CC BY
33
О.С. Лар1н, Д.С. Зябл1цев
АСОЦ1АЦ1Я ОДНОНУКЛЕОТИДНОГО ПОЛ1МОРФ1ЗМУ T1245G ГЕНА COL1A1 З Р1ВНЕМ ОСТЕОАСОЦ1ЙОВАНИХ ГОРМОН1В НА ТЛ1 ПОСТМЕНОПАУЗНОГО ОСТЕОПОРОЗУ
Украгнський науково-практичний центр ендокринног xípypeíi, трансплантацп ендокринних оргатв i тканин МОЗ Украгни, Кигв
ВСТУП
Метаболiчнi захворювання кктки, до яких належить постменопаузний остеопороз (ОП), об'еднують процеси, яким притаманна прогресую-ча та генералiзована втрата мшерально''' щiльностi кiстки (МЩК), на вiдмiну вiд станiв, за яких спостеркаються локальнi змiни кктки [2]. В УкраМ у перюд з 1950 р. по 2010 р. частка вперше дiагностованого ОП зросла на 1% (з 0,2% до 1,2%), причому частка мкького населення досягла 90%. [1]. Високий ризик розвитку ОП мають жшки у постменопаузний перюд. За даними л^ератури, форму-вання остеодефщиту (ОД), що е маркером розвитку ОП, починаеться ще в менструальний перюд [3, 4], а щорiчна втрата кктково''' маси з поглибленням гор-мональних клiмактеричних порушень збтьшуеться втричi. Фiзiологiчна гiпоестрогенемiя зумовлюе зменшення утворення перюстально''' кiстки на ™i збiльшення и ендокортикально''' сорбци, зниження активносп остеобластiв iз незначним пщвищенням активностi остеокластiв, що спричинюе негативний процес ремоделювання [5]. Вважають [6], що ОП е класичним багатофакторним захворюванням, гене-тична складова якого формуеться за рахунок взаемодп багатьох геыв. Одним iз них е ген а-1 лан-цюга колагену 1-го типа (COL1A1), який мае хромо-сомну локалiзацiю 17q21.33. Вважають, що пол^ морфiзм T1245G (Sp1 SNP; bdSNP rs 1800012) у сайт зв'язку транскрипцшного чинника Sp1 у першому штроы гена COL1A1 асоцiйовано зi зниженою щть-нiстю, ламкiстю кктково' тканини, порушенням геометрп та мiнералiзацi''' кктки. Отже, визначення асофацп однонуклеотидного полiморфiзму T1245G гена COL1A1 iз ризиком розвитку ОП, рiвнем остео-асоцшованих гормонiв i бiологiчно активних речо-вин у жiнок у постменопаузний перюд е актуальною медико-профтактичною проблемою сього-дення.
Мета роботи - визначити вплив однонуклеотидного полiморфiзму T1245G гена COL1A1 на рiвень остеоасоцшованих гормонiв у жiнок iз постменопаузним остеодефiцитом.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ
Обстежено 74 жшки у менопаузний перюд, серед яких 30 пацкнток (40,5%) без ОД склали кон-трольну групу, 44 жшки з проявами ОД (59,5%) увшшли до групи дослщження (випадки). Викори-стовуючи бiохiмiчний аналiзатор BS-200 (Китай), у сироватц кровi вивчали активнкть лужно''' фосфа-тази (ЛФ, La Chema, Чехiя). 1муноферментним методом (ридер PR2100 Sanofi Diagnostic Pasteur, Франщя) дослщжували вмiст у сироватц кровi паратирео'дного гормону (ПТГ), кальцитоншу (КТ), остеокальцину (ОК), естрадiолу (ЕС), прогестерону (ПГ), тестостерону (ТС), кортизолу (КЗ), шсулшу (1Н), трийодтиронiну (Т3), тироксину (Т4), циклiчного аде-нозинмонофосфату (сАМР), iнтерлейкiну 1ß (IL-1ß) i чинника некрозу пухлин альфа (TNFa) (набори ВАТ «ВекторБест», Росiя; Amercham pharmacia biotech, Велика Британiя; DRG, США).
Методом полiмеразно''' ланцюгово''' реакцп (ПЛР) виявляли однонуклеотидний полiморфiзм T1245G гена Col1A1 (набiр реагентiв ОстеоГЕН-М, Роая). ПЛР проводили за стандартом: видтення ДНК, про-ведення реакцп амплiфiкацп зi специфiчними прай-мерами, ферментативний гiдролiз продуктiв ампли ф^ацп, електрофоретичне розподiлення в поли акриламщному або агарозному гелi з подальшою реестрацiею отриманих фрагментiв ДНК у минущо-му УФ-свiтлi. Дослiджувана концентращя ДНК у сироватцi складала 10-300 нг/мкл. Для щентиф^ацп однонуклеотидного полiморфiзму в генi Col1A1 добрано систему праймерiв, якi фланкують дослщ-жувану дiлянку молекули ДНК. До позитивного контролю проведення ПЛР належить поява бендiв, вщповщних визначеним розмiрам. Вiдсутнiсть бендiв у дорiжках, вiдповiдних бендам позитивного контролю пкля проведення реакци без додавання ДНК, вважаеться негативним контролем проведення мультиплексной ПЛР. Пкля проведення електро-форезу продуктв розщеплення пiд УФ-св^лом проводили 'х ферментативний гiдролiз. Позитивний контроль вiдзначали за появи бендiв, вiдповiдних розмiрам фрагментiв ампл^она. З метою реестрацп
отриманих результатiв ензиматичноТ рестрикцп проводили електрофорез у 8% полiакриламiдному або 2,5-3% агарозному гелi.
Статистичн розрахунки здiйснювали з викори-станням програми STATISTIKA 7.0 (StatSoft, Inc.). Ста-тистичну значущiсть рiзниць у розподЫ частот генотипiв мiж групами визначали з використанням точного методу Фшера (Fet). Вiрогiднiсть рiзниць у розподЫ генотипiв та алелей мiж групами, а також вiдповiднiсть розподту закону Хардi-Вайнберга (HWE) оцiнювали за допомогою аналiзу таблиць зчеплення за критерieм х2. Розподiл генотипiв у трупах з ОД i без нього вважали вiрогiдним за вщ-повiдностi закону Хардi-Вайнберга (HWE) для груп контролю та випадюв.
Ступшь асощацП" генотипу з наявнктю ОД визначали за величиною вщношення шансiв (OR), що характеризуе вiдносний ризик (шанси) розвитку захворювання в даному випадку залежно вщ алельного полiморфiзму дослiджуваного гена. Про вiрогiдне пiдвищення ризику свiдчить величина OR понад 1 за умови потрапляння до вiро-гщного штервалу (CI=95%). На вiрогiдне зниження ризику вказуе величина OR менша вiд 1. Вiрогiднiсть впливу варiантiв алельного полiморфiзму на вмiст у кровi остеоасоцiйованих гормонiв, Са, Р, активносп ЛФ i величини МЩК визначали з використанням однофакторного дисперсшного аналiзу за крите-рieм Фшера (F). Вiрогiднiсть рiзниць мiж середыми величинами розраховували за t-критерieм Стью-дента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Згщно з даними [7, 9], гетерозиготний поли морфiзм гена COL1A1 визначае суттеве зниження МЩК порiвняно з гомозиготним за домшантною та рецесивною алелями. Як видно з даних, наведених на рис.1, за наявносп ОД генотип G/G (гомозиготнкть за домшантною алеллю) трапляеться значно рщше. У жiнок iз ОД генотип G/G виявлено у 22,7% випадюв, а без нього - у 60,0%. Незважаючи на суттеву рiз-ницю в iнших випадках (для генотипу G/T 36,4% i 26,7% вщповщно; для генотипу Т/Т 40,9% i 13,3%
Рис. 1. Частоти розпод'1лу генотипов полiморфiзму T1245G гена Col1A1: * - вiрогiдна р'вниця частот м'жгрупами за критер'шм Фшера (р(М=0,02).
вщповщно), статистичноТ рiзницi за Kp^repieM Фи шера виявлено не було.
За результатами, наведеними у таблиц 1, OR за гомозиготного мажорного генотипу (G/G) e значно меншою вщ 1 (OR=0,196; CI=0,047-0,824). Це свiдчить, що ноо даного генотипу мають знижений у 5,1 разу ризик розвитку ОД. Залежносл в розподЫ гeнотипiв полiмоpфiзму T1245G гена Col1A1 вiд наявносп або вщсутносп ОД виявлено не було - р (х2)=0,06. Розподт гeнотипiв вiдповiдало до HWE для груп контролю (без ОД) i випадюв (з ОД) - х2=1,52; р=0,49 i х2=1,35; р=0,53 вщповщно.
Натомкть за результатами оцiнки розподту полiмоpфних алелей мiж групами (табл. 2) таку залежнкть було виявлено: мшорна алель (Т) за наявносп ОД траплялася часлше (р (х2)=0,006). Оцiнка величини OR показала, що присутнкть у гeнотипi жiнок мшорноТ алeлi (Т) пiдвищуe ризик розвитку ОД майже у 4 рази (OR=3,97; CI=1,45-10,88). Водночас пpисутнiсть мажорно!' алeлi (G) суттево знижуе ризик розвитку ОД (OR=0,25; CI=0,09-0,69). Причому (див. табл. 1) наявнкть мшорноТ гомози-готи збiльшуe ризик розвитку ОД у 4,5 разу (OR=4,50; CI=0,81-24,97).
Полiмоpфiзм T1245G гена Col1A1 вipогiдно
Таблиця 1
Вiрогiднiсть pi3H^b розподiлу генотишв полiморфiзму T1245G гена Col1A1 мiж групами жiнок i3 наявнiстю та без остeодeфiциту та величини вiдношeння шансiв (OR) залежно вщ генотипу
Генотип Контроль Випадки X2 Р (X2) OR 95% довiрчий штервал
GG 18 10 0,196 0,047-0,824
GT 8 16 5,82 0,06 1,571 0,374-6,611
TT 4 18 4,500 0,810-24,986
Таблиця2
Вiрогiднiсть рiзниць розподiлу алелей полiморфiзму T1245G гена Col1A1 мiж групами та величина вiдношення шансiв (OR) залежно вщ алелей
Алель Контроль Випадки X2 Р (X2) OR 95% довiрчий штервал
G 22 18 7,55 0,006 0,25 0,09-0,69
T 8 26 3,97 1,45-10,88
впливав на piвнi у кpовi ПТ, ОК, ПГ, Т3, Р i величину МЩК (табл. 3).
За результатами диспepсiйного аналiзу з'ясо-вано, що наявнiсть у генотип мшорноТ алeлi (Т) асоцшовано зi збiльшeнням вмiсту в кpовi ПТ, ОК, Т3, Р, величини МЩК i зниженням вмкту ПГ. Ц данi збiгаютья з бюлопчною значущiстю цих гоpмонiв у
регуляцп кальцiй-фосфоpного гомеостазу. Най-бiльшe значення F-критер^ (F=34,64; р=0,0001) вiдзначeно для величини МЩК, що доводить вплив мшорноТ алeлi (Т) на процеси розвитку ОД.
ВИСНОВКИ
1. У жшок з ОД мажорний генотип (G/G) полiмоp-
Таблиця3
Вплив полiморфiзму T1245G гена Col1A1 на клЫко-лабораторш показники у жшок з остеодефщитом
Показник Генотип Col1A1 (+1245G/T) F р
GG (n=10) GT (n=16) TT(n=18)
ПТ, пг/мл 22,21±4,06 42,25±8,66 59,89±2,79 10,06 0,001
КТ, пг/мл 10,00±1,03 8,00±0,94 7,89±1,07 1,23 0,34
ОК, нг/мл 15,87±0,74 13,00±2,21 18,22±0,34 7,51 0,003
ЕС, пмоль/л 37,10±15,92 30,10±14,84 11,00±1,90 1,916 0,17
ПТГ, нмоль/л 24,80±6,16 32,50±3,59 17,11±2,34 6,006 0,009
ТС, нмоль/л 4,91±1,21 5,26±1,01 3,29±0,69 1,65 0,22
КЗ, нмоль/л 545,40±76,74 481,87±43,02 502,67±31,69 0,48 0,63
1Н, мкМО/мл 12,40±1,15 10,63±1,01 12,78±1,33 1,09 0,35
Т4, нмоль/л 109,80±4,24 114,75±6,12 111,00±8,00 0,16 0,85
Т3, нмоль/л 1,88±0,10 1,81±0,13 2,32±0,12 6,59 0,006
сАМР, нг/мл 4,60±0,59 4,75±0,45 4,89±0,41 0,08 0,92
IL-1P, пг/мл 9,20±1,98 14,38±2,04 14,33±1,04 2,89 0,07
TNF-a, пг/мл 55,50±1,95 56,24±1,11 54,94±1,31 0,29 0,75
ЛФ, Од/л 142,40±9,38 122,57±10,85 152,67±2,97 4,84 0,02
Са, мг/л 59,80±0,68 58,70±1,12 58,20±0,82 0,70 0,51
Р, мг/л 389,80±2,07 399,66±8,69 428,38±5,35 6,71 0,006
Mg, мг/л 31,92±2,07 33,27±0,96 36,16±0,99 3,06 0,06
МЩК, SD 1,080±0,16 1,85±0,07 2,20±0,09 34,64 <0,0001
МК1, у.о. 0,40±0,01 0,41±0,01 0,384±0,01 1,94 0,17
Примтка: МК1 - метакарпальний Ндекс.
фiзму T1245G гена Col1A1 траплявся у 2,6 разу часпше. З урахуванням величини OR вщзначе-но, що носи даного генотипу мають знижений у 5,1 разу ризик розвитку ОД. 2. Наявнкть у генотип мшорноТ алелi (Т) збть-шуе ризик розвитку ОД у 4 рази, а наявнкть мшорноТ гомозиготи (Т/Т) - у 4,5 разу. Наявнкть мшорноТ алелi в однонуклеотидному полiморфiзмi T1245G гена Col1A1 асоцшовано зi збтьшенням вмiсту в кровi ПТ, ОК, Т3, Р, величини МЩК i зниженням вмiсту ПГ.
Л1ТЕРАТУРА
1. Бердыева Э.Б. Факторы риска развития системного остеопороза / Э.Б. Бердыева // Молодой ученый. -2014. - №14. - С. 73-75.
2. Насонов Е.Л. Клинические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению остеопороза / Е.Л. Насонов, Л.И. Беневоленская, О.М. Лесняк. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - С. 231-239.
3. Capozza R.F., Cure-Cure C., Cointry G.R., Meta M. Association between low lean body mass and osteoporotic fractures after menopause // Menopause. -2008. - Vol. 15, № 5. - P. 905-913.
4. Clin Chim. Association of vitamin D receptor gene polymorph isms with BMD and their effect on 1, 25-dihydroxy vitamin D3 levels in pre- and postmenopausal South Indian women from Andhra Pradesh / Chim Clin // Acta Epub. - 2011. - Vol. 412 (7-8). - P. 541-544.
5. Ho S.C., Chan S.G., Yip Y.B., Chan C.S. Change in bone mineral density and its determinants in pre- and perimenopausal Chinese women: the Hong Kong perimenopausal women osteoporosis study // Osteoporos. Int. - 2008. - Vol. 19, № 12. - P. 1785-1796.
6. Molecular mechanisms of vitamin D action / M.R. Haussler, G.K. Whitfield, I. Kaneko [et al.] // Calcif. Tissue Int. - 2013. - Vol. 92, № 2. - Р. 77-98.
7. Nguen T.V., et al. The contribution of polymorphisms of Col1A1 gene allels to the determination of bone mineral density in normal and osteoporotic women. / T.V. Nguen / J. Bone Miner. Res. - 2005. - Vol. 10, № 3. - P. 991-996.
8. Szulc P., Seeman E., Duboeuf F., Sornay-Rendu E. Bone fragility: failure of periosteal apposition to compensate for increased endocortical resorption in postmenopau-sal women // J. Bone Miner. Res. - 2006. - Vol. 21, № 12. - P. 1856-1863.
9. Todhunter C.E., et al. Genetic and biology of gene Col1A1 polymorphisms / C.E. Todhunter // Gene. -2010. - Vol. 338, № 1. - P. 143-156.
РЕЗЮМЕ
Асощащя однонуклеотидного полiморфiзму T1245G гена COL1A1 з piBHeM остеоасоцшованих гормошв на ™i постменопаузного остеопорозу О.С. Ларн, Д.С. Зябл'щев
Мета роботи - визначення впливу однонуклеотидного полiморфiзму T1245G гена COL1A1 на рiвень остеоасоцшованих гормошв у жшок iз постменопаузним остеопорозом.
Матерiали та методи. Обстежено 74 жшки у постменопаузний перюд: 30 пацкнток (40,5%) без ОД - контрольна група, 44 жшки з проявами ОД (59,5%) - група дослщження (випадки). У кровi ви-значали: активнкть лужноТ фосфатази, вмкт пара-тиреощного гормону, кальцитоншу, остеокальци-ну, естрадюлу, прогестерону, тестостерону, корти-золу, шсулшу, трийодтироншу, та тироксину, цик-лiчного аденозинмонофосфату, штерлейкшу 1р, чинника некрозу пухлин а. Генетичн дослщження проводили за допомогою полiмеразноï ланцюговоТ реакцп. Статистичн розрахунки здшснювали з використанням програми STATISTIKA 7.0 (StatSoft, Inc.): точного методу Фшера (Fet), аналiзу критер^ узгодженосп ^рсона х2. Розподт генотитв в трупах з ОД i без нього вважали вiрогiдним за вщ-повщносп закону ХардиВайнберга (HWE) для обох груп.
Результати та обговорення. У контролi мажорна гомозигота (G/G) трапляеться часпше (60,0% vs 22,7%), а носи даного генотипу мають знижений ризик розвитку остеопорозу в 5,1 разу. Гетерозиго-та (G/Т) збтьшуе шанси розвитку остеопорозу в 1,6 разу та асоцюеться з пщвищеними рiвнями у кровi паратиреоТдного гормону, остеокальцину, трийодтироншу, фосфору та зниженими рiвнем прогестерону й величиною мшеральноТ щтьносп кктки. Гомозиготнкть за даною алеллю збтьшуе шанси розвитку остеопорозу в 4,5 разу.
Висновки. Домшантна гомозигота (G/G) трапляеться майже у 3 рази часпше та асо^юеться зi зниженням ризику розвитку постменопаузного остеопорозу в 5,1 разу (0R=0,196; CI=0,047-0,824). Гетерозигота (G/Т) в 1,6 разу збтьшуе ризик за-хворювання через дисбаланс остеоасоцшованих гормошв i метаболiзму кктки (0R=3,97; CI=1,45-10,88). За наявносп в генотит полiморфноï гомозиготи (Т/Т) ризик розвитку остеопорозу збтьшуеться в 4,5 разу (0R=4,50; CI=0,81-24,97).
Ключовi слова: остеопороз, остеодефщит, ген COL1A1, однонуклеотидний полiморфiзм T1245G, остеоасоцшоваш гормони.
РЕЗЮМЕ Ассоциация однонуклеотидного полиморфизма T1245G гена COL1A1 с уровнем остеоассоциированных гормонов при постменопаузальном остеопорозе О.С. Ларин, Д.С. Зяблицев
Цель работы - определить влияние однонуклеотидного полиморфизма T1245G гена COL1A1 на уровень остеоассоциированных гормонов у женщин с постменопаузальным остеопорозом.
Материалы и методы. Обследовано 74 женщины в постменопаузальный период: 30 пациенток (40,5%) без ОД - контрольная группа, 44 женщин (59,5%) - группа исследования (случаи). В крови определяли: активность щелочной фосфа-тазы, содержание паратиреоидного гормона, кальцитонина, остеокальцина, эстрадиола, прогестерона, тестостерона, кортизола, инсулина, три-йодтиронина и тироксина, циклического адено-зинмонофосфата, интерлейкина 1в, фактора некроза опухолей а. Генетические исследования проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Статистические расчёты проводили с использованием программы STATISTIKA 7.0 (StatSoft, Inc.): точного метода Фишера (Fet), анализа критерия согласования Пирсона х2. Распределение генотипов в группах с ОД и без него считали достоверным при соответствии закону Харди-Вайнберга (HWE) для обеих групп.
Результаты и обсуждение. В контроле мажорная гомозигота (G/G) встречается чаще (60,0% vs 22,7%), а носители данного генотипа имеют сниженный в 5,1 раза риск развития остеопороза. Гетерозигота (G/Т) увеличивает шансы развития остеопороза в 1,6 раза и ассоциируется с повышенным уровнем в крови паратиреоидного гормона, остеокальцина, трийодтиронина, фосфора и сниженными уровнем прогестерона и величиной минеральной плотности кости. Гомозиготность по данной аллели увеличивет шансы развития остео-пороза в 4,5 раза.
Выводы. Доминантная гомозигота (G/G) встречается почти в 3 раза чаще и ассоциируется со снижением риска развития постменопаузального остеопороза в 5,1 раза (0R=0,196; CI=0,047-0,824). Гетерозигота (G/Т) в 1,6 раза увеличивает риск заболевания (0R=3,97; CI=1,45-10,88) из-за дисбаланса остеоассоциированных гормонов и метаболизма кости. При наличии в генотипе полиморфной гомозиготы (Т/Т) риск развития остеопороза увеличивается в 4,5 раза (0R=4,50; CI=0,81-24,97).
Ключевые слова: остеопороз, остеодефицит, ген COL1A1, однонуклеотидный полиморфизм T1245G, остеоассоциированные гормоны.
SUMMARY Single nucleotide polymorphism T1245G of gene COL1A1 association with the level of osteoassociated hormones of postmenopausal osteoporosis O. Larin, D. Zyablisev
Purpose - to determine the influence of single nucleotide polymorphism T1245G of gene COL1A1 over the level of osteoassociated hormones of woman's with postmenopausal osteoporosis.
Materials and methods. We have researched 74 women's in postmenopausal period: 30 women's (40, 5%) without OD - control group, 44 women's (59, 5%) - research group (cases). In the blood we have determine: activity of alkaline phosphatase, maintenance of parathyrine ,calcitonine, osteocalcine, estradiole, progesterone, testosterone, cortisol, insuline, three- and tetraiodthyronine, cyclic adenosinmono-phosphat, interleukin ip, tumor necrosis factor a. Genetically research carried out with the help of poly-merase chain reaction (PCR). To statistical estimation we have used the programe STATISTIKA 7.0 (StatSoft, Inc.): Fisher rigorous method (Fet), analyses of Pearson's chi-squared test x2. We considered that genotype distribution in groups with and without OD is significant accordance to Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) for both groups.
Results and discussion. We elicited that major homozygosis (G\G) was found more often (60,0 % vs 22,7 %). Carriers of this genotype have decreased risk of development of osteoporosis in 5,1 (0R=0,196). Geterozygous (G\T) was increased the odds in 4 (OR=1,571) and increased levels of parathyrin, osteo-calcin, triiodotyronin, phosphorus and low concentration of progesterone and bone mineral density quantity, homozygous of this allele - in 4,5 (OR=4,5) in order to 95 % confidence interval.
Conclusion. Dominant homozygous (G/G) has been detected almost in 3 times more often and has a protective effect of the development of postmeno-pausal osteoporosis in 5,1 times (OR=0,196; CI=0,047-0,824). Geterozygous (G/Т) in 1,6 times has been increasing the risk of decease (OR=3,97; CI=1,45-10,88) and leads to disbalance of osteoassociated hormons and bone metabolic rate. Polymorphic homozygous (Т/Т) has been increasing the risk of development of osteoporosis in 4,5 times (OR=4,50; CI=0,81-24,97).
Key words: osteoporosis, osteodefisiency, ast sociation, allele, gene COL1A1, SNiP, osteoassociated hormones.
Дата надходження до редакцп 21.01.2015 р.
