +/— полиморфных маркеров генов GSTM1, GSTT1 и полиморфного маркера Ile105Val гена GSTP1 с риском развития рака молочной железы (РМЖ) и его гистологических подтипов у женщин Московского региона. Обнаружена ассоциация нулевых генотипов генов GSTT1 и GSTM1, а также генотипов Ile/Val и Val/Val гена GSTP1 с риском развития РМЖ (OR соответственно 1,89; 1,65; 1,47 и 1,33). Кроме того, обнаружена высокодостоверная ассоциация нулевого генотипа гена GSTT1 и генотипов Ile/Val и Val/Val гена GSTP1 с риском развития РМЖ у больных моложе 53 лет (OR соответственно 2,33 и 2,31), а также ассоциация сочетания нулевых генотипов генов GSTT1 и GSTM1 с высоким риском развития РМЖ (OR=3,18). Максимален риск развития РМЖ в случае сочетанного носительства нулевых генотипов генов GSTT1 и GSTM1 и генотипа Val/ Val полиморфного маркера Ile105Val гена GSTP1 (OR=16,42). Полученные результаты свидетельствуют о важной роли генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков, в развитии РМЖ.

Ключевые слова: рак молочной железы, гены глутатион-S-трансфераз, биотрансформация ксенобиотиков, полиморфные маркеры, нулевые генотипы, риск развития заболевания

ASSOCIATION OF POLYMORPHIC MARKERS OF XENOBIOTIC BIOTRANSFORMATION GENES WITH BREAST CANCER IN FEMALES IN MOSCOW REGION A.M. Burdennyy1, T.P. Kazubskaya2, E.A. Braga3, V. V. Nosikov1, V.I. Loginov3

Federal State Budgetary institution of Science «Emanuel Institute of Biochemical Physics of Russian Academy of Sciences»,

2Federal State Budgetary Institution «The N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center» of the Russian Academy of Medical Sciences,

3Federal State Unitary Enterprise «Scientific Center of Russian Federation. Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms»

The association of +/— polymorphic markers of GSTM1 and GSTT1 genes and Ile105Valpolymorphic marker of GSTP1 gene with the risk of development of breast cancer (BC) and its histological subtypes was studied. We have showed an association of null genotypes of GSTT1 and GSTM1 genes and Ile/Val and Val/Val genotypes of GSTP1 gene with BC (OR = 1.89, 1.65, 1.47 and 1,33, respectively). We have also found the highly significant association of the null genotype of GSTT1 gene and Ile/Val and Val/Val genotypes of GSTP1 gene with BC in patients with disease manifestation at the age less than 53 years (OR = 2.33, 2.07 and 2.31, respectively). A strong association with BC in group of carriers of both null genotypes of GSTT1 and GSTM1 genes have been found also (OR = 3.18). The maximal risk of development of breast cancer occurs in case of combined carriage of three genotype combination (both null genotypes of GSTT1 and GSTM1 genes and Val/Val genotype of GSTP1 gene (OR = 16.42). The results of our study are the evidence that genes encoding xenobiotic biotransformation enzymes play an important role in the development of breast cancer in females residing in Moscow region.

Key words: breast cancer, glutathione-S-transferase genes, biotransformation of xenobiotics, polymorphic markers, risk of disease

ВВЕДЕНИЕ

Злокачественные заболевания молочных желез занимают в структуре онкологических заболеваний 2-е место. Ежегодно диагноз рака молочной железы (РМЖ) ставят приблизительно 1 млн человек на

планете, и это только официальные данные [13]. В России ежегодно от РМЖ погибают более 3 тыс. женщин (т.е. более 17% всех умерших от злокачественных опухолей). В разных географических регионах у женщин ежегодно регистрируется от 25,2

до 99,6 новых случаев РМЖ на 100 тыс. человек в год [3].

Как и другая онкологическая патология, РМЖ является многофакторным заболеванием, т.е. в его патогенезе важную роль наряду с онкогенами и генами опухолевой супрессии играют так называемые гены-модификаторы, эффект которых во многом определяется средовыми факторами [1, 5]. Особый интерес среди них представляют гены, ответственные за биотрансформацию поступающих в организм чужеродных веществ (химических, биологических, лекарственных препаратов). Способность адаптироваться к повреждающим внешним факторам определяется генетически запрограммированной системой биотрансформации индивидуума [4, 12].

Гены GSTT1, GSTM1 и GSTP1 кодируют различные типы глутатион-Б-трансфераз — Т1, М1 и Р1. Глутатион-Б-трансферазы активно участвуют в детоксикации ряда ксенобиотиков путем их связывания с глутатионом и играют ключевую роль в обеспечении устойчивости клеток к перекисному окислению липидов, свободным радикалам, ал-килированию белков и предотвращению поломок ДНК.

У носителей нулевых генотипов генов GSTM1 и GSTT1 кодирующие последовательности генов нарушены из-за длинных делеций и синтез глутатион-S-трансфераз Т1 и М1 отсутствует. У носителей аллеля Val полиморфного маркера Ile105Val гена GSTP1 определяется пониженная концентрация соответствующего фермента в клетках. Вследствие этого у носителей нулевых генотипов генов GSTM1 и GSTT1 и аллеля Val гена GSTP1 наблюдается повышенная концентрация токсичных метаболитов в клетках [5, 7].

В ряде популяций показано, что полиморфные маркеры генов GSTM1, GSTT1, GSTP1 ассоциированы с риском развития РМЖ [11, 13 15]. У русских женщин с РМЖ такие исследования до настоящего времени не проводились. Таким образом, изучение роли генетических факторов предрасположенности к злокачественной транс -формации может послужить основой для создания современных моделей РМЖ, а также для разработки новых методов профилактики в группах риска и лечения больных с различными гистологическими типами РМЖ.

Целью исследования было изучение ассоциации полиморфных маркеров +/— генов GSTM1 и GSTT1 и полиморфного маркера Ile105Val гена GSTP1 с различными гистологическими типами РМЖ, а также со стадией развития опухоли и возрастом больных. Кроме того, необходимо было определить частоту встречаемости сочетанных генотипов изученных полиморфных маркеров и их ассоциацию с РМЖ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на образцах крови жителей Москвы и близлежащих населенных пунктов. В работу включено 140 больных РМЖ (средний возраст — 53 + 12 лет), не получавших до взятия крови лучевую или химиотерапию. В качестве популя-ционного контроля использовали сопоставимую по возрасту выборку онкологически здоровых женщин (п=138) Московского региона европеоидного происхождения, поскольку существуют значительные межрасовые различия в распределении исследуемых генотипов и аллелей [2]. Диагноз и гистологическую форму РМЖ устанавливали на основании гистологического исследования в Российском онкологическом научном центре РАМН Москвы. Выборка больных включала 30 пациентов с инфильтративно-дольковым РМЖ (РМЖ ) и 106 — с инфильтративно-протоковым РМЖ (РМЖ ).

GSTT1, 480 bp

GSTP1, 197 bp GSTP1, 180 bp

Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК генов GSTM1, GSTT1 (а) и GSTP1 (б) у больных РМЖ:

а: 1 — отрицательный контроль (dd-вода); 2, 3,

4 — комбинированные сочетания GSTM1(+/+)/ GSTT1(+/+); GSTM1(+/+)/GSTT1(—/—); GSTM1(-/—)/GSTT1(+/+); 5 — образец здоровой ткани: комбинированное сочетание GSTM1(+/+)/GSTT1(+/+);

6 — контрольная проба (альбумин); 7 — маркер молекулярной массы 100 н.п.; б: 1 — отрицательный контроль (dd-вода); 2 — генотип Ile/Val гена GSTP1; 3 — генотип Ile/Ile гена GSTP1; 4 — генотип Val/Val гена GSTP1;

5 — маркер молекулярной массы 50 н.п.; 6 — образец здоровой ткани: генотип Ile/Val гена GSTP1.

Для исследования ассоциации полиморфных маркеров генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 использовали ДНК, выделенную из лейкоцитов венозной крови стандартным методом с использованием фе-нолхлороформной очистки. Определение генотипов полиморфных маркеров генов GSTT1 и GSTM1 проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР); использовали следующие олигонуклеоти-ды: для гена GSTM1 - F 5'-gaactccctgaaaagctaaagc-3' и R 5'-gttgggctcaaatatacggtgg-3'; для гена GSTT1 - F 5'-ttccttactggtcctcacatctc-3' и R 5'-tcaccggatcatggccagca-3' [5]. В качестве внутреннего контроля ПЦР использовали ген альбумина и следующие праймеры: F 5'-gccctctgctaacaagtcctac-3' и R 5'-gccctaaaaagaaaatcgccaatc-3. Аллели идентифицировали с помощью электрофоретического разделения в 2% агарозном геле (см. рис. а).

Генотип полиморфного маркера Ile105Val гена GSTP1 определяли методом ПЦР-ПДРФ, с использованием следующих праймеров: F 5'-cagacagccccctggttggc-3' и R 5'-tcacatagttggtgtaga tgaggagt-3\ Далее амплифицированный фрагмент ДНК гена GSTP1 подвергали обработке рестрик-тазой Hinfl («СибЭнзим») в термостате при 37°С в течение 15 ч. У носителей аллеля Ile фрагмент ДНК гена GSTP1 размером 197 пар нуклеотидов (п.н.) не расщепляется, в то время как у носителей аллеля Val он расщепляется рестриктазой Hinfl на 2 фрагмента — 180 п.н. и 17 п.н. У носителей гетерозиготного генотипа Ile/Val гена GSTP1 выявляются все 3 фрагмента. Аллели идентифицировали с помощью электрофоретического разделения в 10% полиакри-ламидном геле (см. рис. б).

При математической обработке результатов использован закон генетического равновесия Харди-Вайнберга для аутосомных признаков. Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6». При сравнении частот встречаемости генотипов при-

меняли критерий Пирсона, а для малых выборок — критерий Фишера. Комплексную оценку взаимосвязей между исследуемыми генотипами и риском заболевания проводили с помощью логистической регрессии, определяя отношение шансов (OR) и 95% доверительный интервал (CI95%), значение p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Частоты генотипов генов GSTM1, GSTT1 и GSTP1 в обследованных группах представлены в табл.1. Для нулевого генотипа (—/—) гена GSTM1 выявлена ассоциация с риском развития РМЖ. Его частота в группе больных была в 1,3 раза выше, чем в группе контроля (х2=4,26), относительный риск развития РМЖ повышен в 1,7 раза (отношение шансов — OR=1,65; p=0,04). Также показано, что частота нулевого генотипа (—/—) гена GSTT1 была выше в группе больных РМЖ, чем в контроле, в 1,5 раза (х2=6,39), относительный риск развития РМЖ повышен в 1,9 раза (OR=1,89; p=0,01). В других популяционных исследованиях [9, 12] также показана ассоциация этих генов с развитием РМЖ.

При изучении ассоциации полиморфного маркера Ile105Val гена GSTP1 показано, что частота генотипов Ile/Val и Val/Val в группе больных РМЖ превышает таковую в группе контроля соответственно в 1,2 и 1,3 раза (х2=3,78). Данные генотипы ассоциированы с увеличенным риском развития РМЖ (OR=1,47 и 1,33 соответственно; p=0,05). Схожие результаты получены для азиатской популяции [8]. При исследовании больных с РМЖ и РМЖ не

^ ип ид

обнаружено статистически достоверных различий частот генотипов генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 и их сочетания по сравнению с показателями в группе контроля.

Для анализа частот распределения генотипов генов глутатион^-трансфераз Т1, М1, Р1 у больных РМЖ и его подтипов в зависимости от клинической

Таблица 1

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСТОТ ГЕНОТИПОВ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ GSTM1, GSTT1 И GSTР1 У БОЛЬНЫХ РМЖ И ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ

Ген Генотип Контроль (n=138) Больные РМЖ (n=140) X2 Р Относительный риск

OR CI CI95%

GSTT1 (-/-) (+/+) 0,290 0,710 0,436* 0,564 6,39 0,01 1,89 0,53 1,15 - 3,11 0,32 - 0,87

GSTM1 (-/-) 0,384 0,507 4,26 0,04 1,65 1,02 - 2,66

(+/+) 0,616 0,493 0,61 0,38 - 0,98

Ile/Ile 0,493 0,364 0,59 0,37 - 0,95

GSTР1 (Ile105Val) Ile/Val 0,384 0,479 3,78 0,05 1,47 0,91 - 2,37

Val/Val 0,123 0,157 1,33 0,67 - 2,62

Примечание: * — жирным шрифтом выделены частоты предрасполагающих генотипов. «—/—» — нулевой генотип, или гомозиготная делеция (для генов 08ТТ1, 08ТМ1); «+/+» — ненулевой генотип (для генов 08ТТ1, 08ТМ1).

Таблица 2

АССОЦИАЦИЯ ГЕНОТИПОВ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ ОБТТ1, ОБТИг И ОБТР1 С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РМЖ У БОЛЬНЫХ РАЗНЫХ ГРУПП

Группа Генотип Число обследованных РМЖ Контроль p Относительный риск

больные РМЖ контроль X OR CI95%

GSTT1 (-/-) 76 80 0,421 0,238 11,93 0,0006 2,33 1,44-3,80

Пациенты моложе (+/+) 0,579 0,763 0,43 0,26-0,70

Ile/Ile 0,329 0,588 0,34 0,18-0,66

53 лет GSTP1 Ile/Val 76 80 0,513 0,338 10,81 0,005 2,07 1,08-3,95

Val/Val 0,158 0,075 2,31 0,82-6,51

GSTT1 (-/-) 120 138 0,408 0,290 3,99 0,05 1,69 1,01-2,84

(+/+) 0,592 0,710 0,59 0,35-0,99

Больные GSTM1 (-/-) 120 138 0,500 0,290 11,94 0,0006 2,45 1,47-4,09

РМЖ в стадии I—II (+/+) 0,500 0,710 0,41 0,24-0,68

Ile/Ile 0,325 0,471 0,54 0,33-0,90

GSTP1 Ile/Val 120 138 0,500 0,384 3,96 0,05 1,60 0,98-2,63

Val/Val 0,175 0,145 1,25 0,64-2,44

картины и стадии злокачественного процесса из общей группы больных были образованы 3 частично перекрывающиеся подруппы: больные с манифестацией РМЖ до 53 лет, больные РМЖ в стадии I/II и больные в стадии III/IV. Для гена GSTM1 не было выявлено статистически значимых различий между подгруппами больных РМЖ.

Результаты, полученные для генов GSTT1 и GSTP1, представлены в табл. 2. Следует отметить, что риск развития РМЖ у лиц до 53 лет, носителей нулевого генотипа гена GSTT1 и генотипа Val/Val гена GSTP1 существенно выше (OR=2,33 и 2,31 соответственно), чем в общей группе женщин (OR=1,89 и 1,33 соответственно; см. табл. 1). Наши результаты согласуются с результатами, полученными в других популяционных исследованиях. Так, показана [6] ассоциация нулевого генотипа гена GSTP1 с повышенным риском развития РМЖ у женщин до 60 лет.

Кроме того, установлена ассоциация нулевых генотипов генов GSTT1, GSTM1 и предрасполагающего генотипа Val/Val гена GSTP1 у больных РМЖ в стадиях I и II (соответственно OR=1,69 и p=0,05; OR=2,45 и р=0,0006; OR=1,25 и p=0,05). Соответствующих данных в других популяционных исследованиях не было.

Значительный интерес представляет исследование ассоциации с РМЖ сочетанных генотипов изученных полиморфных маркеров, поскольку в московском регионе подобный анализ не проводился.

Нами установлено, что в группах больных РМЖ гаплотип GSTM1(—/—)/GSTT1(—/—) встречается в 2,2 раза чаще, чем в контрольной группе (45,5 про-

тив 20,8%; х2=11,15); относительный риск развития РМЖ при носительстве данного гаплотипа составляет 3,18 (доверительный интервал — CI95%=1,59— 6,35; p=0,004). Гаплотип GSTT1(-/-)/GSTM(-/-)/ GSTP1(Val/Val) встречается у больных РМЖ в 7,5 раза чаще, чем в контрольной группе (57,8 против 7,7%; Х2=23,19); при этом относительный риск развития составляет 16,42 (CI95%=4,40-61,35; p=9,0«10-6). Подобные результаты подтверждаются в других популя-ционных исследованиях с меньшей корреляцией [10, 12, 15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в настоящей работе изучено распределение генотипов полиморфных маркеров генов фазы II биотрансформации ксенобиотиков — генов семейства GST (GSTT1, GSTM1, GSTP1) при РМЖ. Обнаружена повышенная частота делецион-ных генотипов генов GSTT1, GSTM1 и генотипов Ile/ Val и Val/Val гена GSTP1 у больных РМЖ. Это может свидетельствовать о том, что носительство предрасполагающих аллелей генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 играет существенную роль в формировании РМЖ. Установлено, что нулевые генотипы полиморфных маркеров генов GSTT1 и GSTM1 ассоциированы с ранней манифестацией РМЖ. Для аллеля Val и генотипа Val/Val показана ассоциация с развитием РМЖ на ранних стадиях. Для нулевого генотипа гена GSTT1 и аллеля Val гена GSTP1 показана ассоциация с развитием РМЖ у пациентов в возрасте до 53 лет. Для комбинации генотипов GSTT1(—/—)/ GSTM1(-/-) и GSTT1(—/—)/GSTM(—/—)/GSTP1(Val/ Val) была показана достоверная ассоциация с риском развития РМЖ.

Выявленные особенности могли бы быть использованы при разработке современных методов прогнозирования, профилактики и лечения РМЖ, а также для формирования групп риска по развитию опухоли

ЛИТЕРАТУРА

у женщин Московского региона. При этом в группу риска в первую очередь следовало бы отнести пациенток, у которых обнаруживается двойной или тройной предрасполагающий гаплотип.

1. Имянитов Е.Н., Хансон К.П., Молекулярная онкология: Клинические аспекты. Издательский дом СПбМАПО, 2007. - 213 с.

2. Попова С.Н., Сломинский П.А., Галушкин С.Н. и др. Полиморфизм глутатион-Э-трансфераз М1 и Т1 в ряде популяций России // Генетика. - 2002; 38 (2): 281-4.

3. Чиссова В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2010 г. (заболеваемость и смертность). М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России, 2012. - 260 с.

4. Falvo E., Strigari L., Citro G. et al. Dose and polymorphic genes XRCC1, XRCC3, GST play a role in the risk of article developing erythema in breast cancer patients following single shot partial breast irradiation after conservative surgery // BMC Cancer. - 2011; 11: 291.

5. Largillier R., Ferrero J.-M., Doyen J. et al. Prognostic factors in 1038 women with metastatic breast cancer // Annals of Oncology. - 2008; 19 (12): 2012-9.

6. Lee S., Fowke J., Lu W. et al. Cruciferous vegetables, the GSTP1 Ile105Val genetic polymorphism, and breast cancer risk // Am. J. Clin. Nutr. - 2008; 87 (3): 753-60.

7. Lo H., Ali-Osman F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drug resistance // Curr Opin. Pharmacol. - 2007; 7 (4): 367-74.

8. Lu S., Wang Z., Cui D. et al. Glutathione S-transferase P1 Ile105Val polymorphism and breast cancer risk: a meta-analysis involving 34,658 subjects // Breast. Cancer. Res. Treat. - 2011; 125 (1): 253-9.

9. Naushad S., Reddy C., Rupasree Y. et al. Cross-talk between one-carbon metabolism and xenobiotic metabolism: implications on oxidative DNA damage and susceptibility to breast cancer //

Cell. Biochem. Biophys. - 2011; 61 (3): 715-23;

10. Sakoda L., Blackston C., Xue K. et al. Glutathione S-transferase M1 and P1 polymorphisms and risk of breast cancer and fibrocystic breast conditions in Chinese women // Breast. Cancer. Res. Treat. -2008; 109 (1): 143-55.

11. Pavicic W., Laguens M., Richard S. Analysis association between mitochondrial genome instability and xenobiotic metabolizing genes in human breast cancer // Mol. Med. - 2009; 15 (5-6): 160-5.

12. Ramalhinho A., Fonseca-Moutinho J., Breitenfeld L. Glutathione S-transferase M1, T1, and P1 genotypes and breast cancer risk: a study in a Portuguese population

// Mol. Cell. Biochem. - 2011; 355 (1-2): 265-71.

13. Ramalhinho A., Fonseca-Moutinho J., Breitenfeld Granadeiro L. Positive Association of Polymorphisms in Estrogen Biosynthesis Gene, CYP19A1, and Metabolism, GST, in Breast Cancer Susceptibility // DNA Cell. Biol. - 2012; 31 (6): 1100-6.

14. Smith R., Duffy S., Tabor L. Breast cancer screening: the evolving evidence // Oncology (Williston Park). - 2012; 26 (5): 471-5, 479-81, 485-6.

15. Van Emburgh B., Hu J., Levine E. et al. Polymorphisms in CYP1B1, GSTM1, GSTT1

and GSTP1, and susceptibility to breast cancer // Oncology Rep. - 2008; 19 (5): 1311-21.