Ассоциация полиморфизма m98k и l41l в гене оптиневрин (optn) у больных глаукомой Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 617.7-007.681-056.7

М.А. АХМЕТОВ, О.Х. ХАМДИЕВА, Г.Б. УМУТБАЕВА, Б.Б. ЖУСИПОВА, Р.Е. АМЗЕЕВ, А.В. БАЛМУХАНОВА, Н.Б. АХМАТУЛЛИНА

РГП «Институт общей генетики и цитологии» МОН РК КН Лаборатория экспериментального мутагенеза

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА M98K И L41L В ГЕНЕ ОПТИНЕВРИН (OPTN) У БОЛЬНЫХ ГЛАУКОМОЙ

Глаукома - одно из распространенных глазных заболеваний, приводящих людей к нарушению зрительных функций, а также к слепоте. Одним из факторов развития глаукомы является наследственность. Диагностика на ранних стадиях является одним из ключевых факторов сохранения зрения у больного с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ). Исследовано 60 пациентов с ПОУГ и группа контроля составила 20 человек. Выявлен полиморфизм M98K гена оптиневрин (OPTN), ассоциированный с развитием наследственной формы глаукомы. Частота встречаемости составила 5% в Казахстане.

Ключевые слова: глаукома, генетика, оптиневрин, ПЦР, ПДРФ-анализ

Введение

В силу своей медико-социальной значимости проблема первичной глаукомы по праву считается одним из приоритетных направлений в офтальмологии [1]. На долю глаукомы приходится более 5 млн. незрячих во всем мире. По данным различных авторов 67-105 млн. человек больны глаукомой, и по прогнозам ВОЗ к 2030 году их число возрастет вдвое [2-4]. Необходимость ранней диагностики и терапии глаукомы обусловлена тем, что в течение 20 лет 27% больных глаукомой становятся слепыми на один глаз и 9% слепнут на оба глаза, причем, если на фоне гипотензивного лечения больные слепнут в 4,4%, то при отсутствии лечения - в 9% [5]. Весьма актуальная проблема современной офтальмологии - разработка методов ранней диагностики глаукомы, а также анализ ее генетической обусловленности. Первичная глаукома является одной из основных причин слепоты и слабовидения [6]. Потеря зрительных функций при глаукоме является необратимой, в связи с чем, особую важность приобретают проблемы своевременной диагностики и лечения [7].

Разнообразие предлагаемых организационных форм по раннему выявлению глаукомы, диагностирование глаукомы в 75-80% случаев в уже поздних стадиях, свидетельствует, по-видимому, о недостаточной их эффективности [8]. Установлено, что глаукома в 21-50% случаев генетически обусловлена, риск развития заболевания среди потомков больных глаукомой в десять раз выше, чем среднепопуляционный [9]. Имеются данные о наличии специфических генов, ассоциированных с глаукомой. Ген миоцилина (MYOC) расположен на длинном плече 1-ой хромосомы (локус ^24.3^25.2). Ген OPTN локализован в 10 хромосоме на коротком плече (локус 10р13) [10]. Методы

1) Выделение ДНК из крови больных глаукомой проводилось из замороженной крови с EDTA фенольным ме тодом.

2) Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Смесь для амплификации объёмом 25 мкл.

Для выполнения амплификации ка>едая пробирка содержала: 1) 2 мкл ЮхРСК буфера; 2) 2,5 мкл сШТР; 3) 2 мкл MgCl; 4) 1,5 мкл DMSО; 5) по 1 мкл праймеров (см. таблица 1); 6) 0, 5 ед. Taq-полимеразу; 7) 2 мкл ДНК

Таблица 1 - Праймеры, использованные для синтеза участков гена оптиневрина (OPTN)

Мутация Последовательность праймера t°- отжига (°C)

L41L с.433 G>A S 5' AAACCTG GACACG TTTACCC 3' AS 5' TAG TG CAAAG GGATGG CAT3' 58

M98K с.603 T>A S5' CAGAAGGAAGAACGCCAGTT 3' AS 5' CATCACAATGGATCGGTCTG 3' 57

3) Для оценки количества и специфичности полученного в результате проведения ПЦР амплификата проводился электрофорез в агарозном геле.

4) После того, как мы получили пул исследуемой ДНК методом ПЦР нам необходимо провести непосредственное определение генотипа. Для этого используется метод рестрикционного анализа.

Содержать ПЦР-продукт в термостате при 37°С в течение 1 -16 часов (см. таблица 2).

Таблица 2 - Рестриктазы, использовавшиеся при анализе однонуклеотидных мутаций в гене оптиневрина (ОРТЫ)

Мутация Рестриктаза Сайт рестрикции Температура (°С) п.н.

1_411_ с. 433 С>Д 4А ехоп РБ1 I ДССЛССТ 37 224 п.н. (49Л 175)

М98К с. 603 Т>Д 5В ехоп Есо 1471 37 160 п.н. (61Л99)

Примечание: п.н. - пар нуклеотид 5) Концентрация ПААГ составляет 8%.

Результаты

Обследовано 60 пациентов с офтальмологической патологией, обратившиеся в «Центральную Клиническую Больницу МЦ УДП РК», для определения частоты встречаемости основных форм глаукомы в изучаемой популяции. Всем пациентам проведена тонометрия,

офтальмоскопия, биомикроскопия. При подозрении на глаукому проведено дополнительное обследование: компьютерная периметрия, оптическая когерентная томография, ретинальная томография, ЭФИ и др. Отобраны пациенты с наследственной предрасположенностью к глаукоме.

Обозначения рисунка

дорожка: М - маркер молекулярного веса с шагом 100 п.н.;

1 - фрагмент ДНК пациента гомозиготного по частому аллелю Т;

2 и 3 - образец ДНК гетерозиготный по аллелю Т и А полиморфизма М98К гена оптиневрин (ОРТЫ)

4 - фрагмент ДНК пациента гомозиготного по мутантному аллелю А полиморфизма М98К гена оптиневрин (ОРТЫ)

Рисунок 1 - Идентификация полиморфизма М98К в гене оптиневрина (ОРТЫ) с использованием рестриктазы Есо1471.

На рисунке (рисунок 1) показаны амплифицированные фрагменты после гидролиза на наличие полиморфизмов М98К (с. 603 Т>А) 5-го экзона (фрагмента 5В) гена оптиневрина (ОРТЫ), с помощью рестрикционного анализа эндонуклеазой Есо1471. На электрофореграмме видно, что на дорожке № 1 представлены образец ДНК, гомозиготные по аллелю Т полиморфизма с М98К (с. 603 Т>А) гена оптиневрин (ОРТЫ). На дорожке № 2 и 3 кроме зоны, соответствующей полноразмерному амплификату фрагмента 5В (160 п.н.), присутствуют две дополнительные зоны, соответствующие фрагментам 61 п.н. и 99 п.н. Это свидетельствует о наличии в одном из аллелей нуклеотида А полиморфизма с. 603 Т>А, то есть

пациент, которому принадлежит анализируемый образец ДНК имеет мутацию. На дорожке № 4 выявлен очень редкий тип гомозиготы по мутантному аллелю А полиморфизма М98К (с. 603 Т>А) гена оптиневрин (ОРТЫ). Обсуждение

Частота встречаемости мутации М98К в 5-ом экзоне в гене оптиневрина среди больных ПОУГ с отягощенным семейным анамнезом по данному заболеванию составила 5%, а полиморфизма L41L в 4-ом экзоне гена ОРТЫ не было обнаружено у больных ПОУГ Казахстана (см. таблица 3).

Таблица 3 - Частота встречаемости полиморфизмов L41L и M98K

Мутации Боль Группа Найдено мутаций у В группе Процент женщины мужчин

ных контроля больных контроля втречаемости (%) ы

ПОУГ

L41L 60 20 - - - - -

M98K 60 20 3 - 5% 1 2

Аллель А полиморфизма М98К (с. 603 Т>А) в гене оптиневрина статистически достоверно встречается в группе больных ПОУГ, и не встретилась в группе контроля, и может рассматриваться как генетический фактор риска развития заболевания. Для полиморфизма L41L в генах оптиневрина (ОРТ^ ассоциации с глаукомой выявлено не было.

Разработан метод быстрого обнаружения полиморфизма М98К в гене оптиневрина с помощью ПДРФ анализа.

В Казахстане описанный способ может использоваться, как один из точных методов диагностики наследственной формы первичной открытоугольной глаукомы. Детекции полиморфизма М98К ферментативным гидролизом эндонуклеазой Есо1471 ускоряет процесс и делает его более экономичным, и может быть использован, как экспресс-метод выявления на ранней стадии первичной открытоугольной глаукомы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Glaucoma. Basic and clinical course //American Academy of ophthalmology. -2005. - 242 p.

2 Нестеров А.П. Первичная глаукома. - М.: Медицина. - 1995. - 288с.

3 Страхов В.В. Эссенциальная гипертензия глаза и первичная глаукома: автореф. дисс. д-ра мед. наук. - Ярославль: 1997. - 26 с.

4 Kanski J.J., McAllister J.A., Salmon J.F. Glaucoma: a colour manual of diagnosis and treatment // Br. J. Ophthalmol. - 1998. - Vol. 82.

5 2nd ed. Oxford: Butterworth-Heinemann. 1996. Weinreb R.// Международный конгресс по глаукоме. - Сингапур: 2007.

6 http://www.who.int/topics/blidness

7 Алексеев И.Б. Врожденная глаукома // Офтальмология национальное руководство. - М.: 2008. - С. 699.

8 Shields M.B. Textbook of Glaucoma. -Baltimore: Williams & Wilkinns. - 1987. - 549 p.

9 Нестеров А.П. Глаукома. - М.: МИА, 2008. - 357 с.

10 Рахманов В.В., Никитина Н.Я., Захарова Ф.М. и др. Мутации и полиморфизмы генов миоциллина и оптиневрина как генетические факторы риска развития первичной открытоугольной глаукомы // Генетика. - 2005. - Т.41. - №11. - С. 15671574.

М.А. АХМЕТОВ, О.Х. ХАМДИЕВА, Г.Б. УМУТБАЕВА, Б.Б. ЖУСИПОВА, Р.Е. АМЗЕЕВ, А.В. БАЛМУХАНОВА, Н.Б. АХМАТУЛЛИНА

ГЛАУКОМАМЕН АУЫРАТЫН НАУКАСТАРДЫН, ОПТИНЕВРИН (OPTN) ГЕН1НДЕП M98K ЖЭНЕ L41L ПОЛИМОРФИЗМ1Н1Н, АССОСАЦИЯСЫ

Резюме: Глаукома - керу функциясыныц б^зылысымен, сокырлыкка экелетiн, кез ауруларыныц арасында кец таралган аурулардыц бiрi. Глаукоманыц дамуыныц себептерш ц бiрi, т:р;ымкуалаушылык. Вршшмк ашык; б^рышты глаукома (БАБГ) кезiнце керу кайлепн сактау Yшiн кiлттiк фактор репнде ерте диагностика ете ма цызды. БАБГ 60 наукас пен ба кылау тобы 20 адам зерттелд^ Глаукоманыц тк^ымкуалайтын TYPiнц дамуымен ассоциацияланган оптиневрин генiнiц M98K полиморфизмi аныкталды. Каза кстанда кездесу жиiлiri 5% кдоады. ТYйiндi сездер: глаукома, генетика, оптиневрин, ПТР, РФПУ талдау

M.A. AKHMETOV, O.KH. KHAMDIYEVA, G.B. UMUTBAYEVA, B.B. ZHUSIPOVA, R.E. AMZEYEV, A.V. BALMUKHANOVA, N.B. AKHMATULLINA

M98K AND L41L POLYMORPHISMS ASSOCIATION OF OPTINEURIN (OPTN) GENE IN PATIENTS WITH GLAUCOMA

Resume: Glaucoma - one of the widespread eye diseases bringing people to eolation of usual functions, and also to a blindness. One of factors of development of glaucoma is heredity. Diagnostics at early stages is one of key factors of preservation of s ight at the patient with primary open-angle glaucoma (POAG). 60 patients with POAG are investigated and the group of control made 20 people. Polymorphism of M98K of a gene optineurin (OPTN) associated with development of a hereditary form of glaucoma is revealed. Frequency of occurrence made 5% in Kazakhstan. Keywords: glaucoma, genetics, optineurin, PCR, RFLP analysis