CC BY
176
УДК 577.21
О.С. Попова 1, Л.А. Гордеева 1, И.В. Шаталина 1, Е.Н. Воронина 2, Р.В. Оленникова 3,
С.Л. нерсесян 3, м.л. Филиппенко 2, А.Н. Глушков 1
ассоциации полиморфизмов генов цитокинов с невынашиванием беременности инфекционного генеза
1 Институт экологии человека СО РАН (Кемерово)
2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск)
3 Областная клиническая больница (Кемерово)
Изучали ассоциации полиморфизмов генов цитокинов с инфекционной формой невынашиванием беременности. Установили, что у женщин генотип AA гена TNFA (rs1800629) и. сочетание генотипов *1/*1 гена IL1RN и. GG гена IL6 (rs1800795) вовлечены, в патогенез невынашивания беременности. Ключевые слова: генетический полиморфизм, невынашивание беременности, инфекция
AssociATioNs of poLYMoRpHisMs iN cytokine genes wiTH THE iNFEcTious GENEsis oF REccuRENT MIscARRIAGE
O.S. Popova 1, L.A. Gordeyeva 1, I.V. Shatalina 1, E.N. Voronina 2 , R.V. Olennikova 3,
S.L. Nersesyan 3, M.L. Filippenko 2, A.N. Glushkov 1
11nstitute of Human Ecology SB RAS, Kemerovo
2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, Novosibirsk
3 Kemerovo Regional Clinical Hospital, Kemerovo
The associations of polymorphisms in cytokine genes with the infectious form recurrent miscarriage were investigated. Have established, that at the women a genotype AA of a gene TNFA (rs1800629) and combination of genotypes *1/*1 genes IL1RN and GG of a gene IL6 (rs1800795) are involved, in pathogenesis recurrent miscarriage. Key words: genetic polymorphisms, recurrent miscarriage, infection
Как показали клинические исследования, одной из наиболее частых причин невынашивания беременности (НБ) у женщин может быть урогенитальная бактериально-вирусная инфекция. Между тем, вопрос об этиологической роли инфекции при НБ до сих пор дискутируется. Предполагается, что инфекция, скорее, играет первостепенную роль при спорадическом прерывании беременности, чем при привычном НБ [6]. Имеются данные о том, что инфицированность матери может не нарушать нормального хода беременности и не влияет на развитие плода при отсутствии существенных изменений параметров иммунной системы [3].
Согласно современным представлениям, выживаемость плода зависит от сложной цитокино-вой регуляции иммунного ответа матери, при этом во время беременности возникает колеблющееся равновесие между двумя типами цитокинов, которое может смещаться в любом направлении [10]. При нормально развивающейся беременности иммунная система матери более ориентирована на выработку регуляторных цитокинов Т-хелперами
II типа (^-4, ^-10 и др.). Однако исследования показали, что у женщин с НБ цитокиновый профиль направлен на выработку провоспалительных цитокинов Т-хелперами I типа (TNF-a, 1Ь-1 и др.), способных вызывать гибель фетоплацентарной единицы вследствие чрезмерной цитотоксической активации NK-клеток и фагоцитарной активности макрофагов в эндометрии и децидуальной ткани [6].
В настоящее время выявлен полиморфизм генов многих цитокинов. Установлено, что отдельные аллельные варианты генов цитокинов оказывают
влияние на скорость транскрипции, стабильность или качество мРНК, а также активность кодируемых ими белковых продуктов [2]. Взаимосвязь генов цитокинов с НБ активно изучается. Однако, взаимосвязь генов цитокинов с НБ инфекционного генеза остается недостаточно изученной. Поэтому целью настоящего исследования стало изучение ассоциаций полиморфизмов генов цитокинов (К1В, IL1RN, Т^А и Д.6) с НБ инфекционного генеза.
Проведено обследование 153 женщин репродуктивного возраста, проживающих на территории Кемеровской области и принадлежащих к русской этнической группе. Группу сравнения (контроль) составили 116 женщин с физиологическим течением беременности в сроки беременности 15 — 35 недель, у которых во время настоящей и предыдущих беременностей отсутствовали спонтанные выкидыши и врожденные аномалии развития у плода (ребенка). Средний возраст женщин был 29,6 года.
В исследуемую группу (НБ) были включены 37 женщин с верифицированной урогенетальной инфекцией, обратившихся в Медико-генетическую консультацию г. Кемерово в связи с невынашиванием беременности. Из них 5 женщин были беременными (9 — 21 недель), настоящая беременность протекала на фоне угрозы прерывания, а 32 женщины были вне беременности и находились на реабилитации после очередного выкидыша. Основанием для включения в эту группу было отсутствие анатомических и гормональных аномалий, нарушений в спермограмме супруга, а также указаний на медицинские аборты, роды, внематочную беременность и наличие в анамнезе 2 или
3 выкидышей. По результатам ДНК-типирования и ИФА 18 женщин (48,6 %) являлись носителями бактериальных инфекций (Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium), а 19 (51,4 %) женщин были носителями инфекции смешанного генеза (бактерии + вирусы). Средний возраст женщин этой группы был 29,9 года.
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью метода фенол — хлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом [15], образцы ДНК хранили при —20 °C.
В работе исследовали полиморфизмы G(-308) A гена TNFA (rs1800629), T( + 3953)C гена IL1B (rs1143634), G(-174)C гена IL6 (rs1800795), содержащие однонуклеотидные замены (SNP), и минисател-литные маркеры, характеризующиеся различным числом тандемных повторов (VNTR) во 2 интроне гена IL1RN. Тест-системы для молекулярно-генетического анализа данных полиморфизмов были разработаны в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск).
Генотипирование TNFA (rs1800629) проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Зонды отличались по структуре на один нуклеотид, соответствующий SNP (находится в центре олигонуклеотидного зонда). Каждый образец амплифицировался с использованием пары специфических праймеров (5'-TTCCGAGGGGGGTCTTCTG-3' и 5'-GTTCT ATCTTTTTCCTGCATCCTGT-3') и двух зондов (5'-FAM-CCCGTCCTCATGCCC-RTQ-3' и 5'-R6G-CCCGTCCCCATGCCC-FQ-3'), несущих «гаситель» на З'-конце и разные флюоресцентные красители (FAM и R6G) на 5'-конце. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала 40 — 100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100 — 200 нМ Taqman-зондов, коньюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ-ные dNTP, амплификаци-онный буфер, термостабильную Taq-полимеразу — 0,5 ед.акт./реакц.
Амплификация проводилась с помощью ампли-фикатора iCycler iQ5 (Bio-Rad, США) в следующих условиях: начальная денатурация 3' при 96 °С; затем 40 циклов, включающих денатурацию при 96°С - 8'', отжиг праймеров и последующую элонгацию при 60 °С — 35'' (каждый шаг сопровождался регистрацией флюоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующим интервалам флюоресценции флюорофоров FAM и R6G).
Полиморфизм генов IL1RN (VNTR интрона 2) изучали с помощью аллель-специфичной ПЦР с последующей детекцией в электрофорезе. VNTR аллели в гене IL1RN, обозначали следующим образом: аллель IL1RN*1 содержал четыре тандемных повтора по 86 н.п.; аллель IL1RN*2 — два тандемных повтора; аллель IL1RN*3 — пять тандемных повтора; аллель IL1RN*4 три тандемных повтора.
Типирование SNP полиморфизмов генов IL1B (rs1143634) и IL6 (rs1800795) проводили с помощью
сайт-специфической рестрикции ферментом TaqI (ООО «СибЭнзим», г. Новосибирск) продуктов ПЦР с последующей детекцией в электрофорезе. Детальное описание генотипирования полиморфизмов К1В, IL1RN, 1Ь4 и К6 приведено в работах [7, 8].
Частоты аллелей и генотипов полиморфных ло-кусов, а также соответствие распределения наблюдаемых частот генотипов исследуемых генов теоретически ожидаемым по равновесию Харди-Вайнберга проверяли по критерию х2. Вычисление проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия, Ы1р://Шд2. helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl).
Попарное сравнение частот генотипов К1В, IL1RN, TNFA и К6 и их сочетаний в изучаемых группах проводили при помощи четырехпольной таблицы сопряженности с поправкой Йетса на непрерывность вариации при числе степеней свободы, равном 1, а также двустороннего точного теста Фишера, если значение хотя бы в одной ячейке таблицы сопряженности было меньше 5 (ППП ’^ТАТ^ТЮА 6.0", номер серии: № 31415926535897). Ко всем экспериментально установленным значениям уровня значимости была применена поправка Бонферрони. Отличия между группами считали статистически значимыми, если экспериментально установленные значения уровня значимости были меньше уровня значимости по Бонферрони:
0,05
Р <----
т
где т — количество независимых статистических тестов на уровне значимости а.
Силу ассоциации анализируемых признаков определяли с помощью величины отношения шансов (OR). Для OR рассчитывали доверительный интервал (С1) при 95 % уровне значимости. Ассоциацию считали: отрицательной, если OR было меньше 1; нейтральной (отсутствующей), если OR было равно 1; положительной, если OR было больше 1. Коэффициент OR высчитывали только для значимых по Бонферрони экспериментальных результатов.
результаты исследования и обсуждение
Анализ распределения частот генотипов К1В, IL1RN, Т^А и К6 у женщин изучаемых групп показал их соответствие ожидаемым частотам при равновесии Харди-Вайнберга (р > 0,05).
Характер распределения частот генотипов генов К1В (^1143634), IL1RN интрон 2), Т^А
(^1800629) и К6 (ге1800795) у женщин изучаемых групп в нашем исследовании в целом соответствовал результатам других авторов относительно характера их распределения у жителей Западной Сибири [5, 9].
На первом этапе методом «случай-контроль» отдельно изучали ассоциации материнских генотипов К1В (^1143634), IL1RN интрон 2), ТША
(^1800629) и К6 (^1800795) с НБ инфекционного генеза. Данные представлены в таблице 1.
Наше исследование показало, что отдельно для полиморфных вариант генов К1В, IL1RN и К6
статистически значимые ассоциации с НБ инфекционного генеза у женщин отсутствовали (табл. 1). В то же время установлена единственная высоко значимая положительная ассоциация генотипа АА гена TNFA (^1800629) с НБ инфекционного генеза. Так генотип АА гена TNFA значимо чаще встречался у женщин группы НБ в отличие от женщин контрольной группы (21,8 % против 0 %, соответственно; х2 = 13,70, р = 0,0004, с учетом поправки Бонферрони рсог = 0,0016). Носители этого генотипа имели высокую вероятность развития НБ инфекционного генеза, значение OR для них составило 47,3 (С1 95%: 20,6—108,3).
На втором этапе изучали ассоциации сочетаний генотипов К1В (^1143634), IL1RN интрон
2), Т^А (ге1800629) и К6 (^1800795) у женщин с НБ инфекционного генеза. При сопоставлении частот комбинаций генотипов К1В, IL1RN, Т^А и К6 в группе НБ и контроль было установлено, что для четырехчленных и трехчленных комбинаций генотипов изучаемых генов цитокинов какие-либо ассоциации с НБ отсутствовали. Однако при сопоставлении двухчленных комбинаций генотипов К1В, IL1RN, Т^А и К6 была выявлена единственная значимая положительная ассоциация сочетания
генотипа Д,^№1/*1 с генотипом GG гена Д.6. Сочетание генотипа Я,^№1/*1 с GG гена К6 чаще выявлялось у женщин группы НБ, чем в контрольной группе (55,6 % против 13,8 % в контроле, х2 = 11,63, р = 0,0006, с учетом коррекции по Бонферрони (18 статистических тестов) рсог = 0,011). Сочетание генотипов *1/*1 гена IL1RN и GG гена К6 может в 7,3 раза повышать вероятность развития НБ инфекционного генеза у женщин (С1 95 %: 3,2 — 16,7).
Выявленная нами ассоциация генотипа АА гена Т^А (^1800629) с НБ инфекционного генеза согласуется с данными литературы, где ранее сообщалось о связи аллеля (-308)А гена Т^А с НБ (мета-анализ) [14], с преждевременными родами у женщин с бактериальным вагинозом [13], а также с развитием эндотелиальной дисфункции у женщин при гестозе [4].
Следует отметить, что в литературе дискутируется взаимосвязь генотипов *1/*1 гена IL1RN и GG гена К6 с НБ. С одной стороны, в качестве маркера НБ у женщин чаще рассматривается генотип *2/*2 гена IL1RN [11]. С другой стороны, выявлено, что женщины с генотипом *1/*1 имеют низкую концентрацию вагинального белка ^1-Яа [11]. Предполагается, что они могут быть более чувствительны к инфекции и
Таблица 1
Частоты генотипов и аллелей полиморфизмов генов ^1Б, IL1RN, TNFA и ^6 у женщин с физиологическим течением беременности и женщин с НБ инфекционного генеза
Группа МБ (^1143634)
Генотипы
1Т
контроль 6 (5,2) 45 (38,8) 65 (56,0)
НБ 2 (5,4) 16 (43,2) 19 (51,4)
уровень статистической значимости, р 1,000 0,7729 0,7575
Группа IL1RN (VNTR, интрон 2)
Генотипы
*1/*1 *1 /*2 *1/*3 *2/*2
контроль 65 (48,8) 44 (40,1) 0 6 (7,0)
НБ 19 (55,9) 13 (38,2) 2 (5,4) 2 (5,9)
уровень статистической значимости, р 0.8960 0.8429 0.0556 1.0000
Группа ГЫРА (гб1800629)
Генотипы
AA GA GG
контроль 0 20 (25,3) 59 (76,7)
НБ 5 (21,8) 7 (30,4) 11 (47,8)
уровень статистической значимости, р 0,0004 сог 0,0016 0,8250 0,0287 сог 0,115
Группа ^6 (^1800795)
Генотипы
GC GG
контроль 40 (34,5) 57 (49,1) 19 (16,4)
НБ 6 (16,2) 18 (48,6) 13 (35,2)
уровень статистической значимости, р 0,5690 0,8910 0,0271 сог 0,108
примечание: в скобках указана доля генотипов (%) от общего числа обследованных в данной группе.
повышенной секреции других провоспалительных цитокинов, и это, в свою очередь, отражается на ранних потерях плода или преждевременных родах [14]. У женщин генотип GG гена IL6 (rs1800795) связан с высоким риском преждевременных родов, не имеющих ассоциации с внутриутробной инфекцией [12], однако, его связь с НБ обсуждается [16]. Установлено, что люди с генотипом GG гена IL6 (rs1800795) характеризуются высокими плазматическими уровнями белка IL-6 - основного медиатора воспаления, при этом сам генотип GG является маркером ряда аутоиммунных и воспалительных заболеваний [1]. Исходя из данных литературы и собственных результатов, является очевидным, что репродуктивные потери у женщин с сочетанием IL1RN*1/*1, IL6*GG могут быть связаны с их генетически детерминируемой высокой восприимчивостью к урогенетальной инфекции, при этом данное сочетание может более, чем в 7 раз повышать вероятность развития НБ инфекционного генеза у женщин.
В целом, полиморфные варианты генов TNFA (rs1800629), IL1RN (VNTR интрон 2), и IL6 (rs1800795) вносят определенный вклад в развитие инфекционной формы НБ. В дальнейшем планируется провести такую работу на больших выборках с привлечением большего спектра генов-модификаторов иммунного ответа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Виноградова С.В. Роль полиморфизма генов цитокинов в развитии заболеваний печени // Сучасна гастроентерология. — 2004. — № 5. — C. 15 — 20.
2. Громова А.Ю., Симбирцев А.С. Полиморфизм генов семейства IL-1 человека // Цитокины и воспаление. — 2005. — № 4. — С. 3—12.
3. Левкович М.А. Современные представления о механизмах формирования иммунного ответа при угрозе прерывания беременности инфекционного ге-неза // Рос. иммунол. журн. — 2010. — № 4. — С. 415.
4. Радьков О.В., Калинкин М.Н., Заварин В.В. Влияние полиморфизма генов цитокинов на формирование дисфункции эндотелия при гестозе // Цитокины и воспаление. — 2010. — № 3. — С. 15 — 18.
5. Рудко А.А., Кондратьева Е.И., Янкина Г.Н. Полиморфизм генов-модификаторов иммунного ответа: влияние на развитие целиакии и варианты ее клинического течения в Томской области // Молекулярная биология. — 2008. — № 1. — С. 42 — 49.
Сведения об авторах
6. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. — М.: Триада Х, 2002. — 305 с.
7. Шабалдин А. В., Гордеева Л.А, Глушкова О.А. Полиморфизм генов HLA DRB1*, IL1Ra*, и IL1 р у женщин с репродуктивными нарушениями // Рос. иммунол. журн. — 2008. — № 1. — С. 63 — 69.
8. Шабалдин А.В., Гордеева Л.А., Глушкова О.А. Ассоциации сочетаний генов HLA DRB1*, IL4*, IL6* с репродуктивными потерями у женщин // Иммунология. - 2008. - № 3. - С. 132-137.
9. Шевченко А.В., Голованова О.В., Коломей-чук М.Ю. Полиморфизм промотерного региона генов IL-4, IL-6 и IL-10 у пациенток с раком молочной железы // Мед. иммунология. - 2009. - № 11. - С. 21-28.
10. Ширшев С.В. Механизмы иммунноэндокринного контроля процессов репродукции. -Екатеринбург: УрО РАН, 2002. - Т. 2. - 557 с.
11. Barton P.T., Gerber S., Skupski D.W., Wit-kin S.S. Interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism, vaginal Interleukin-1 receptor antagonist concentrations, and vaginal Ureaplasma urealyticum colonization in pregnant women // Infect. Immun. -2003. - Vol. 71 (1). - P. 271 -274.
12. Hartel Ch., Finas D., Ahrens P. Polymorphisms of genes involved in innate immunity: association with preterm delivery // Mol. Hum. Reprod. - 2004. -Vol. 10, N 12. - P. 911-915.
13. Macones G.A., Parry S., Elkousy M. A polymorphism in the promoter region of TNF and bacterial vaginosis: preliminary evidence of gene-environment interaction in the etiology of spontaneous preterm birth // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2004. - Vol. 190. - P. 1504-1508.
14. Medica I. Association between genetic polymorphisms in cytokine genes and recurrent miscarriage - a meta-analysis // Reproductive BioMedicine Online. - 2009. - N 3. - P. 406-414.
15. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. In: Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor, Lab. Press., 1989. - P. 17-19.
16. Unfried G., Bocskor S., Endler G. A polymorphism of the interleukin-6 gene promoter and idiopathic recurrent miscarriage // Hum. Reprod. -2003. - Vol. 18. - P. 267-270.
17. Witkin S.S., Gerber S., Ledger W.J. Influence of interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism on disease // Clin Infect Dis. - 2002. -Vol. 34. - P. 204-209.
Попова Ольга Сергеевна - младший научный сотрудник лаборатории иммуногенетики ИЭЧ СО РАН (650065, г. Кемерово, пр-т Ленинградский, д. 10; тел.: (3842)545952; e-mail: olmak06@mail.ru)
Гордеева Людмила Александровна - заведующая лабораторией иммуногенетики ИЭЧ СО РАН, кандидат биологических наук (650065, г Кемерово, пр-т Ленинградский, д. 10; тел.: (3842)545952; e-mail: gorsib@rambler.ru, ihe@kemtel.ru) Шаталина Ирина Викторовна - инженер-технолог лаборатории иммуногенетики ИЭЧ СО РАН (650065, г. Кемерово, пр-т Ленинградский, д. 10; тел.: (3842)545952; e-mail: ihe@kemtel.ru)
Нерсесян Светлана Львовна - заведующая медико-генетической консультации КОКБ (650000, г. Кемерово, пр. Октябрьский, 22; тел.: 8 (3842) 396023)
Оленникова Римма Витальевна - врач-генетик КОКБ Медико-генетическая консультация (650000, г. Кемерово, пр. Октябрьский, 22; тел.: 8 (3842) 396023)
Филипенко Максим Леонидович - заведующий группой фармакогеномики ИХБФМ СО РАН, кандидат биологических наук (630090, г. Новосибирск, пр-т Академика М.А. Лаврентьева, д. 8; тел.: (383-3) 33-35-71, (383-3)33-35-71; e-mail: max@ niboch.nsc.ru)
Глушков Андрей Николаевич - директор ИЭЧ СО РАН, доктор медицинских наук (650065, г. Кемерово, пр-т Ленинградский, д. 10; тел.: (3842) 575079)
