CC BY
22УДК 582.282.123.4:616.596-002.828
ASPERGILLUS PERSH А.М. КОРТЕ И М. ЗОТТИ - НОВЫЙ ВИД И ВОЗБУДИТЕЛЬ ОНИХОМИКОЗА У ЧЕЛОВЕКА И ASPERGILLUS TANNERI К. ДЖ. КВОН-ЧУНГ, ДЖ.А. СУГУИ И С.У. ПЕТЕРСОН - НОВЫЙ ВИД И ВОЗБУДИТЕЛЬ ИНВАЗИВНОГО РЕФРАКТЕРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ
Елинов н.П. (профессор кафедры)*
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова (кафедра медицинской микробиологии), Санкт-Петербург, Россия
© Елинов Н.П., 2014
В статье представлены материалы о новых видах аспер-гиллов - Aspergillus persii, вызывающим онихомикоз у человека, и Aspergillus tanneri, вызывающим инвазивный аспергиллёз (ИА) у лиц с хроническим гранулематозным заболеванием (ХГЗ). Рассмотрены их микро- и макроскопические характеристики клеток и колоний, выросших на разных питательных средах и при различных температурах, систематическое положение в ряду близко родственных видов и родов микромицетов, активность против них ряда антимикотиков.
Я надеюсь, что представленные материалы будут интересными и полезными российским микологам.
Ключевые слова: Aspergillus persii, А. tanneri, инвазивный аспергиллёз, микро- и макроскопические характеристики видов, номенклатура, онихомикоз, хроническое гранулематозное заболевание
Контактное лицо: Елинов Николай Петрович, тел.: (812) 303-51-40
ASPERGILLUS PERSII A.M. KORTE AND M. ZOTTI - NEW SPECIES AND PATHOGEN OF ONYCHOMYCOSIS AT MAN AND ASPERGILLUS TANNERI K.J. KWON-CHUNG, J.A. SUGUI & S.W. PETERSON - THE NEW EXCITER OF INVASIVE ASPERGILLOSIS IN PATIENTS WITH CHRONIC GRANULOMATOUS DISEASE (CGD)
Yelinov N.P. (professor of the chair)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov (Chair of оf Medical Microbiology), St. Petersburg, Russia
© Yelinov N.P., 2014
Materials of Italian authors about Aspergillus persii inducing the onychomycosis at man, and american (USA) scientists - about A. tanneri - the new exciter of invasive aspergillosis have surveied in this article. Micro- and macroscopic characteristics of cells and colonies grown in different nutrient media under various temperatures; systematic position in a row of closely related of species and genera of micromycetes, the activity against Aspergillus persii and A. tanneri of some antimycotics have been considered in presented work. I hope that presented materials shall be interest and useful for Russian mycologists.
Key words: antimycotics, Aspergillus persii, A. tanneri, chronic granulomatous disease, invasive aspergillosis, macro- and microscopic characteristics of species, nomenclatura, onychomycosis
В последние годы ряд авторов нередко сообщают о возрастающей роли недерматомицетов в заболеваниях кожи и её придатков и, прежде всего, ногтей [1-5; Zotti M., Montemartini Corte A.M. //My-conaxon, 2002. - Vol. 83]. В журнале «Медицинская микология» [1] была опубликована статья группы итальянских авторов (Мирка Зотти, Марко Макетти, Маддалена Перотти и др.) о новом виде аспергилла - Aspergillus persii; очевидно, что название вида связано с фамилией последнего соавтора. Несколько ранее Мирка Зотти и Аврора Монтемартини Корте [Zotti M., Montemartini Corte A.M. //Myconaxon, 2002. - Vol. 83] выступили со статьёй «Aspergillus persii: новый вид в секции Circumdati- важной группы в пределах родов Petromyces (Malloch и Cain, 1972) и Neopetromyces (Frisvad и Samson, 2000) и в пределах анаморфного рода Aspergillus. Фрисвад и коллеги [3] включили A. persii в число 21 других видов аспер-гиллов, продуцирующих охратоксин А. Он также об-
■
разует пеницилловую кислоту, ксантомегнины, мел-леин. Данный вид изолирован в 1999 от женщины в возрасте 61 года, поражённой и страдавшей от они-хомикоза ещё 20 лет тому назад (Рис. 1, 2).
Рис. 1. Онихомикоз большого пальца левой стопы; проксимальное и левостороннее поражение ногтя с кератозом
Рис. 2б. Септальное «дубинкоподбное утолщение» в нити Aspergilluspersii на дрожжевом агаре Чапека (CYA) при 25 оС (х100)
Рис. 2. Aspergillus persii в культуре на модифицированной среде Сабуро (1% неопептона, 1,5% агар-агара, 2% глюкозы)
Виду присущи такие характеристики, как образование склероциев и дубинкоподобных образований мицелия, которые вполне особенные, и поэтому авторы предположили, что должен быть предложен новый вид A. persii (Рис.2а-в).
Рис. 2в. Сферические головки (10-25 мкм в диаметре) у Aspergillus persii (х100) с двурядными свободно расположенными (до радиальных) стеригмами, несущим и овальные конидии, гладкие 2,5-3 мкм в диаметре
Колонии гриба культивировали на 4 агаризован-ных средах с выдержкой при разных температурах (при +20 оС, + 24 оС и + 37 оС) - на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), Чапека-Докса и Сабуро (Рис. 3). На рисунке в верхнем ряду, обозначенными заглавными буквами A,B,C,D, представлены колонии с лицевой (наружной) стороны; в нижнем ряду прописными буквами a,b,c,d обозначены те же колонии с обратной (реверсной - от лат. reverse - обратный) стороны.
Рис. 2а. Микроскопический препарат материала из ногтя
в растворе калия гидрооксида, в котором видны нити мицелия с «дубинкоподобными утолщениями» у Aspergillus persii (х100)
Рис 3. Колонии Aspergillus persii на разных питательных средах: снимки с поверхности, обозначенные заглавными буквами (слева ^направо): A,B,C,D, а прописными буквами - a,b,c,d - c реверсной (обратной) стороны: Аа - на среде Чапека-Докса при 24 оС; Bb - на дрожжевом агаре Чапека при 20 оС; Сс - на агаре Сабуро при 37 оС; Dd - на дрожжевом агаре Чапека при 24 оС
На среде Чапека-Докса при + 24 оС (чашка А,а) в точках посева «рост» проявляется в виде небольших двояковогнутых сфер; на среде СУЛ при + 20 оС - колонии выпуклые с кратеровидным центром, окаймлённым выпуклым ободком [реверсная сторона - Ь представляет собой «зеркальный негатив» наружной (лицевой) стороны. На агаре Сабуро (чашка С,с) при + 37 оС - колонии круглые, с углублёнными бороздками, идущими от центра колонии к периферии, формируя некое подобие заглавной буквы Ж; оборотная сторона колоний представляется негативом с выпуклыми рубцами в форме той же буквы Ж. На среде СУЛ (чашка при + 24 оС - колонии крупные (в 1,5-2 раза больше, чем на той же среде, но при + 20 оС; они выпуклые с углублённым, окаймлённым центром, от которого отходят бороздки к краю колонии; оборотная сторона с «зеркальным негативом» (с углублением) на месте колоний. Культура А. реки из поражённого ногтя на модифицированной среде Сабуро образует пигмент жёлтого цвета и показана на рис.4.
Рис. 4. Схематичный рисунок аспергилла с обозначенными частями его структуры: 1) большая часть головки, где возникают стеригмы с конидиями; 2) меньшая часть головки, свободная от стеригм с конидиями (апофизис);
3) опорная клетка
Конидиальные головки сферические, стеригмы двухрядные продолговатые с терминальными овальными конидиями. Апофизная часть у головок А. реки отсутствует (от англ. Аро - приставка «прочь от», отделённый; рЬув1дие= А'-гёк' - развитие и структура, организация тела) (Рис.5).
100
100
m — Asp
I_Asperg
100
90
93 ► SS • 5>+
100
— Aspergillus hei eromorphns CBS 117.55 T I Aspergillus ellipliais CRS 707.79 T 1 Aspergillus ellipliais CBS 677 79 Aspergillus Oirbonari us I iis 101697 Aspergillus earbonarius COS 11 1.26 NT Aspergillus cfrbonarius CBS 116.49 gillus earbonarius CBS 126.49 Aspergillus sdervlioniger CBS 115572 T Aspergillus laClkoßealus CEJS 101SE3 T Aspergillus luCtkuffeatusCÜS 101SE4 Aspergillus nigerCTtS IOI693 Aspergill us niger C R S 5 5 7.65 Aspergillus nigerCWs 420.64 Aspergillus niger C R S 101 705 Aspergillus nigerCRS 101699 Aspergillus laelfcoJjealusi'BS 1013E6 ■ Aspergillus nigerCBS6IB.7B Aspergillus niger CBS 554.65 T Aspergill US niger CBS 120.49 — Aspergillus bri&iiiensis CRS 101 7+0 Aspergillus vadenSis I BS 113365 T Aspergillus lubingensis CBS 134.48 T Aspergillus lubingensis ('RS 136.52 Aspergillus I ubingensis C R S 42 5.65 Aspergillus I ubingensis C El S 126.52 ■ Aspergillus lubingensis CBS 161.79 Aspergillus lubingensis COS 1 15657 Aspergillus lubingensis CBS 117.32 I Aspergillus firelhlus CBS 564.65 T Jl- Aspergiliusfoetiiius CBS 565.65 L Aspergillus piper is CBS 11 2EI I T '— Aspergillus coslarktiensis CBS 115574 T
100
Aspergillus hornornorphus CBS 101889 Aspergillus hvmomorphus CRS 101 8K8 j ■ Aspergillus "aCulealuS" CBS 620.7 В
73 ~- Aspergillus "aCulealuS" CBS I 14.80
j~ Aspergillus aculeatus CBS 119.49 ~ Aspergillus aculeatus CRS 172.66 T Aspergillus japonic us CBS II 5.SO Aspergillus japonkusCUS II3.4B Aspergillus japonkus CRS 568.65 Aspergillus japonkus CRS 61 I 78 Aspergillus japonkus CRS 101.14 Aspergillus japonkus CRS 522.89 Aspergillus japonkus С RS I 14.5 I T
- Aspergillus flav us С RS 100927 NT
— luchantes
Рис. 5. Одни из 500 равных МРТ 517 ступеней, базирующихся на эвристическом поиске частичных ß-глобулиновых последовательностей Aspergillus flavus как одного из рода.
Ветви отчётливо составляют 100% у 70% большинства, как правило, в соответствии с парсимонийными дрéвами.
Интенсивно окрашенный Aspergilluspersii, как и другие более окрашенные аспергиллы, являются продуцентами охратоксина А
Из других аспергиллов, описанных в качестве этиологических агентов онихомикоза, названы A. flavus, A. sclerotiorum и A. terreus, относящиеся к секциям Flavi, Circumdati и Terrei соответственно. Члены секции Circumdati, включающие A. sclerotiorum и A. persii, типично образуют головки с преобладающе двухрядными стеригмами с желтыми (или охряными или цвета кожи буйвола) конидиями (Klich M.A., et al, 1st ed. Utrecht: Centraalbureau voor Schimmelcultures, 2002). Субкультуры первого изолята A. persii были переданы в католический университет (Бельгия, MUCL 41970), в Centraalbureau voor Schimmelcultures, Нидерланды (CBS112795) и в Mycotheca университета в Турине, Италия (MUT 3318). Последовательность (сиквенс = sequence) генов ß-тубулина передана в GenBank (AY 819988) другими авторами [5]. При пер-
вом подходе к лечению пациентки применили так называемую «эмаль», содержащую 28% тиоконазола, но это оказалось явно недостаточным. Также разочаровывающим стало применение лака для ногтей с 5% аморолфина. Прибегнув к комбинированному лечению (местному - после тщательной чистки инфицированной части ногтевой пластины наносили мазь, содержащую 1% амфотерицина В, а per os назначали суточную дозу - 250 мг - тербинафина), удалось добиться желаемого эффекта через 3 месяца. Подобное лечение продолжали 2 года, когда пациентку признали избавившейся от онихомикоза и его возбудителя. Спустя почти 10 лет, эта же пациентка вновь заболела (заразилась, рецидив?!) онихомикозом в ноябре 2008 г., а в январе 2009 г. был определён и получен в культуре патоген, оказавшийся тем же видом A. persii. В тот же коллектив университета Генуя (Италия) [3] в июне 2006 г. обратился 56-летний мужчина с онихомикозом больших пальцев обеих ног. У пациента не было сахарного диабета и каких-либо иммунологических нарушений, но приобрёл онихомикоз в 2005 г., более выраженно проявившийся в 2006 г. Ногтевые пластины были дистрофическими. При микроскопии патологического материала гриб не был обнаружен, но получен в культуре на агаре Сабу-ро с глюкозой. В целях подтверждения образцов патогена проанализировали последовательность генов ß-тубулина. Вся геномная ДНК A. persii была выделена по инструкции от Qiagen DN easy Plant Mini Kit® (QIAGEN GmbH, Hilden, Германия). Амплификация гена ß-тубулина выполнена с использованием Bt2a и Bt2b праймеров [Glass N.L., Donaldson G.C. // Appl. Environ. Microbiol., 1995. - Vol. 61].
Амплификацию проводили в Biometra T3000 термоциклере (Goettingen, Германия), ДНК-сиквенирование - в Италии (DiNAMYCODE, Турин), Данными сиквенирования, вместе с морфологическими данными, подтвердили идентификацию A. persii. Живые культуры патогена от данного пациента также переданы в Нидерланды (CBS 124573) и в My-cotheca университет в Турине, Италия (MUT 4189). Последовательность генов ß-тубулина передана в GenBank (GQ850380). Пациенту назначили местную и системную терапию. Местно также, как и в первом случае с пациенткой, выполняли смягчение ногтевых пластин 50% раствором мочевины с последующим применением 5% аморолфиновой «эмали». При системной терапии ежедневно назначали 400 мг итра-коназола в течение одной недели в месяц и так - 6 месяцев (пульс-терапия). После проведенного лечения больной клинически выздоровел, однако, к сожалению, в феврале 2009 г. ногти на больших пальцах вновь «заболели» - в ногтевых пластинах обнаружили A. persii. На предложение начать вторую лечебную попытку пациент отказался.
Очевидно, что в каждом из приведенных случаев возможны 4 объяснения: 1) выраженно торпидное (вялое) течение окончательно недолеченного заболевания (онихомикоза); 2) долговременно отсрочен-
ный рецидив за счёт ослабленных, но до конца не убитых, особей патогена в оставшейся, кажущейся здоровой, ногтевой пластине; 3) повторное заражение ногтя(-ей) за счёт контакта пациентов; в этом(-их) случае(-ях) необходимо проведение тщательного исследования эпидемиологической ситуации (первоисточником патогена может быть домашняя обувь (!?); 4) неадекватность выбора антимикотика. Штаммы A. persii - изоляты (1) от 1999 г (от пациентки -женщины в возрасте 61 г.) и (2) от 2006 г. (от пациента-мужчины 56 лет) проверены на чувствительность к антимикотикам [3] (таблица 1).
Таблица 1
Чувствительность A. persii к ряду антимикотиков
A. persii № MM (мкл/мл) M38A2/YeastOne МИК (мкл/ мл) М38А2 ТERB
Am FZ IZ VZ POS CAS*
1 8/8 >256/>256 0,5/1 1/0.5 0,5/1 >16/>16 0,5
2 16/8 >256/>256 1/1 0,5/0,5 1/1 >16/>16 1
Примечание:* MEC^^^) М38А2/М1С(мкл/мл) YeastOne.
Am = амфотерицин В; FZ = флуконазол, IZ = итрако-назол; VZ = вориконазол; POS = позаконазол; CAS = ка-спофунгин; TERB = тербинафин; М38А2 = CLSI документ; YeastOne ®Sensititre метод.
Как следует из таблицы, оба штамма A. persii были чувствительны к вориконазолу, итраконазолу, поза-коназолу и тербинафину с небольшим различием между двумя применёнными методами - микроразведения в бульоне (Clinical and Laboratory Standards Institute: Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing Filamentous Fungi. Approved Standard, 21nd ed. M-38-A2.V.28, #16.Wayne, IN: National Committee Laboratory Standards, 2002) в соответствии с документом CLSIM38-A2, используя питательную среду RPMI 1640 c добавлением 2% глюкозы, и метод Sensititre Yeast One' панель (Trek Diagnostic Systems). Инкубирование разведений и панели проводили при 35 оС с учётом результатов через 2 и 3 суток. Из названного ряда препаратов «выпадают» по активности флуконазол и каспофунгин; первый из них в достаточно большой концентрации ингиби-ровал рост A. persii лишь на 50%, а минимальная эффективная концентрация (МЭК) каспофунгина была определена как самая малая, при которой всё же был отмечен анормальный рост тестируемого микроми-цета. Контролями в данных экспериментах (метод микроразведения) служили Aspergillus flavus ATCC и A. fumigatus ATCC 204305. Результаты с ними оказались в пределах, отмеченных и рекомендованных. Frisvad J.C., Frank J.M. c коллегами [3] прибегнули к кладистике, или филогенетической реконструкции, то есть методу систематики, нацеленному на воспроизведение генеалогического происхождения организмов посредством объективного и воспроизводимого анализа, а из этого образца предложить искусственную гипотезу естественной классификации, или филогении. Она основывается на трёх следую-
щих фундаментальных предположениях:
1) таксоны объединяют в естественные группы на основании долевого участия в производимых характеристиках (синаноморфии);
2) все признанные группы должны происходить из единого предшественника (например, они являются монофилетическими), и что самый парсимо-нийный образец, требующийся, по крайней мере, в ряду ступеней для доказательства родства таксонов, является, очевидно, одним из самых корректных;
3) группы, определённые при использовании доли примитивных (первобытных) характеристик (simplesiomorphies), очевидно, должны быть пара-филетическими и, таким образом, не включают всех потомков предка. Авторы использовали второй метод - парсимонийного анализа последовательных данных, ограниченных до 500 равных более парси-монийных древ (MPT= mostparsimonions trees), один из которых показан в филограмме (Рис. 5). Древо за-коренено на Aspergillus flavus.
A. tanneri - возбудитель хронического гранулема-тозного инвазивного заболевания, впервые описанного группой исследователей из США [6]. Видовой эпитет «tanneri» авторы дали с позволения семьи второго пациента, страдавшего и погибшего от ХГ, инфицированного штаммом NIH1004, и выделенного из легочного биоптата; другой штамм NIH1005 был изолирован из гнойного свища в желудке первого пациента. И, если в 2007 г. в роде Aspergillus насчитывали 200 видов, то в последние 6 лет к ним добавили ещё 2 вида, отнесенных к секции Circumdata. С 1981 г. и до настоящего времени всего описано 10 видов аспергиллов как возбудителей инвазивного хронического гранулематозного заболевания, и во всех таких случаях исходы для пациентов оказались летальными. Такими видами стали: A. calidoustus, A. flavus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. qudrilineatus (Emericella qudrilineatus), A. tanneri, A. terreus, A. udogawae (Neosartorya udogawae) и A. viridimutans.
Применительно к A. tanneri, культуры были изолированы от двух пациентов, наблюдаемых согласно протоколам, одобренным Советом Национального института аллергии и инфекционных заболеваний в составе NIH (национальные институты здравоохранения в г. Бетезда, США).
Первый пациент - юноша 17 лет, у которого с семимесячного возраста выявили остеомиелит, индуцированный Staphylococcus aureus (сплайсинговая мутация экзона 6, отсутствие продукции супероксида). Пациента профилактически поддерживали антибиотиками и у-интерфероном.
В восемь лет он перенёс бактериемию Klebsiella sp. после аппендэктомии. Позже, в возрасте 12, 13 и 15 лет, страдал от рекуррентной пневмонии, «отвечающей» на эмпирическое лечение антибиотиками. В 16 лет у пациента была диагностирована грибковая пневмония с плевральной эффузией (излиянием), медиастинальным абсцессом и сдвигом к печени и селезёнке. Удаление абсцесса из печени и спленэк-
томию сопровождали агрессивным лечением АмфВ, итраконазолом, вориконазолом и каспофунгином. Кроме того, были проведены трансфузии гамма-интерферона и гранулоцитов. Несмотря на интенсивную терапию, инфекция прогрессировала и диссе-минировала дальше. Лихорадка, нарушение дыхания и эдема (отёк) достигали высшей точки в респираторной недостаточности, связанной с массивной лёгочной инфекцией. Изоляты грибов из биоптатов лёгких, печени, селезёнки и фистул желудка, а также БАЛ (бронхоальвеолярного лаважа) выделяли идентичные колонии неспорулирующей белой плесени. При аутопсии показаны неисчислимые абсцессы в лёгких, печени, средостении, брюшной полости, с множественными адгезиями, интенсивными воспалительными инфильтратами и некрозом. GMS (Го-мори метенамин серебра) - окрашиванием тканевых секций показаны септированные пряди гиф с ветвлением или без него.
Второй пациент - юноша 19 лет был с диагностированным хроническим гранулематозным заболеванием (ХГЗ) в двухмесячном возрасте (большой интерстициальный пробел целых CYB и ХК генов, дающий выход фенотипа McLeod'a, отсутствие продукции супероксида).
В возрасте двух лет он получал противотуберкулёзные лекарства для лечения медиастинальной аде-нопатии и предполагаемого туберкулёза.
В восьмилетнем возрасте оп предстал с пневмонией правой верхней доли, в которой рос Phaeoacremonium inflatipes, который отвечал на лечение АмфВ и итраконазолом.
В возрасте 13 лет ему потребовались расширение мочеточника и замена резинового стента. Он также имел цервикальную аденопатию, обусловленную Serratia marcescens.
В возрасте 17 лет у пациента была выявлена пневмония правой верхней доли вследствие гемоптизиса (кровохаркания из дыхательных путей), в течение которого он получал вориконазол с постепенным рентгенографическим улучшением.
В 18 лет, ещё во время лечения вориконазолом, у него был новый эпизод пневмонии, который сопровождался дополнительным лечением широкоспектральными антибиотиками. Однако продолжались кашель, перемежающее кровохаркание, потеря веса и лихорадка. Было добавлено лечение позакона-золом. Из БАЛ выделяли культуру (штамм) белой плесени, напоминающую таковую, изолированную от первого пациента. Микафунгин, амбизом, вори-коназол, тербинафин и альбендазол были добавлены к лечебному режиму без устойчивого успеха. Чтобы смягчить серьёзные лёгочные ограничения на функцию лёгких посчитали своевременной обширную инфильтрацию, наблюдаемую при компьютерной томографии (КТ). В образце лёгочной ткани, взятом через игольную биопсию, вырастала та же плесень, которую изолировали из БАЛ. Пробное лечение внутривенно вводимым пентамидином, базируясь на
его активности на модели фузариоза у мышей [7], сопровождалось временно изменяющимся ментальным статусом. Образцы биоптатов лёгких и грудной стенки содержали многочисленные гифы.
Экспериментальная инфекция. Опыты были проведены с одобрения и досмотром со стороны специального комитета при US NIH. Вирулентность A. tanneri NIH 1004 сравнивали с вирулентностью A. fumigatus штамм В-5233 на двух ХГЗ моделях у мышей, заражаемых свежесобранными конидиями путём фарингеальной (глоточной) аспирации [8]. ХГЗ-дефицитные мыши получали 2-104 и 5-103 КОЕ/мышь соответственно. Эти концентрации инокулюма вызывали смертность до 80% и 100% в течение 10-15 суток ХГЗ-мышей, заражённых A. fumigatus В-5233. Сроки выживания мониторировали до 80 суток после заражения. Данные выживания анализировали, используя long-ранг-тест. Лёгкие мышей подвергали гистопатологическому изучению в окрашенном гематоксилин-эозином и по Гомори (GMS метенами-ном серебра) состоянии.
Изоляты А. tanneri NIH 1004 и NIH 1005 были переданы в Agricultural Research Culture Collection Peoria (Illinois) под доступными номерами NRRL 62425 и NRRL 62426 соответственно. Голотип NIH 1005 (NRRL 62426) - высушенная колония, выращенная на агаре Чапека с солодовым экстрактом (МЕА - malt-extract agar), была передана в национальную коллекцию грибов (U.S. Department of Agriculture, Beltswille, MD) под доступным номером BPt882529.
ДНК-сиквенсы из NIH1004 переданы в GenBank под следующими доступными номерами: JN 853798, JN 896584, JN 896585 и JN 896586 для ITS (внутреннего транскрибируемого спейсера), Мст 7, RPB 2 Tasrl соответственно. Морфология колоний показана на рисунке 6, а микроскопическая картина - на рис. 7.
NIH1004
Рис. 6. Морфология колоний А. tanneri N141004 и N141005 на МЕА-агаре через 2 недели роста и развития при +25 оС, +30 оС и +37 оС
Рис. 7. Микроскопическая картина конидиеносцев и конидий A. tanneri NIH1004 и NIH1005. Конидиальные головки первого обозначены буквами А, С и D, а второго - В, E и F на МЕА агаре и на кукурузном агаре соответственно; шаровидные конидии с гладкими стенками в световом микроскопе обозначены в нижней части рисунка буквами G и Н
Характеристика нового вида Aspergillus tanneri K.J. Kwon-Chung, J.A. Sugui and S.W. Peterson sp. nov.
Колонии белого цвета, растут медленно на агаре Чапека, достигая размера 1,5-2 см в диаметре за две недели роста и развития при +25 оС; от 4 до 4,5 см
- при +30 оС и до 3 см - при +30 оС; субстратный мицелий тонкий и гиалиновый (по греч. hyalos - стекловидный). Колонии на МЕА-агаре росли и развивались быстрее - достигали 2,9-3 см в диаметре за 2 недели при +25 оС, от 6 до 7 см - при +30 оС и 4-5 см
- при +37 оС (см. рис 6). Субстратный мицелий возвышался, и колонии с возрастом становились слабо окрашенными в желтоватый цвет. Реверсная сторона колоний оставалась бесцветной. Конидиеносцы, редко формировались в темноте при +30 оС, но их образование повышалось с возрастом. Конидиенос-
цы гиалиновые, гладкие, длинные и тонкие, от 2 до 4 мкм в ширину, несущие гиалиновые, грушевидные или булавовидные головки, размером 5-7x7-10 мкм (см. рис. 7), метулы 1,5-3x4,8 мкм, покрывающие от половины до двух третей поверхности головки (см. на рис. 7 А, В, С, и Б), каждый несущий две или более стеригм (фиалид), иногда становящимися септиро-ванными, размером 1-2x4 до 10 мкм (см. на рис. 7 от А до Б). Конидии овальные, гиалиновые, гладкие, 2-3 мкм в диаметре (на рис. 7 G и Н). Миниатюрные конидиальные головки без расширенной части кажутся по структуре почти пенициллоподобными (см. на рис. 7 Б). Телеоморфу у А. Ьаппеп не наблюдали. Филогенетическое древо А. 1аппеп в сравнении с А. fumigatus приведено на рис. 8.
Рис. 8. Филогенетическое древо, выведенное из комбинированных Мст, КРБ2 и Тбг1 данного набора. Тонкой стрелкой отмечен А. fumigatus (секция Рит1дай), а тёмной - А. tanneri (секция Сксит^ай). Темные ветви соответствуют более чем 95% выгодному составу поддержки
Чувствительность Aspergillus tanneri к анти-микотикам.
Результаты определения чувствительности тест-культур A. tanneri и контрольных штаммов A. fumigatus представлены в таблице 2.
Таблица 2
чувствительность A. fumigatus и A. tanneri к вориконазолу, итраконазолу и амфотерицину В (АмфВ)
in vitro методом микроразведния clsí (м38-А2)
Штаммы МИКа (мкг/мл)
Вориконазол Итраконазол Амф В
A. tanneri (NIH 1005) 4 4 >16
A. fumigatus (B - 5233) 1 1 2
A. fumigatus (AF-293) 2 1-4 2
Неудача с ответами обоих пациентов на агрессивное антифунгальное лечение стала основой предположения о том, что новый вид мог быть природноу-стойчивым к существующим антимикотикам. Чтобы определить высоко ли резистентен A. tanneri к противогрибковым препаратам, авторы сравнили значения МИК для вориконазола, итраконазола и АмфВ. Для выполнения Е-теста конидии в количестве 3-106 на чашку Петри с агаризованной средой МЕА равномерно распределяли на поверхности среды, а тест-полоски были положены в центре перед инкубацией при +37 оС в течение 3 суток.
Для сравнения использовали также два референтных штамма A. fumigatus, широко применяемые для патобиологических исследований.
МИК для A. tanneri были значительно выше, чем к АмфВ и, вообще, к азоловым препаратам в сравнении с МИК для A. fumigatus (таблица 2). A. tanneri проявил интенсивный мицелиальный рост при содержании в среде 16 мкг/мл АмфВ.
Высокая устойчивость A. tanneri к антифун-гальным препаратам была также подтверждена и в Е-тестах (Рис. 9).
A. tanneri A. fumigatus
nih1004 nih1005 af293
2 Г 1 г
> L ШЁ H iL HI ^H
^^ ^шк В^ I
m
Рис.9. Чувствительность A. tanneri и A. fumigatus к вориконазолу и АмфВ по результатам Е-теста
При +37 оС в течение 72 часов A. fumigatus образовывал зелено-батистовую спорулирующую культуру, тогда как A. tanneri вырастал преимущественно в
виде тонкого белого цвета мицелия.
A. fumigatus штамм AF293 проявил большие светлые зоны задержки роста применительно к вориконазолу (МИК - 0,5 мкг/мл) и меньшую зону ин-гибирования роста для АмфВ (МИК - 1,5 мкг/мл). Напротив, зона задержки роста для вориконазола, также как и для АмфВ, отсутствовала на чашках Петри, засеянных A. tanneri.
Подобные результаты были получены со средой RPMI 1640. Е-тестами с позаконазолом и итракона-золом, выполненными на средах МЕА и RPMI 1640, показаны аналогичные данные высокой устойчивости A. tanneri в сравнении с A. fumigatus. Авторы полагают, что выявленные ими данные по высокой резистентности A. tanneri к антимикотикам могли способствовать получению неудачных результатов с терапией пациентов. Следует также отметить, что А. tanneri NIH 1004 и NIH 1005 не образуют охраток-сины.
заключение
Аспергиллы, в широком понимании рода Aspergillus, могут быть уникальными патогенами, являясь в то же время сапробами. Они колонизуют разные экониши и обитают в природных регионах Земного Шара на всех материках. Однако есть виды, колонизующие людей с иммунодефицитами, или иммунокомпрометированных лиц. Наиболее распространённым видом при этом оказывается A. fumigatus.
Достаточно сказать, что как возбудитель аспер-гиллёза он индуцирует более 200 000 случаев заболеваний среди населения Земного Шара.
К нему примкнули недавно открытые A. persii - возбудитель онихомикоза у людей (описанный итальянскими исследователями) и A. tanneri, рассмотренные в данной публикации. Из-за развивающегося туризма по всему миру не исключается завоз сравнительно редких патогенов и в нашу страну. В последнее десятилетие текущего века появляются работы, авторы которых пытаются связать особенности метаболизма (прежде всего - первичного обмена) болезнетворных аспергиллов и их патогенности (вирулентности); называют регуляцию утилизации потребляемого A. fumigatus азота; для проявления патогенности у некоторых мутантов Aspergillus sp. строго необходима пара-аминобензойная кислота (ПАБК) и др. [8]. При изучении аспергиллов-патоге-нов следует быть крайне внимательным к их видовой дифференциации и индикации, а экспериментаторам - стремиться привлечь и ауксотрофные виды к оценке их патогенности, равно как и особенности генома каждого вида или штамма.
цитированная литература
1. 1. Zotti M. Machetti M., Perotti M., et al. A new species Aspergillus persii as an agent of onychomycosis // Medical Mycology. - 2010. - Vol. 48. - P. 656-660.
2. 2. Bonifaz A., Cruz-Agular P., Ponce R.M. Onychomycosis by moulds // Eur. J. Dermatol. - 2007. - Vol. 17. - P. 70-72.
3. 3. Frisvad J.C., Frank J.M., Houbraken J.A.M., et al. New ochratoxin A producing species of Aspergillus section Circumdati // Stud. Mycol. - 2004. - Vol. 50. - P. 23-43.
4. 4. Gupta M., Sharma L.N., Kanga A.K., et al. Onychomycosis: clinic-mycologic study of 130 patients from Himachal Pradesh, India // Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. - 2007. - Vol. 73. - P. 389-392.
5. 5. Romano C., Cianni C., Difonzo E.M. Retrospective study onychomycosis in Italy: 1985-2000 // Mycoses. - 2005. - Vol. 48. - P. 42-44.
6. 6. Sugui J.A., Peterson S.W., Clark L.C., et al. Aspergillus tanneri sp. nov., a new pathogen that cause invasive disease refractory to antifungal therapy // J. Clin. Microbiol. - 2012. - Vol. 50, №10. - P. 3309-3317.
7. 7. Rao G.V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx// J. Toxicol. Environ. Health A. - 2003. - Vol. 66. - P. 1441-1452.
8. 8. Krappmann S. and Braus G.H. Nitrogen metabolism of Aspergillus and its role in pathogenicity // Med. Mycology Supplement. - 2005. - Vol. 43. - P. 531-540.
Поступила в редакцию журнала 02.06.2014 Рецензент: Степанова А.А.
