CC BY
7УДК 634.11:631.524.86
О.Ю. Урбанович1, З.А. Козловская2, П.В. Кузмицкая1, Н.А. Картель1
ассоциация аллеля MdMYB1-1 с красной окраской кожицы плодов яблони
1ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2РУП «Институт плодоводства» Республика Беларусь, 223013, Минская обл., Минский р-н, пос. Самохваловичи, ул. Ковалева, 2
Введение
Сорта яблони, важнейшей плодовой культуры в Беларуси, имеют плоды различной окраски кожицы: от зеленой, как у сорта Память Вавилова, до темно-красной, как у сорта Память Коваленко. У многих сортов кожица плодов окрашена неравномерно, имеет штрихи или румянец, который может быть выражен в разной степени даже среди плодов одного сорта. Цвет плодов яблони является не только отличительной чертой, характеризующей сорт, но и важным критерием, который влияет на выбор потребителем того или иного сорта яблок. Покупатели часто отдают предпочтение сортам с красными плодами. Плоды с красной окраской ассоциируются с лучшей спелостью, и соответственно, с лучшим вкусом и ароматом [1].
Красный цвет плодов яблони главным образом определяется присутствием вторичных метаболитов - антоцианов [2, 3]. Интенсивность красной окраски кожицы плодов непосредственно зависит от степени накопления этих природных антиок-сидантов. Следует отметить, что помимо антоцианов, в окраске фруктов принимают участие каротиноиды и хлорофилл [4]. Накопление антоцианов во фруктах варьирует в широком пределе и изменяется в зависимости от стадии зрелости и условий окружающей среды. Наиболее спелые плоды, хорошо освещенные солнцем в процессе роста, имеют более насыщенную окраску и соответственно более высокое содержание
антоцианов в кожуре по сравнению с незрелыми, плохо освещенными солнечными лучами плодами того же сорта [5].
Антоцианы синтезируются по флавоноид-ному пути, который является ветвью фенил-пропаноидного пути [6]. Основная его регуляция происходит на уровне транскрипции структурных генов, кодирующих ферменты. В геноме растений обнаружено три семейства генов, регулирующих синтез антоциа-нов - MYB, bHLH и WDR [5, 6]. Накопление антоцианов зависит от скоординированной экспрессии этих генов. Процесс индуцируется солнечным светом [4]. Показано, что за накопление антоциана в плодах яблони ответственен транскрипционный фактор MYB [7]. В геноме яблони обнаружены три варианта данного транскрипционного фактора, получивших название MYB1, MYB10 и MYBA [8]. Они имеют высокий уровень гомологии ну-клеотидного состава кодирующего региона и, возможно, являются аллельными [9]. Степень их влияния на окраску кожицы плодов яблони исследована недостаточно.
Целью данного исследования являлось определение аллельного состава гена MdMYB1 у сортов яблони различной окраски и анализ возможности использования информации о составе аллелей данного гена для прогнозирования окраски кожицы плодов. В исследовании были использованы сорта, произрастающие в данном климатическом регионе.
Материалы и методы
Исследование проводилось на 104 сортах яблони различной окраски. Сорта были отобраны из коллекции РУП «Институт плодоводства». Среди них - белорусские, российские, украинские со-
рта, сорта селекции других стран, представляющие интерес для дальнейшей селекционной работы. Выбранные сорта отличались по наличию и степени покровной окраски кожицы плодов.
Оценка цвета плодов проводилась визуально по наличию и степени интенсивности красной окраски. Были выделены следующие 5 групп сортов: сорта с темно-красной и пурпурной окраской, с красной окраской, со средней степенью окраски, со слабой окраской и сорта, не имеющие красной окраски.
Из листового материала представителя каждого сорта были выделены препараты ДНК. Выделение ДНК проводили с помощью Genomic DNA Purification Kit фирмы Fermentas согласно рекомендованному протоколу.
Для идентификации аллелей гена MdMYB1 применяли молекулярные маркеры, выявляемые в результате ПЦР Реакцию проводили с помощью dCAPS маркеров в соответствии с [10]. Праймеры синтезированы компанией Праймтех (Беларусь).
Реакционная смесь для ПЦР объемом 20 мкл содержала 40 нг ДНК, 75 мМ трис-HCl (pH 8.8 при 25 °С), 20 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 0,2 мМ dNTP, 200 мМ каждого праймера, 1 ед. Taq-полимеразы.
Реакцию амплификации проводили в следующем режиме: I-й этап: 1 цикл: 94 °С -4 мин; II-й этап: 40 циклов: 94 °С - 40 сек; 55 °С - 1 мин; 72 °С - 2 мин; Ш-й этап: 1 цикл: 72 °С - 8 мин.
Продукты амплификации обрабатывали рестриктазой BstEII (Fermentas) в течение 2 часов при 37 °С в буфере, рекомендованном производителем.
Полученные фрагменты разделяли в 1% ага-розном геле в трис-ацетатном буфере. Гели документировали с помощью фотографирования после окрашивания этидиум бромидом. В качестве маркера молекулярного веса использовали 100 bp DNA Ladder Plus (Fermentas). Присутствие аллеля MdMYB1-1 определяли по наличию фрагмента амплификации размером в 263 п.н., который образовывался после разрезания апликонов рестриктазой BstEII. Фрагменты амплификации, соответствующие аллелям MdMYB1-2 и MdMYB1-3, имели размер 292 п.н.
Результаты и обсуждение
В сформированной коллекции яблони на- 104. В группу, у которой красная окраска личие красной окраски плодов в той или отсутствовала, было отнесено 14 сортов иной степени было отмечено у 90 сортов из (табл. 1).
Таблица 1
Распределение аллеля МйМ\В1-1 среди групп сортов яблони различной окраски
Окраска плодов Присутствует аллель MdMYB1-1 % Отсутствует аллель MdMYB1-1 %2 Всего образцов
Темно-красная окраска 14 100,0 0 0,0 14
Красная 21 87,5 3 12,5 24
Средняя степень окраски 25 100,0 0 0,0 25
Слабая окраска 15 55,6 12 44,4 27
Отсутствие красной окраски 2 14,3 12 85,7 14
В геноме каждого сорта был определен состав аллелей гена MdMYB1. Для данного гена известно три аллеля - MdMYB1-1, MdMYB1-2, MdMYB1-3. Изначально аллель MdMYB1-1 был обнаружен у растений с красной окраской кожицы плодов, в то время как два других (MdMYB1-2 и MdMYB1-3) были выявлены в геноме растений, не имеющих красной окраски [10].
Результаты анализа, проведенного с помощью молекулярных маркеров к гену MdMYB1, показа-
ли, что у 77 образцов яблони из 104 присутствует аллель MdMYB1-1, что составляет 74% от общего числа рассмотренных сортов. Данные по аллель-ному составу групп сортов с разной степенью наличия красной окраски приведены в табл. 1. Как видно из представленных данных, 100% сортов яблони, имеющих темно-красную окраску плодов, имеют аллель MdMYB1-1. Такой же процент соответствия у сортов, имеющих плоды со средней степенью проявления красной окраски, в то время
как 12,5% сортов, имеющих плоды красной окраски и 44,4% яблонь с плодами со слабой красной окраской, не имеют аллеля MdMYB1-1.
В геноме 85,7% сортов яблони, плоды которых не имеют красной окраски, аллель, ассоциированный с
красной окраской, не представлен (рис. 1). В целом, степень ассоциации маркера с признаком окраски кожицы плодов по результатам исследования данной коллекции составляет 83,8%. Это достаточно высокий уровень ассоциации маркера с признаком.
Рис. 1. Частота встречаемости аллеля MdMYB1-1 среди групп сортов яблони различной окраски
Достоверно высокое соответствие между присутствием аллеля MdMYB1-1 и красной окраской кожицы плодов было отмечено Zhu с соавторами [11]. Они показали, что 86% сеянцев, полученных от скрещивания Golden Delicious х Arlet, и 80% сеянцев из семьи Honeycrisp х Cripps Pink демонстрируют ассоциацию между генотипом и фенотипом. Авторы высказали предположение, что проявление признака красной окраски кожицы плодов зависит от генетического окружения.
Следует отметить, что ген MdMYB1, аллели которого были определены в представленном
исследовании, кодирует транскрипционный фактор, запускающий путь биосинтеза антоцианов. Аллели данного гена оказывают большое влияние на проявление красной окраски кожицы, однако, как показывают проведенные исследования, не обязательно будет указывать на наличие желаемого признака у носителя определенной ал-лельной формы. Результаты наблюдения за проявлением признака показали, что у части сортов, имеющих красную окраску, аллель MdMYB1-1 отсутствует. В тоже время он присутствует у некоторых сортов с зеленой окраской (табл. 2).
Таблица 2
Распределение аллеля MdMYB1-1 среди сортов яблони различной окраски
Название сорта Страна происхождения Генотип Фенотип
Алеся Беларусь + +
Амулет Украина + +
Антей Беларусь + +
Антоновка обыкновенная Старорусский - -
Ауксис Литва + +
Афродита Россия + +
Бабушкино Россия - -
Банановое Беларусь - +
Белорусский синап Беларусь - +
Белорусское летнее Беларусь + +
Продолжение табл. 2
Название сорта Страна происхождения Генотип Фенотип
Алеся Беларусь + +
Амулет Украина + +
Антей Беларусь + +
Антоновка обыкновенная Старорусский - -
Ауксис Литва + +
Афродита Россия + +
Бабушкино Россия - -
Банановое Беларусь - +
Белорусский синап Беларусь - +
Белорусское летнее Беларусь + +
Белорусское малиновое Беларусь + +
Белорусское сладкое Беларусь + +
Белый налив Старорусский - -
Боровинка Беларусь + +
Вербнае Беларусь + +
Весялина Беларусь + +
Ветеран Россия + +
Дарунак Беларусь + +
Долго США + +
Елена Беларусь + +
Заря Алатау Казахстан + +
Заславское Беларусь + +
Имант Беларусь + +
Кандиль орловский Россия + +
Коваленковское Беларусь + +
Коробовка крупноплодная Беларусь - +
Коштеля Польша - -
Лошицкое Беларусь + -
Лучезарное Беларусь + +
Медуница Россия + +
Мечта Россия + +
Минское Беларусь + +
Надзейны Беларусь - +
Несравненное Беларусь - +
Новинка осени Беларусь - -
Новое сладкое Беларусь - -
Орловим Россия + +
Осеннее полосатое Германия + +
Осмоловка Беларусь + +
Память Вавилова Беларусь + -
Память Исаева Россия + +
Память Коваленко Беларусь + +
Память Пашкевича Беларусь - -
Память Сикоры Беларусь + +
Память Сюбаровой Беларусь + +
Папировка Старорусский - -
Пепин литовский Беларусь - +
Пепин литовский улучшенный Беларусь - -
Пепинка золотистая Украина - +
Первинка Россия + +
Перлына Киева Украина + +
Поспех Беларусь + +
Ребристое Беларусь - -
Свежесть Россия + +
Серуэл Беларусь + +
Синап орловский Россия - +
Скала Россия + +
Слава победителям Украина + +
Солнышко Россия + +
Продолжение табл. 2
Название сорта Страна происхождения Генотип Фенотип
Старт Россия + +
Стойкое Беларусь + +
Строевское Россия + +
Сябрына Беларусь + +
Теллисааре Эстония - +
Утро Украина - -
Цыганочка Украина + +
Чаравница Беларусь + +
Черное дерево Старорусский - -
Чулановка Россия + +
Щедрое Беларусь - -
Юбиляр Россия + +
84-51/9 Беларусь + +
84-39/58 Беларусь + +
Alkmene Germany + +
BM41497 Sweden + +
Elstar Netherlands + +
Empire USA + +
Fiesta Great Britain + +
Fiorina France + +
Freedom USA + +
Gravenstein Germany + +
Idared USA + +
Jonafree USA - +
Jonagold de Costa Belgium + +
Jupiter Great Britain + +
Kent Great Britain + +
Lawfam Canada + +
Сеянец Лавфама Беларусь + +
Mcintosh Canada + +
Melba Canada + +
Otava Czech Republic - +
Pinova Germany + +
Red Boskoop Netherlands + +
Red silver USA - +
Redfree USA - +
Retina Germany + +
Rewena Germany + +
Sawa Poland + +
SR0523 USA + +
Topaz Czech Republic + +
Wealthy USA + +
Witos Poland + +
К:1211 Sweden + +
К:+343 Sweden + +
К:1431 Sweden - +
* - знаки «+» и «-» в колонке генотип обозначают, что в геноме присутствует или отсутствует аллель MdMYB1-1; ** - знаки «+» и «-» в колонке фенотип обозначают наличие или отсутствие красной окраскикожицы плодов яблони.
Таким образом, результаты, представленные в данном исследовании, а также результаты, полученные другими авторами, указывают на то, что помимо аллельного состава гена MdMYB1, на окраску кожицы плодов яблок оказывают влияние и другие факторы.
Так, в частности, А.Телиас с соавторами
продемонстрировал, что накопление антоциа-нов в кожуре плодов яблони может контролироваться эпигенетически [12]. Исследуя плоды с пестрой окраской, авторы показали, что уровень накопления антоцианов различался в отдельных клетках кожицы яблок. Содержание антоцианов понижено в зеленых
участках кожицы относительно красных. Причиной этого явления оказалось снижение уровня транскрипции генов антоцианового пути биосинтеза, в том числе регулирующего этот путь транскрипционного фактора MYB10. В зеленых участках кожицы отмечен более высокий уровень метилирования промоторной области гена, кодирующего транскрипционный фактор MYB10, по сравнению с областями с красной окраской. Авторы считают, что уровень метилирования промоторной области гена MYB10 оказывает влияние на степень накопления антоцианов в кожуре яблок с пестрой окраской. На изменение уровня метилирования в свою очередь может оказывать влияние присутствие мобильного элемента TRIM. Он был обнаружен на расстоянии 2.5 т.п.н. перед предсказанным сайтом начала транскрипции генаMYB10 [12].
Влияние степени метилирования на уровень транскрипции гена MdMYB1 было также обнаружено при исследовании сорта Ralls, имеющего полосатую окраску плодов, и его мутантной формы с румяной окраской плодов [13]. Уровень метилирования ДНК про-
моторной области гена MdMYB1 оказался достоверно ниже у мутантной формы с румяной окраской плодов. Соответственно мутантная форма характеризовалась более высоким уровнем транскрипции гена. При этом сорт Ralls и его мутантная форма не имели отличий в составе нуклеотидных последовательностей как генаMdMYB1, так и его промоторной области. Вместе с тем отмечены случаи, когда причиной изменения уровня экспрессии могут быть изменения в структуре промоторной области соответствующих генов. Так, инсерция мини-сателлита в промоторном регионе гена MYB10 приводит к увеличению его транскрипции и повышению уровня содержания антоцианов у форм яблони с красным цветом листьев и мякоти плодов [14].
Похожее явление обнаружено не только у яблони. Ранее было показано влияние ре-гуляторных генов антоцианового пути на проявление пестрой окраски у семян кукурузы [15]. У некоторых светлых сортов винограда причиной отсутствия пигмента является ретротранспозон-индуцибельная мутация в промоторной области гена VvmybA1 [16].
Заключение
Таким образом, окраска плодов яблони может зависеть от множества факторов. Помимо условий окружающей среды и генов, кодирующих структурные ферменты, участвующие в каталитических реакциях синтеза вторичных метаболитов, на ее формирование оказывает влияние аллельный состав регуляторных генов, уровень их экспрессии, определяемый
состоянием их промоторных областей. В результате, наличие аллеля MdMYB1-1 в геноме образцов яблони не может гарантировать проявление признака, а указывает только на более высокую вероятность проявления красной окраски кожицы плодов. Для точного прогнозирования признака окраски необходима разработка дополнительных подходов.
Список использов
1. Development of a model for prediction of consumer linking from visual attributes of new and established apple cultivars / M.C. King, M.A. Cliff// J.Am. Pom. Soc. -2002. -Vol. 56. - P. 223-229.
2. Antioxidant activity of fresh apples / M.V. Eberhardt, C.Y. Lee, R.H. Liu // Nature. -2000. - Vol. 405. - P. 903-904.
3. Relationship between apple peel and the whole fruit antioxidant content: year and cultivar variation / B. Lata // J. Agr. Food Chem. - 2007. -Vol. 55, №663-671.
нных источников
4. Regulation of skin color in apples / J.E. Lancaster // CRC Crit Rev Plant Sci. -1992. - Vol. 10. - P. 487-502.
5. External control of anthocyanin formation in apple / M.C. Saure // Sci. Hort. - 1990. -Vol. 42. - P. 181-218.
6. Flavonoid biosynthesis: a colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology / B. Winkel-Shirley // Plant Physiology. - 2001. - Vol. 126. - P. 485-493.
7. Red coloration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor,
MDMYB10 / R.V. Espley [et al.] // Plant J. -2007. - Vol. 49. - P. 414-427.
8. Isolation and functional analysis of aMYB transcription factor gene that is a key regulator for the development of red coloration in apple skin / Y. Ban [et al.] // Plant Cell Physiol. -2007. - Vol. 48. - P. 958-970.
9. An R2R3 MYB transcription factor associated with regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae / K. Lin-Wang [et al.] // BMC Plant Biol. - 2007. - Vol. 10. -P. 50.
10. Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples / A.M. Takos [et al.] // Plant Physiol. - 2006. -Vol. 142. - P. 1216-1232.
11. Utility testing of an apple skin color MdMYB1 marker in two progenies / Y. Zhu, K. Evans, C. Peace // Molecular Breeding. -2010. - Vol. 27. - P. 525-532.
12. Apple skin patterning is associated with differential expression of MYB10 / A. Telias [et al.] // BMC Plant Biology. - 2011. - Vol. 11, №93
13. Comparison of MdMYB1 sequences and expression of anthocyanin biosynthetic and regulatory genes between Malus domestica Borkh. cultivar 'Ralls' and its blushed sport / Y. Xu [et al.] // Euphytica. - 2011. - on-line
14. Multiple repeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in red apples / R.V. Espley [et al.] // Plant Cell. -2009. - Vol. 21. - P. 168-183.
15. Pl-Bh, an anthocyanin regulatory gene of maize that leads to variegated pigmentation / S.M. Cocciolone, K.C. Cone // Genetics. -1993. - Vol. 135. - P. 575-588.
16. Retrotransposon-induced mutations in grape skin color / S. Kobayashi, N. Goto-Yamamato, H. Hirochika // Science. - 2004. -Vol. 304. - P. 982.
Дата поступления статьи 16 ноября 2011 г..
