Апробация иммуноферментного анализа для серологической диагностики инфекций, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Апробация иммуноферментного анализа для серологической диагностики инфекций, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки*

Н.В. Абрамова1 (abnata83@mail.ru), Н.В. Рудаков1' 2 (rickettsia@mail.ru), Н.А. Пеньевская1, Н.Н. Седых3, Л.В. Кумпан1, И.Е. Самойленко2,

Т.А. Решетникова2, А.С. Оберт3, С.А. Рудакова2

1 Омская государственная медицинская академия

2 ФГУН «НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора, г. Омск

3 Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул

Резюме

Применение экспериментальных иммуноферментных тест-систем для обнаружения антител классов IgM и IgG к антигену R. sibirica subsp. sibirica в парных сыворотках крови позволяет верифицировать диагноз клещевого риккетсиоза у больных из Алтайского края в подавляющем большинстве случаев, в том числе при отрицательных результатах реакции связывания комплемента.

Впервые получены серологические данные, свидетельствующие о том, что в северных районах Омской области циркулирует как минимум два антигенных варианта риккетсий из группы клещевой пятнистой лихорадки, практически не вызывающих перекрестных серологических реакций. Один из них имеет антигенное сходство с R. sibirica subsp. BJ-90, а второй - с R. sibirica subsp. sibirica.

Ключевые слова: риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки, Rickettsia spp., клещевой сыпной тиф Северной Азии, иммуноферментный анализ

Approbation of Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Serologic Diagnostics of the Infections Caused Spotted Fever Group Rickettsiae

N.V. Abramova1 (abnata83@mail.ru),

N.V. Rudakov1,2 (rickettsia@mail.ru), N.A. Penyevskaya1, N.N. Sedih3, L.V. Kumpan1, I.E. Samoylenko2, T.A. Reshetnikova2, A.S. Obert3,

S.A. Rudakova2

1 The State Medical Academy of Omsk

2 Research Institute of Natural Focality of Diseases of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-Being of Omsk

3 Altai State Medical University of Barnaul Abstra€t

Application of experimental tests-systems for detection of IgM and IgG antibodies to R. sibirica antigens in pair blood serums has allowed verifying the diagnosis of tick-borne ricketsioses at patients from Altai region in overwhelming majority of cases, including at negative results of complement fixation test.

For the first time the data, testifying that in northern areas of Omsk region, are circulated, as a minimum, two antigenic variants of rickettsiae. These agents, one of which has antigenic similarity with R. sibirica subsp. BJ-90, and the second - with R. sibirica subsp. sibirica, practically do not cause cross serologic reactions.

Key words: spotted fever group ricketsioses, Rickettsia spp., tick typhus of Northern Asia, enzyme-linked immunosorbent assay

Введение

Исследования последних лет показали, что на территории России циркулирует несколько видов риккетсий из группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) с доказанной и пока не установленной патогенностью для человека [4]. Наибольшее эпидемиологическое значение имеют Rickettsia sibirica -этиологический агент клещевого риккетсиоза (КР, клещевой сыпной тиф Северной Азии) и риккет-сии генокомплекса R. conorii, вызывающие астраханскую пятнистую лихорадку. Отмечены единичные завозные случаи везикулезного риккетсиоза (возбудитель - R. akarii) [5]. Выявлен новый риккетсиоз, вызываемый R. heilongjiangensis, названный дальневосточным клещевым риккетсиозом [2].

Методами генотипирования получены данные, свидетельствующие о возможной этиологической роли R. helvetica в развитии острых лихорадочных заболеваний после присасывания клеща на территории Пермского края [3]. Вместе с тем изучение клинико-эпидемиологической роли патогенов рик-кетсиозной природы, как хорошо известных, так и новых, в значительной степени сдерживается отсутствием высокочувствительных и доступных методов серологической диагностики.

«Золотым стандартом» для диагностики риккет-сиозов является реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), рекомендованная ВОЗ [5]. Однако эта реакция достаточно трудоемка и не позволяет одновременно исследовать большое количе-

* Материалы статьи были доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы природной очаговости болезней» (к 70-летию теории академика Е.Н. Павловского о природной очаговости болезней), ноябрь 2009 г., Омск.

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010

ство проб. Наиболее распространенным методом, применяемым в практическом здравоохранении, остается реакция связывания комплемента (РСК), которая была предложена для диагностики риккет-сиозов еще в 1940-х годах. Коммерческие цельнорастворимые антигены для РСК позволяют с высокой специфичностью, но с умеренной чувствительностью выявлять комплементсвязывающие антитела (АТ) к R. sibirica. Однако для обнаружения АТ к риккетсиям других видов эти диагностикумы, по-видимому, менее пригодны [2].

В 1980-х годах для диагностики риккетсио-зов, вызываемых R. rickettsii, R. tsutsugamushi, R. prowazekii, R. conorii, было предложено использовать иммуноферментный анализ (ИФА) [5, 7, 8 - 10]. Применение этого метода ограничивалось сферой исследовательских работ в рамках специализированных риккетсиозных лабораторий, при этом авторы отмечали высокую специфичность и чувствительность ИФА для выявления АТ в низких титрах в сравнении с РСК и РНИФ [10].

Цель работы - апробация и изучение эффективности метода ИФА для серологической диагностики инфекций, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), циркулирующими на территории России.

Материалы и методы

Выявление антител в сыворотках крови пациентов проводили непрямым твердофазным вариантом ИФА (ИФА-IgM и ИФА-IgG). Для сенсибилизации полистироловых планшетов использовали цельнорастворимые антигены, приготовленные по общепринятой методике [1] с нашими модификациями из штаммов риккетсий следующих видов: R. sibirica subsp. sibirica (R. sibirica); R. sibirica subsp. BJ-90 (R. BJ-90); R. tarasevichiae; R. heilongjiangensis; R. raoultii; R. akarii. Эти штаммы, хранящиеся в коллекции Омского НИИПОИ, были изолированы нами из клещей в различных природных очагах Сибири, Алтая и Дальнего Востока. Исследуемые сыворотки разводили в 10 раз. В качестве конъюгатов использовали коммерческие антивидовые антитела к IgM и IgG человека. Оптическую плотность (ОП) субстратно-индикаторного раствора измеряли на спектрофотометре. Результат оценивали как положительный, если оптическая плотность анализируемой пробы была выше «отсекающего» значения (cut off), рассчитанного по формуле: (ОП1+ ОП2) / 2 + 0,2, где ОП1 - оптическая плотность контроля конъюгата, ОП2 - оптическая плотность «отрицательной» контрольной сыворотки.

После предварительной оптимизации условий выполнения ИФА для обнаружения противо-риккетсиозных АТ классов IgM и IgG было исследовано 276 сывороток крови пациентов из трех групп. Первая (референтная) группа состояла из 36 больных с типичной клинической картиной клещевого риккетсиоза, госпитализированных в инфекционное отделение МУЗ «Городская больница

№ 11 г. Барнаула» в эпидемический сезон (с мая по октябрь) 2006 и 2007 годов. Сыворотки крови от 15 больных КР были параллельно исследованы в ИФА и РСК с коммерческим диагностикумом. Вторая (контрольная) группа состояла из 80 клинически здоровых жителей г. Омска, обследованных вне эпидемического сезона КР. Обе группы были сопоставимы по возрастному и половому составу. В третью (опытную) группу вошли 58 лихорадящих больных Тарского района Омской области, обследованных по подозрению на клещевой энцефалит (КЭ) и иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) в мае - сентябре 2008 года.

Результаты и обсуждение

Результаты применения ИФА для обнаружения антител к антигенам различных видов риккетсий в сыворотках крови пациентов сравниваемых групп представлены в таблице 1. В контрольной группе только одна проба крови давала положительную реакцию на наличие АТ к антигену R. sibirica. С остальными пятью риккетсиозными антигенами для всех сывороток контрольной группы реакция была отрицательной. Результаты ИФА для обнаружения ^ к риккетсиям также продемонстрировали высокую специфичность метода. Ни одна проба ни с одним из исследуемых антигенов не давала положительных реакций.

В группе больных с типичной клиникой КР (референтная группа) с помощью ИФА в подавляющем большинстве проб удалось выявить АТ классов ^М и (или) ^ к антигенам различных видов риккетсий. В этой группе чаще всего обнаруживали АТ к антигену R. sibirica subsp. sibirica, что вполне закономерно, так как именно этот вид риккетсий является доминирующим в Алтайском крае. На втором месте по частоте положительных реакций - ИФА с антигеном R. тои^И, на третьем - с антигеном R. акаги, на четвертом - с антигеном R. tarasevichiae, на пятом -с антигеном R. heilongjiangensis. Только в одной из 65 проб наблюдали положительную реакцию в ИФА на ^М с антигеном R. ^Ыпса subsp. В]-90.

Антитела класса ^М к R. sibirica выявлены в среднем в 81,5% сывороток крови (чаще во второй, чем в первой - 86,2 и 77,8% соответственно); ^ к R. sibirica - в среднем в 69,2% сывороток крови (чаще в первой, чем во второй - 72,2 и 65,5% соответственно). В четырех случаях (как на фоне ^М, так и без них) отмечена обратная серо-конверсия ^ к R. sibirica.

Очень часто в одной и той же пробе обнаруживали антитела к двум и более риккетсиозным антигенам. В сыворотках крови только четырех больных КР выявляли ^М к единственному виду риккетсий - R. sibirica, тогда как ^М к антигенам других видов риккетсий выявляли всегда в сочетании с ^М к R. sibirica.

Количество положительных проб, содержащих ^ только к одному виду риккетсий, было несколько больше, чем при выявлении ^М. Причем «моно-

Таблица 1.

Частота обнаружения методом ИФА антител к различным видам риккетсий в сыворотках крови пациентов из Алтайского края и Омской области

Опытная группа О и> чО 0s СП +1 СО L0 +1 L0 +1 L0 о о с°, ы +1 ел СП о о

О Ю а о о со со

2 и> чО 0s lo Ы +1 СП 1^ СЧ +1 1^, о~ L°, СЧ +1 СП L0 +1 со CVJ, сч +1 ел оэ со +1 о, со о о

О V0 а сч ц СП со

Контрольная группа О и> чО 0s о о о о о о о о

О V0 а о о о о о о о со

2 и> чО 0s +1 СЧ о о о о о о о

о Ю а - о о о о о о со

Референтная группа О и> чО 0s 1^ L0 +1 СП CD СО со +1 СО СЭ со, +1 СО со со сч +1 со о о о о

О Ю а L0 СП о со о о L0 со

2 и> чО 0s СО +1 L0 СО О со +1 со со СП L0 +1 СО 00 со СО со +1 со, CD со сч +1 с°, L0 +1 и°, о о

о Ю а СО L0 со - L0 со

Виды риккетсий a ic iri ■Q si p. s b u s ica iri ibi si сс "3 o сс ri 3 a сс e ia hi ic e s ras со сс со si n e g n jia gji n lo ei h сс R. sibirica subsp. BJ-90 Количество исследованных сывороток

варианты» IgG обнаружены не только к R. sibirica, но и к R. tarasevichiae и R. akarii. Однако при этом у больных выявляли IgM к R. sibirica или обнаруживали IgG к R. sibirica, но в другой пробе крови.

| Aнтитела класса IgG к R. raoultii во всех слу-

| чаях обнаруживали вместе с IgG к антигенам не

го менее двух других видов риккетсий. Ни у одно-

so го больного не были обнаружены IgG к R. BJ-90

Л или к R. heilongjiangensis.

| Aнализ полученных данных позволил заключить,

g что для лабораторного подтверждения диагноза

I «клещевой риккетсиоз» у больных, проживающих

£ в Aлтайском крае, необходимо тестировать сыво-

| ротки крови в ИФA на наличие IgM и IgG к антиге-

J ну R. sibirica subsp. sibirica. Причем исследование

1 парных сывороток в ИФA на IgG целесообразно в

| том случае, если в ИФA на IgM получены отрица-

| тельные результаты.

| Для оценки эффективности серологической ве-

^ рификации диагноза № для различных алгоритмов

I применения ИФA были рассчитаны показатели,

[- рекомендуемые для характеристики лаборатор-

| ных тестов [6]: чувствительность (sensitivity - Se),

g специфичность (specificity - Sp); прогностическая

s ценность положительного результата (positive

I predictive value - PV+); прогностическая ценность

отрицательного результата (negative predictive value - PV-). Результаты и формулы расчетов представлены в таблице 2.

Оказалось, что у большинства больных (77,8%) для подтверждения диагноза было достаточно исследовать на наличие IgM к R. sibirica только первую сыворотку крови. Тестирование второй пробы | крови позволяло верифицировать диагноз еще у

I 13,9% больных. Таким образом, при исследовании

5 парных проб крови в ИФA для обнаружения IgM к

6 R. sibirica удалось подтвердить диагноз ^ у 91,7%

I больных. При исследовании в ИФA на наличие IgG к

| R. sibirica всех (трех) пар сывороток крови, в кото-

| рых не были выявлены IgM к R. sibirica, обнаруже-

Ї на сероконверсия IgG к изучаемому антигену, что

| повысило подтверждаемость диагноза до 100%.

£ Представляло интерес выяснить, совпадают

I ли результаты лабораторного подтверждения ^

§ с помощью ИФA с результатами серологической

8 верификации с помощью РС^ Для этого сыворотки

I крови от 15 больных № были параллельно исо следованы в ИФA и в Р^ с коммерческим диа-

5 гностикумом. Полученные данные представлены в

J таблице 3. Оказалось, что исследование парных

сывороток в Р^ позволило верифицировать диа-1^. гноз № в 66,7% случаев, с помощью ИФA на IgM -

в 80% и в результате совместного применения ИФA на IgM и на IgG - в 53,3% случаев.

4ss В сыворотках крови лихорадящих больных, кон-

■Q-J тактировавших с клещами на территории Тарского

^ "" района Омской области (опытная группа), также об! наружили AT к изучаемым риккетсиозным антигенам,

| хотя процент таких находок значительно меньше, чем

5

са

§ л

I 'О і °

S

|. у больных с Aлтая. Вместе с тем факты выявления

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (50)/2010

Характеристики теста чр "Л „ + 1 О > ^ & ^ ■с со +1 со о~ ел 1^, +1 К СП о о

чр .2 + <и > ^ & ^ си 00 +1 со со ел ел сч +1 к СП 1^ сч +1 со К СП

л а в ■и сч +1 СО, 00* ел +1 00 00 СП +1 СО, 00* СП

*? «в 5. <0 \ си СП со +1 СО К со +1 1^, СП о о

Здоровые (п = 80) Є 31 И СП СП СП

Із И - - -

Больные (п = 36) е 2 И со со о

§3 И со со со со со

Алгоритм применения ИФА *св ю о а с сс І? < е ИФА-1дМ (парные пробы) ИФА-1дМ (парные пробы) + ИФА-1дв (парные пробы)

!§

противориккетсиозных антител у больных этой группы представляют значительный интерес, поскольку до настоящего времени в Омской области не было зарегистрировано ни одного случая КР однако в клещах были выявлены R. tarasevichiae, R. гаоиШ'і и рик-кетсия, генетически близкая к R. helvetica [4].

У больных опытной группы АТ класса ^М обнаруживали значительно чаще, чем ^, особенно в первой сыворотке крови. Антитела класса ^ чаще выявляли во второй пробе крови. Следует отметить, что в одной и той же пробе крови нередко обнаруживали АТ обоих классов (^М и к двум и более риккетсиозным антигенам. При анализе видоспецифичности выявляемых антител оказалось, что чаще всего у больных Тарского района удается обнаружить ^М и ^ к R. В]-90. На втором месте по частоте обнаружения - ^М и ^ к R. sibirica, на третьем месте - ^М и ^ к R. гаоиШ'і, на четвертом - ^М и ^ к R. акагіі, на пятом - ^М к R. tarasevichiae, на шестом -^М к R. heilongjiangensis. Интересен тот факт, что | ни у одного человека не были обнаружены ^ к

о R. tarasevichiae или R. heilongjiangensis. Это дает

о основание полагать, что выявленные ^М к этим

‘г видам риккетсий, скорее всего, результат пере-

:=» крестных реакций. Аналогичное предположение

2 можно сделать и в отношении обнаружения АТ к

§ R. гаоиіґи и R. акагіі. В подавляющем большинстве

случаев антитела к антигенам этих видов рик-^ кетсий выявляли вместе с антителами к R. В]-90

§ или R. sibiгica. Только у двух больных во второй

§ сыворотке крови обнаруживали ^М к R. акагіі или

| ^ к R. гаоиШІ в отсутствие антител к другим рик-

§ кетсиозным антигенам как в этой, так и в осталь-

й ных пробах крови.

§ Учитывая то, что R. В]-90 признана геновариан-

| том R. sibiгica [11], важно отметить отсутствие пе-

| рекрестных реакций ^М и IgG к R. В]-90 с раство-

£о римым антигеном R. sibiгica у больных как в опыт-

| ной, так и в контрольной группах. Только в одной

Е из 65 сывороток крови больных КР из Алтайского

| края выявляли ^М к антигену R. В]-90 параллельна но с ^М и ^ к R. sibiгica, а ^ к R. В]-90 не были

о- обнаружены ни у одного больного. Это позволяет

£ заключить, что R. В]-90 значительно отличается

Ї от R. sibiгica своими растворимыми антигенами.

-§■ Последние, по-видимому, отличаются также имму-

| ногенными свойствами: ^М к антигену R. В]-90

? выявляются уже на третий день после присасы-

вания клеща (максимальное число положительных й находок - 1 - 3-я неделя). Антитела класса ^М к

§ антигену R. sibiгica выявляли не ранее чем на де-

Ц вятый день после инфицирования (максимальное

е число положительных находок - 2 - 5-я неделя).

I

0)

со

Выводы

1. Непрямой твердофазный вариант иммунофер-| ментного анализа является высокочувствительно ным и специфичным методом обнаружения ан-

I тител к антигенам риккетсий.

с

Таблица 3.

Анализ совпадений результатов серологической верификации диагноза клещевого риккетсиоза у больных из Алтайского края при использовании ИФА и РСК

Алгоритм применения ИФА Всего больных ИФA+ РСК+ Совпадения положительных результатов ИФA и РСК, % Совпадения отрицательных результатов ИФA и РСК, %

абс. % абс. %

ИФА на 1дМ (1-я проба) 1S 1O 66,7 ± 12,2 O O O 1OO

ИФА на 1дМ (парные пробы) 1S 12 8O,O ± 1O,3 8 S3,3 ± 12,9 66,7 ± 13,6 1OO

ИФА на 1дМ (парные пробы) и ИФА на 1дв (парные пробы) 1S 1S 1OO 8 S3,3 ± 12,9 S3,3 ± 12,9 1OO

2. Применение экспериментальных иммуно-ферментных тест-систем для обнаружения антител классов ^М и ^ к антигену R. sibirica subsp. sibirica в парных сыворотках крови позволяет верифицировать диагноз клещевого риккетсиоза у больных из Алтайского края в подавляющем большинстве случаев, в том числе при отрицательных результатах РСК.

3. Впервые получены серологические данные, свидетельствующие о том, что в северных районах Омской области циркулирует как минимум два антигенных варианта риккетсий из группы

клещевой пятнистой лихорадки, практически не вызывающих перекрестных серологических реакций. Один из них имеет антигенное сходство с Я. эМпса зиЬэр. BJ-90, а второй - с Я. БЬтса зиЬэр. БЬтса.

4. Использование антигенов различных видов риккетсий в качестве основы твердофазного непрямого варианта ИФА открывает перспективы для широкомасштабного сероэпидемиологического изучения географического распространения «старых» и «новых» видов риккетсий и их роли в патологии человека.

Литература

1. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккет-сиозах. - М.: Медицина, 1972. - 496 с.

2. Медянников О.Ю., Макарова В.А. Дальневосточный клещевой рик-кетсиоз: описание нового инфекционного заболевания // Вестник Российской АМН. 2008. № 7. С. 41 - 44.

3. Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В. и др. Микроорганизмы порядка Rickettsiales у таежного клеща (Ixodes persulcatus sch.) в Предуралье // Вестник Российской АМН. 2008. № 7. С. 47 - 50.

4. Рудаков Н.В., Шпынов С.Н., Самойленко И.Е. и др. Современные подходы к изучению Rickettsiales // Бюл. сибирской медицины. 2006. Прил. 1. С. 111 - 115.

5. Тарасевич И.В. Современные представления о риккетсиозах // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. 2005. Т. 7. № 2. С. 119 - 129.

6. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. - М.: Медиа Сфера, 1998. - 352 с.

7. Clements M.L., Dumler J.S, Fiset P. et al. Serodiagnosis of Rocky

Mountain spotted fever: comparison of IgM and IgG enzyme-linked

immunosorbent assays and indirect fluorescent antibody test // J. Infect. Dis. 1983. V. 148. P. 876 - 880.

8. Crum J.W., Hanchalay S., Eamsila C. New paper

enzymelinked immunosorbent technique compared with

microimmunofluorescence for detection of human serum antibodies to Rickettsia tsutsugamushi // J. Clin. Microbiol. 1980. № 11. P. 584 - 588.

9. Kelly D.J., Wong P.W., Gan E., Lewis G.E., Jr. Comparative evaluation of the indirect immunoperoxidase test for the serodiagnosis of rickettsial disease // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1988. V. 38. P. 400 - 406.

10. La Scola B., Raoult D. Laboratory diagnosis of Rickettsioses: current approaches to diagnosis of old and new rickettsial diseases // J. Clin. Microbiol. 1997. V. 35. № 11. P. 2715 - 2727.

11. Zhang J.Z., Fan M.Y, Yu X.J., Raoult D. Phylogenetic analysis of the Chinese Rickettsia isolate BJ-90 // Emerg. Infect. Dis. 2000. № 6. P. 432 - 433.

ИНФОРМAЦИЯ ВОЗ

5-я Европейская неделя иммунизации The Fifth European Immunization Week

В 2010 году Европейская неделя иммунизации пройдет в пятый раз, с 24 апреля по 1 мая. Особое внимание будет уделено реализации национальных программ иммунизации, принятых в рамках Глобальной программы по элиминации кори, краснухи и сокращению случаев врожденной краснухи к концу 2010 года Европейского регионального бюро ВОЗ.

Аналогичные Недели одновременно организуются и другими региональными отделениями ВОЗ.

Европейское бюро ВОЗ возглавляет, координирует и поддерживает государства-члены ВОЗ региона в проведении Европейской недели иммунизации, помогая решать задачи, связанные с вакцина-

цией. Организации-партнеры ВОЗ - ЮНИСЕФ и Европейский центр по контролю заболеваемости и профилактике - вносят свой вклад в проведение Недели на региональном и национальном уровнях.

Европейская неделя иммунизации имеет целью помочь государствам-членам ВОЗ повысить уровень информированности населения о необходимости защиты против инфекционных болезней, преимуществах вакцинопрофилактики, праве каждого ребенка быть защищенным от опасных инфекционных болезней, которые можно предупредить с помощью иммунизации.

Источник:

www.who.int

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № l (50)/20l0