CC BY
11
УДК 577.112.856:616.15:615.277.4/33
DOI: 10.18699/SSMJ20210605
Оригинальное исследование / Research article
Аполипопротеин А-I повышает активность лизосомальных гликозидаз в печени мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением
Л.М. Поляков, Р.А. Князев, М.В. Котова, Г.С. Русских, Е.И. Соловьева, А.В. Рябченко
НИИ биохимии ФИЦ фундаментальной и трансляционной медицины 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Резюме
В работе показана способность аполипопротеина А-I влиять на активность лизосомальных гликозидаз в печени мышей на модели БЦЖ-индуцированного туберкулезного воспаления. Цель исследования - изучить активность лизосомальных гликозидаз в печени мышей на модели БЦЖ-индуцированного туберкулезного воспаления после внутривенного введения аполипопротеина А-I. Материал и методы. Исследования выполнены на мышах-самцах СВА массой 20-22 г. Диссеминированное туберкулезное воспаление моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения 0,5 мг вакцины БЦЖ. Активность лизосомальных гликозидаз оценивали спектрофлуориметрически по содержанию продуктов гидролиза соответствующих флуорогенных субстратов. Результаты. Туберкулезное воспаление приводило к выраженному снижению активности лизосомальных гликозидаз в печени по сравнению со здоровыми животными: р-галактозидазы - в 2,3 раза, Р-глюкозидазы - в 2,8 раза, Р-глюкуронидазы - в 2,5 раза. Внутривенное введение животным аполипопротеина А-I на фоне БЦЖ-инфицирования препятствовало уменьшению ферментативной активности гликозидаз, и эти величины практически не отличались от контрольных значений. Заключение. Ферментативная активность лизосомальных гликозидаз в группе мышей с внутривенным введением аполипопротеина А-I на фоне БЦЖ-инфицирования в 1,5-2 раза превышала соответствующие показатели в группе животных с БЦЖ-инфицированием без введения аполипопротеина А-I, т.е. без лечения.
Ключевые слова: аполипопротеин А-I, туберкулезное воспаление, БЦЖ, лизосомальные гликозидазы.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов. Автор для переписки: Поляков Л.М., e-mail: [email protected]
Для цитирования: Поляков Л.М., Князев Р.А., Котова М.В., Русских Г.С., Соловьева Е.И., Рябченко А.В. Аполипопротеин А-I повышает активность лизосомальных гликозидаз в печени мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением. Сибирский научный медицинский журнал. 2021;41(6):51-55. doi: 10.18699/ SSMJ20210605
Apolipoprotein A-I increases the activity of lysosomal glycosidases in the liver of mice with BCG-induced tuberculosis inflammation
L.M. Polyakov, R.A. Knyasev, M.V. Kotova, G.S. Russkikh, E.I. Soloveva, A.V. Ryabchenko
Institute of Biochemistry of Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
Abstract
This work shows the ability of apolipoprotein A-I to influence the activity of lysosomal glycosidases in the liver of mice in a model of BCG-induced tuberculous inflammation. The aim of the investigation was to study the activity of lysosomal glycosidases in the liver of mice using a model of BCG-induced tuberculous inflammation after intravenous
Polyakov L.M. et al Apolipoprotein A-I increases the activity of lysosomal...
administration of apolipoprotein A-I. Material and methods. The studies were performed on male CBA mice weighing 20-22 g. Disseminated tuberculous inflammation was modeled by a single intraperitoneal injection of 0.5 mg of BCG vaccine. The activity of lysosomal glycosidases was assessed spectrofluorimetrically by the content of hydrolysis products of the corresponding fluorogenic substrates. Results. Tuberculous inflammation led to a pronounced decrease in the activity of lysosomal glycosidases in the liver. Thus, p-galactosidase was decreased 2.3 times, p-glucosidase - 2.8 times, p-glucuronidase - 2.5 times compared with healthy animals. Intravenous injection of apolipoprotein A-I to animals against the background of BCG infection prevented a significant decrease in the enzymatic activity of glycosidases and these values practically did not differ from the control values. Conclusions. Enzymatic activity of lysosomal glycosidases in the group of mice with intravenous administration of apolipoprotein A-I against the background of BCG infection was 1.5-2 times higher than the corresponding indicators in the group of animals with BCG-infection without administration of apolipoprotein A-I, i.e. without treatment.
Key words: apolipoprotein A-I, tuberculous inflammation, BCG, lysosomal glycosidases.
Conflict of interests. Authors declare lack of the possible conflicts of interests. Correspondence author: Polyakov L.M., e-mail: [email protected]
Citation: Polyakov L.M., Knyasev R.A., Kotova M.V., Russkikh G.S., Soloveva E.I., Ryabchenko A.V. Apolipo-protein A-I increases the activity of lysosomal glycosidases in the liver of mice with BCG-induced tuberculosis inflammation. Sibirskiy nauchnyy meditsinskiy zhurnal = Siberian Scientific Medical Journal. 2021;41(6):51-55. [In Russian]. doi: 10.18699/SSMJ20210605
Введение
На сегодняшний день считается доказанной важнейшая роль лизосомальных гидролаз в процессах воспаления любого генеза, в том числе асептического [1]. В ранее проведенных исследованиях нами была показана способность апо-липопротеина А-I (апо А-I) взаимодействовать с изониазидом, что явилось основанием для изучения возможности использования этого белка в качестве транспортной формы противотуберкулезного препарата. Применение комплекса «апо А-I - изониазид» в терапии мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением приводило к повышению в печени активности кислой фосфатазы и катепсина D, сниженной под влиянием микобактерий [2]. Поскольку незавершенность процесса фагоцитоза при туберкулезе может быть обусловлена недостаточной активностью гидролаз [3, 4], целью настоящего исследования явилось изучение влияния апо А-I на активность лизосомальных гликозидаз -Р-галактозидазы (КФ 3.2.1.23), Р-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21) и Р-глюкуронидазы (КФ 3.2.1.31) у мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением.
Материал и методы
Исследования проводили на мышах-самцах СВА массой 20-22 г. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с принципами гуманности, изложенными в «Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных». Диссеминированное туберкулезное
воспаление моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения 0,5 мг вакцины БЦЖ («Микроген», г. Ставрополь) в 1 мл физиологического раствора [5]. Развитие устойчиво воспроизводимой модели туберкулезного воспаления тестировали через 14 дней с помощью морфологического исследования паренхиматозных органов. При изучении в световом микроскопе образцов тканей наблюдали формирующиеся гранулемы в печени и легких (до 20-30 клеток), состоящие преимущественно из макрофагов и лимфоцитов (данные не приведены). В селезенке отмечалась лимфоидная и макрофагальная гиперплазия. Окрашивание по Цилю - Нильсену показало наличие микобактерий в очагах инфекции, наиболее выраженное в легких и за-брюшинной жировой клетчатке. Через 1 месяц после введения вакцины БЦЖ размер гранулем увеличивался до 50-60 клеток, среди них появлялись эпителиоидно-клеточные, а также смешанно-клеточные гранулемы, образованные эпителиоидными клетками, макрофагами и лимфоцитами. Животные были разделены на три группы по 6 особей: 1) контрольная группа (здоровые мыши); 2) БЦЖ-инфицированные мыши; 3) БЦЖ-инфицированные мыши с внутривенным введением апо А-I (апо А-I выделяли из липопро-теинов высокой плотности плазмы крови человека описанным ранее способом [6]).
Инъекции апо А-I начинали через две недели после инфицирования и проводили в течение последующих двух недель. Апо А-I вводили в одну из хвостовых вен 2 раза в неделю (200 мкг в 100 мкл физиологического раствора). Контроль-
ным (здоровым) животным вводили равный объем физиологического раствора.
Для выделения фракции лизосом печеночный гомогенат центрифугировали трижды: при 750 g в течение 10 мин для осаждения ядер и неразрушенных клеток печени, при 3300 g в течение 10 мин для осаждения фракции тяжелых митохондрий и при 16300 g в течение 20 мин для осаждения лизосом. Осадок ресуспендировали в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,4), содержащем 0,25 М сахарозы.
Ферментативную активность ß-d-глюкози-дазы (КФ 3.2.1.21), ß-d-галактозидазы (КФ 3.2.1.23) и ß-d-глюкуронидазы (КФ 3.2.1.31) в лизосомальной фракции гомогената печени определяли с использованием соответствующих флуорогенных субстратов 4-метилумбел-лиферил^^-глюкопиранозида (Sigma, США, M3633), 4-метилумбеллиферил^^-галакто-зида (Diagnostic Chemicals Ltd., США) и 4-метилумбеллиферил^^-глюкуронида (Diagnostic Chemicals Ltd). Измерения проводили на спектрофлуориметре RF-5301PC (Shimadzu, Япония) при длине волны возбуждения 365 нм и эмиссии 465 нм. Концентрацию белка определяли по Бредфорду, на спектрофотометре Evolution 300 (Thermo Fisher Scientific, США). Спектрометрические измерения выполняли в ЦКП на базе НИИ биохимии ФИЦ ФТМ, г. Новосибирск.
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (т), и представляли в виде M ± т. Различия между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента, достоверными считались результаты при р < 0,05.
Результаты
Активность лизосомальных гликозидаз (ß-галактозидазы, ß-глюкозидазы и ß-глюкуро-
нидазы) в печени мышей с туберкулезным воспалением представлена в таблице.
Обращают на себя внимание существенные отличия активности ферментов в контрольной группе животных. Так, самая высокая ферментативная активность отмечалась для Р-глюкуронидазы, а самая низкая - для Р-глюкозидазы (более чем девятикратное различие). Инфицирование мышей вакциной БЦЖ через 4 недели вызывало значимое уменьшение активности гидролаз по сравнению с контрольной группой: активность Р-галактозидазы снижалась в 2,3 раза (р = 0,0016), Р-глюкозидазы - в 2,8 раза (р = 0,0012), Р-глюкуронидазы - в 2,5 раза (р = 0,0011).
Внутривенное введение животным апо А-I на фоне БЦЖ-инфицирования препятствовало снижению ферментативной активности глико-зидаз, величины практически не отличались от контрольных значений. Кроме того, следует подчеркнуть, что ферментативная активность всех трех лизосомальных гликозидаз в группе мышей с внутривенным введением апо А-I на фоне БЦЖ-инфицирования в полтора-два раза превышала величину соответствующих показателей животных с БЦЖ-инфицированием без введения апо А-I, т.е. без лечения.
Обсуждение
Проблема фагосомно-лизосомного слияния при туберкулезе, осложняющая лечение, а также предполагаемое влияние апо А-I на функциональное состояние лизосомальных мембран определили выбор данного белка в качестве фактора, модулирующего активность лизосомальных гликозидаз у мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением. Следует отметить, что влияние микобактерий на активность представленных гидролаз может быть различным в зависимости от вида фермента и степени пато-
Активность лизосомальных гликозидаз у мышей в контроле, у мышей с туберкулезным воспалением и при
внутривенном введении апо А-I на фоне воспаления
Activity of lysosomal glycosidases in control mice, in mice with tuberculous inflammation and after intravenous administration of apo A-I against the background of inflammation
Aкгивность фермента (нмоль субстрата/мг белка в час) Группа
^этроль БЦЖ БЦЖ + апо A-I
ß-галактозидаза 44,61±4,57 19,80±2,56* 31,52±2,87#
ß-глюкозидаза 15,57±2,35 5,57±0,65* 12,45±2,21#
ß-глюкуронидаза 145,18 ± 13,32 58,58±4,43* 124,68±15,0#
Примечание. Обозначены статистически значимые (р < 0,05) отличия от величин соответствующих показателей: * - животных группы контроля, # - БЦЖ-инфицированных животных.
Polyakov L.M. et al Apolipoprotein A-I increases the activity of lysosomal.
генности возбудителя. В частности, показано, что микобактерии туберкулеза могут подавлять гидролазную активность лизосом перитонеаль-ных макрофагов у мышей [7], и, следовательно, снижение активности гидролаз может являться следствием ингибирования лизосомальных гидролаз под действием микобактерий. Однако если учитывать способность микобактерий нарушать функциональное состояние лизосомального аппарата, можно сделать заключение о том, что снижение ферментативной активности гидролаз при моделировании туберкулезного воспаления является фактором, препятствующим уничтожению и элиминации возбудителя. Отсутствие уменьшения активности лизосомальных гидро-лаз в результате внутривенного введения апо А-I на данной модели туберкулезного воспаления может как раз являться положительным фактором, направленным на уничтожение микобактерии.
Полученные нами данные свидетельствуют, что апо А-I способен оказывать противовоспалительный эффект, по-видимому, снижая гиперактивность макрофагов. Так, показано, что апо A-I подавляет опосредованную CD40 провоспали-тельную передачу сигналов в макрофагах, предотвращая транслокацию TRAF-6 в липидные рафты посредством АВСА1-зависимой регуляции оттока свободного холестерина [8]. Это согласуется с данными о способности апо А-I снижать продукцию ФНО-а и ИЛ-1Р моноцитами посредством блокировки контакт-индуцированного взаимодействия с Т-лимфоцитами [9]. Кроме того, обнаруженные нами факты могут являться отражением антимикробных свойств апо А-I, описанных в литературе для некоторых видов стафилококков [10] и обусловленных, по мнению авторов, взаимодействием амфипатных областей молекулы белка с липополисахаридами клеточной стенки бактерий. Противовоспалительная функция апо А-I, представленная в данной работе, может являться основой для новых терапевтических подходов при лечении воспалительных заболеваний, таких как туберкулез, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, системная красная волчанка и атеросклероз.
Выводы
1. БЦЖ-индуцированное туберкулезное воспаление вызывает значимое снижение в печени активности лизосомальных гликозидаз (Р-галактозидазы - в 2,3 раза, Р-глюкозидазы - в 2,8 раза, Р-глюкуронидазы - в 2,5 раза по сравнению с нелеченным контролем).
2. Внутривенное введение мышам апо А-I на фоне туберкулезного воспаления не допускает
значимого снижения ферментативной активности гликозидаз относительно контрольных величин.
3. Ферментативная активность всех трех лизосомальных гликозидаз в группе мышей с внутривенным введением апо А-I на фоне БЦЖ-инфицирования в 1,5-2 раза превышала соответствующие показатели в группе животных с БЦЖ-инфицированием без введения апо А-I (без лечения).
Список литературы / References
1. Rozenfeld P., Feriozzi S. Contribution of inflammatory pathways to Fabry disease pathogenesis. Mol. Genet. Metab. 2017;122(3):19-27. doi: 10.1016/j. ymgme.2017.09.004
2. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние комплекса изониазида с аполипопротеином А-I на активность ферментов лизосом у мышей с моделью туберкулезного воспаления. Эксперим. и клин. фармакол. 2012;75(11):28-30.
Sumenkova D.V., Polyakov L.M., Panin L.E. Influence of isoniazid complex with A-I apolipoprotein on activity of lysosomal enzymes in mice with tuberculous inflammation model. Eksperimental'naya i klinicheskaya farmakologiya = Experimental and Clinical Pharmacology. 2012;75(11):28-30. [In Russian].
3. Chua J., Vergne I., Master S., Deretic V. A tale of two lipids: Mycobacterium tuberculosis phagosome maturation arrest. Curr. Opin. Microbiol. 2004;7(1):71-77. doi: 10.1016/j.mib.2003.12.011
4. Hmama Z., Sendide K., Talal A., Garcia R., Dobos K., Reiner N.E. Quantitative analysis of phagolysosome fusion in intact cells: inhibition by mycobacterial lipoarabinomannan and rescue by an 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3-phosphoinos-itide 3-kinase pathway. J. Cell. Sci. 2004;117(Pt. 10):2131-2140. doi: 10.1242/jcs.01072
5. Шкурупий В.А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терапия. М.: Изд-во РАМН, 2007. 536 с.
Shkurupy V.A. Tuberculous granulomatosis. Cy-tophysiology and address therapy. Moscow, 2007. 536 c. [In Russian].
6. Sumenkova D.V., Polyakov L.M., Panin L.E. Apo-lipoprotein A-I as a carrier of lipopolysaccharide into rat hepatocytes. Bull. Exp. Biol. Med. 2013;155(6):738-740. doi: 10.1007/s10517-013-2240-z
7. Созинов В.А., Метелицына И.П., Плотникова Е.К. Влияние микобактерий туберкулеза на активность лизосомальных факторов перито-неальных макрофагов мышей. Пробл. туберкулеза. 1993;5:44-47.
Sozinov V.A., Metelitsyna I.P., Plotnikova E.K. Influence of mycobacterium tuberculosis on the activity of lysosomal factors of peritoneal macrophages in mice. Problemy tuberkuleza = Problems of Tuberculosis. 1993;5:44-47. [In Russian].
8. Yin K., Chen W.J., Zhou Z.G., Zhao G.J., Lv Y.C., Ouyang X.P., Yu X.H., Fu Y., Jiang Z.S., Tang C.K. Apolipoprotein A-I inhibits CD40 proinflammatory signaling via ATP-binding cassette transporter Al-mediated modulation of lipid raft in macrophages. J. Atheroscler. Thromb. 2012;19(9):823-836. doi: 10.5551/jat.12823
9. Hyka N., Dayer J.M., Modoux C., Kohno T., Edwards C.K., Roux-Lombard P., Burger D. Apolipopro-
tein A-I inhibits the production of interleukin-1 beta and tumor necrosis factor-alpha by blocking contact-mediated activation of monocytes by T lymphocytes. Blood. 2001;97(8):2381-2389. doi: 10.1182/blood.v97.8.2381 10. Tada N., Sakamoto T., Kagami A., Mochizuk K., Kurosaka K. Antimicrobial activity of lipoprotein particles containing apolipoprotein Al. Mol. Cell. Biochem. 1993;119(1-2):171-178. doi: 10.1007/BF00926868
Сведения об авторах:
Лев Михайлович Поляков, д.м.н., проф., ORCID: 0000-0001-5905-8969, e-mail: [email protected] Роман Александрович Князев, к.б.н., ORCID: 0000-0003-2678-8783, e-mail: [email protected] Мария Владимировна Котова, ORCID: 0000-0001-6276-9630, e-mail: [email protected] Галина Сергеевна Русских, ORCID: 0000-0003-1565-5248, e-mail: [email protected] Елена Игоревна Соловьева, e-mail: [email protected]
Александр Владимирович Рябченко, к.б.н., ORCID: 0000-0002-1658-4982, e-mail: [email protected]
Information about the authors:
Lev M. Polyakov, doctor of medical sciences, professor, ORCID: 0000-0001-5905-8969, e-mail: [email protected] Roman A. Knyazev, candidate of biological sciences, ORCID: 0000-0003-2678-8783, e-mail: [email protected] Mariay V. Kotova, ORCID: 0000-0001-6276-9630, e-mail: [email protected] Galina S. Russkikh, ORCID: 0000-0003-1565-5248, e-mail: [email protected] Elena I. Soloveva, e-mail: [email protected]
Aleksandr V. Ryabchenko, candidate of biological sciences, ORCID: 0000-0002-1658-4982, e-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 06.09.2021 После доработки 15.09.2021 Принята к публикации 02.11.2021
Received 06.09.2021 Revision received15.09.2021 Accepted 02.11.2021
