CC BY
28
Инфекция и иммунитет 2014, Т. 4, № 3, с. 213-220
Оригинальные статьи
РАЗЛИЧНАЯ ДИНАМИКА ЗАРАЖЕННОСТИ МИКОБАКТЕРИЯМИ КЛЕТОК В ГРАНУЛЕМАТОЗНЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ МЫШЕЙ С ЛАТЕНТНОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ И В ИНФИЦИРОВАННЫХ ВАКЦИНОЙ БЦЖ IN VITRO КУЛЬТУРАХ КОСТНОГО МОЗГА И ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕЙ
Е.Г. Уфимцева
ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия
Резюме. Целью работы стало сравнение динамики зараженности микобактериями клеток в гранулематозных образованиях (гранулемах), полученных из костного мозга и селезенок мышей с латентной туберкулезной инфекцией, и в инфицированных вакциной БЦЖ in vitro культурах костного мозга и перитонеальных макрофагов интактных мышей. Анализ содержания кислотоустойчивых BCG-микобактерий в макрофагах гранулем мышей на латентном этапе туберкулезной инфекции спустя 20 дней, 1 и 2 месяца после заражения вакциной БЦЖ in vivo показал, что количество микобактерий в клетках варьировало как в индивидуальной гранулеме, так и между гранулемами как из одной мыши, так и из разных мышей. Однако в целом макрофаги гранулем мышей на разных стадиях латентной туберкулезной инфекции содержали единичные BCG-микобактерии в культуре ex vivo, тогда как при остром заражении вакциной БЦЖ культур костного мозга и перитонеаль-ных макрофагов мышей наблюдали значительный рост числа микобактерий в клетках в процессе инфекции in vitro. Таким образом, макрофаги гранулем мышей на латентной стадии туберкулезной инфекции были неспособны уничтожить часть микобактерий, однако могли контролировать их размножение в клетках как in vivo, так и в культуре ex vivo, в отличие от макрофагов, полученных из разных органов интактных мышей и зараженных BCG-микобактериями in vitro.
Ключевые слова: латентная туберкулезная инфекция, вакцина БЦЖ, BCG-микобактерии, зараженность, макрофаги.
Введение
Микобактерии туберкулеза — патогены, вызывающие как острую болезнь человека и животных, так и сохраняющие состояние латентности на протяжении многих лет жизни инфицированного хозяина. Микобактерии на латентной бессимптомной стадии инфекции могут внедряться в различные органы и ткани организма и персистировать в течение десятилетий до возможной реактивации туберкулез-
ного процесса [3, 6, 8]. Очагами латентной туберкулезной инфекции в организме человека и животных являются хронические гранулема-тозные воспалительные образования, называемые гранулемами и состоящие из клеток разных типов, прежде всего макрофагов [3, 6].
Макрофаги захватывают бактерии путем фагоцитоза с последующим их уничтожением в фаголизосомах в результате действия активных форм кислорода и азота, лизосомальных гидролаз и токсических пептидов в среде с низ-
Автор:
Уфимцева Е.Г., к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия.
Адрес для переписки: поступила в редакцию 04.02.2014
Уфимцева Елена Геннадьевна принята к печати 05.05.2014 630117, Россия, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2, ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН.
Тел.: (913) 480-62-11. E-mail: [email protected] © Уфимцева Е.Г., 2014
ким значением рН. Однако в модельных экспериментах с острым заражением клеток in vitro было показано, что микобактерии способны блокировать образование фаголизосом и выживать в клетках-хозяевах [8]. Интересно, что популяции микобактерий, растущих как в культурах макрофагов in vitro, так и в бесклеточной среде, были морфологически и функционально гетерогенны и содержали бактерии, устойчивые к действию различных химиотерапевтиче-ских препаратов [2, 4]. В культурах in vitro наблюдали различное поведение микобактерий вирулентных и авирулентных штаммов при заражении клеток [7, 11]. Микобактерии вирулентных штаммов активно размножались в клетках, тогда как аттенуированный штамм Mycobacterium bovis вакцины Кальметта—Герена (bacillus Calmette—Guérin, BCG, вакцина БЦЖ) и M. tuberculosis авирулентных штаммов обнаружили только в вакуольных компартментах клеток, где они подвергались разрушению в течение 2—7 дней наблюдения в культуре in vitro. Однако исследований, посвященных взаимоотношениям бактерий с клетками-хозяевами в организме животных, крайне мало [1, 9]. Следовательно, анализ содержания микобактерий в клетках гранулем до сих пор актуален для изучения развития туберкулезного процесса в различных органах и тканях животных, как на латентной стадии инфекции, так и в фазе ее реактивации.
Цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании зараженности ми-кобактериями клеток гранулем, выделенных из разных органов мышей с латентной туберкулезной инфекцией в культуре ex vivo, и клеток культур костного мозга и перитонеальных макрофагов, полученных от интактных мышей и инфицированных в культуре in vitro.
Материалы и методы
Животные. В работе использовали самцов мышей линии Balb/c в возрасте двух месяцев к началу инфицирования или получения культур клеток. Мышей получили из питомника Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск, Россия) и содержали в виварии в соответствии со всеми нормами ухода за животными.
Бактерии вакцинного штамма M. bovis фабричного производства (вакцина БЦЖ-1, ООО «Аллерген», г. Ставрополь, ООО «Медгамал», Москва, Россия) использовали в дозе 0,5 мг на мышь в 0,9% растворе NaCl. Мышей инфицировали в хвостовую вену в количестве 100 мкл суспензии на мышь или, в случае 20 дней инфекции, в перитонеальную полость в количестве 200 мкл суспензии на мышь.
Выделение гранулем и культивирование ex vivo. Гранулемы из костного мозга бедренных костей и/или селезенок мышей изолировали спу-
стя 20 дней, 1 и 2 месяца после инфицирования вакциной БЦЖ по методу, описанному в [10]. Все реактивы для выделения и культивирования клеток получены из «Биолот» (Санкт-Петербург, Россия).
Получение культур клеток, их культивирование и инфицирование in vitro. Культуры клеток костного мозга из бедренных костей и макрофагов из перитонеальной полости четырех ин-тактных мышей, полученные по стандартным методикам, в течение суток культивировали в лунках (3 х 105 кл./лун.) 24-луночных планшетов (Orange Scientific, Бельгия) с покровными стеклами на дне в 0,5 мл ростовой среды, как и клетки гранулем мышей. После удаления среды к клеткам внесли вакцину БЦЖ-1 в количестве 0,04 мг/лун. в 200 мкл ростовой среды на 1 ч при +37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки двукратно отмыли от вакцины в среде RPMI 1640 и культивировали в ростовой среде при +37°С в атмосфере 5% СО2.
Окраска клеток на микобактерии. После 2— 5 суток в культуре ex vivo клетки гранулем на покровных стеклах после удаления ростовой среды фиксировали в 4% растворе формалина на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 10 мин при комнатной температуре. Аналогично поступали с клетками культур костного мозга и перитонеальных макрофагов мышей спустя 4, 24, 48, 72, 96 и 120 ч от начала инфицирования вакциной БЦЖ in vitro. Препараты с клетками стандартно окрашивали по методу Циля—Нильсена, докрашивали в 1% растворе метилового синего (Sigma, USA).
Микроскопия. Цитологические препараты исследовали в Центре коллективного пользования (ЦКП) микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск, Россия) как описано в [1]. Клетки культур костного мозга и перитонеальных макрофагов мышей анализировали на 25—70 полях зрения.
Статистическую обработку результатов провели с использованием пакета программ MS Excel 2010 (Microsoft). Достоверность различий оценили по t-критерию Стьюдента и считали значимыми при p < 0,05.
Результаты
Зараженность микобактериями клеток гранулем мышей с латентной туберкулезной инфекцией. Состав и содержание клеток с микобактериями в гранулемах из селезенок мышей, выделенных спустя 1 месяц (3 мыши под номерами 3, 4, 5) и 2 месяца (9 мышей под номерами 4, 8, 9, 10, 13, 21, 22, 23, 24) после инфицирования вакциной БЦЖ, описаны в [1]. Клеточный состав гранулем из костного мозга и селезенок мышей спустя 20 дней после заражения in vivo (2 мыши под номерами 1 и 2) соответствовал ранее исследованным гранулемам [1] и был представ-
лен макрофагами, дендритными клетками, лимфоцитами и фибробластами. Для гранулем костного мозга было характерно присутствие большого числа нейтрофилов. Монослойные культуры, полученные ex vivo из индивидуальных гранулем, изолированных из органов мышей спустя 20 дней, 1 и 2 месяца после инфицирования вакциной БЦЖ, будем называть двадцатидневными, одномесячными и двухмесячными гранулемами (20д-Гран, 1м-Гран и 2м-Гран) соответственно. К моменту выделения гранулем ни у одной из мышей не наблюдали острой туберкулезной инфекции, следовательно, мыши находились на латентной стадии ее развития.
Содержание в клетках гранулем мышей кислотоустойчивых BCG-микобактерий с неповрежденной клеточной стенкой оценили с помощью окраски Циля—Нильсена (рис. 1а— в). Более половины всех исследованных 20д-Гран из селезенок мышей имели клетки с ми-кобактериями: 62,5 и 58,3% (мыши 1 и 2 соответственно). Для гранулем, выделенных из костного мозга тех же мышей, этот показатель был выше: 90,9 и 75,2% соответственно. BCG-микобактерии обнаружили в 14,9±2,1 и 14,55+1,5% макрофагах 20д-Гран из селезенок и в 4,91+0,42 и 4,7+0,5% макрофагах 20д-Гран
из костного мозга мышей 1 и 2 соответственно. В нейтрофилах 20д-Гран мышей кислотоустойчивых бацилл не наблюдали.
Анализ содержания БСО-микобактерий в макрофагах показал, что количество кислотоустойчивых микобактерий в клетках варьировало как в индивидуальной гранулеме, так и между гранулемами как из одной мыши, так и из разных мышей. В таблице представлены данные по количеству микобактерий в макрофагах гранулем мышей на разных сроках латентной инфекции. На рис. 2 и 3 суммированы данные, полученные при исследовании гранулем из костного мозга и селезенок мышей с двадцатидневной (2 мыши, п = 29 и п = 62 соответственно), одномесячной (3 мыши, п = 84) и двухмесячной (9 мышей, п = 323) инфекцией вакциной БЦЖ. В гранулемах наблюдали макрофаги как с одной БСО-микобактерией, так и с двумя или более микобактериями (до 100 бацилл), которые могли располагаться или поодиночке или в группах размножающихся бактерий (рис. 1а—в). Однако в целом гранулемы мышей на разных сроках латентной инфекции имели в основном клетки с единичными мико-бактериями (рис. 2). Аналогично, количество макрофагов с минимальным числом БСО-микобактерий в клетках (от одной до четырех)
ТАБЛИЦА. КОЛИЧЕСТВО МАКРОФАГОВ С BCG-МИКОБАКТЕРИЯМИ (BCG) В ГРАНУЛЕМАХ (Гран), ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА (КМ) И СЕЛЕЗЕНОК МЫШЕЙ СПУСТЯ 20 ДНЕЙ (20д), 1 МЕСЯЦ (1м) И 2 МЕСЯЦА (2м) ПОСЛЕ ИНФИЦИРОВАНИЯ ВАКЦИНОЙ БЦЖ IN VIVO
Мыши n* Макрофаги с BCG-микобактериями
1_4 BCG 5_9 BCG > 10 BCG
n** %*** n** %*** n** %***
1 (20дКМ-Гран) 20 20 97,09±2,0 2 2,92±2,0 - -
2 (20дКМ-Гран) 9 9 100,0 - - - -
1 (20д-Гран) 20 20 95,83±2,64 3 4,17±2,64 - -
2 (20д-Гран) 42 41 94,05±2,87 4 3,17±1,52 1 2,38±2,37
3 (1м-Гран) 34 32 72,4±5,02 19 12,43±2,3 15 15,32±4,5
4 (1м-Гран) 43 42 75,89±3,3 29 12,88±1,9 20 10,41±2,7
5 (1м-Гран) 7 6 76,51±13,1 3 20,6±13,5 - -
4 (2м-Гран) 79 78 83,43±2,42 34 10,04±1,6 22 6,32±1,72
8 (2м-Гран) 34 29 76,61±6,04 15 18,19±5,5 7 5,34±3,0
9 (2м-Гран) 50 46 77,26±4,32 24 13,57±3,1 13 11,82±3,9
10 (2м-Гран) 27 26 72,49±5,81 13 12,66±3,4 10 12,49±4,4
13 (2м-Гран) 30 27 67,15±4,62 19 21,21±4,8 11 11,92±3,4
21 (2м-Гран) 9 9 74,54±6,68 6 22,68±6,6 1 2,78±2,69
22 (2м-Гран) 27 25 74,94±6,01 8 15,44±5,6 8 12,56±4,6
23 (2м-Гран) 52 52 74,68±1,73 49 17,11±1,6 40 8,3±0,96
24 (2м-Гран) 15 12 69,75±10,2 7 22,86±9,0 4 5,17±2,57
Примечания. * Общее число гранулем с ВСв-содержавшими макрофагами; ** количество гранулем с макрофагами, содержавшими определенное число ВСв-микобактерий; *** среднее число макрофагов с определенным количеством ВСв-микобактерий в процентах от общего числа всех ВСв-содержавших макрофагов гранулем с указанием стандартной ошибки.
мышь 2
мышь 3
мышь 23
#1
Й %
ж
4 /
i ч djя*.
/
и..-
/
Рисунок 1. Клетки в гранулемах из селезенок мышей спустя 20 дней (а), 1 месяц (б) и 2 месяца (в) после заражения in vivo в культуре ex vivo
Окраска Циля-Нильсена. Макрофаги, дендритные клетки с BCG отмечены черными стрелками и звездочками соответственно. Масштабная черта 10 мкм.
было подавляющим в гранулемах исследованных животных (рис. 3). Если 20д-Гран мышей с клетками, содержавшими повышенное количество микобактерий (пять и больше), были редки, то в мышах с одномесячной и двухмесячной инфекцией количество таких гранулем значительно увеличилось (рис. 2). В 1м-Гран и 2м-Гран также выявили повышение числа макрофагов с 5—9 БСО-микобактериями в клетках по сравнению с 20д-Гран (рис. 3). Однако клетки с 10 и более микобактериями в гранулемах исследованных мышей были относительно редкими (табл., рис. 3). Макрофаги с 50-100 бациллами наблюдали крайне редко в единичных гранулемах (рис. 2 и 3). Интересно, что
при индивидуальной вариабельности изученных показателей по гранулемам разных мышей с одно- и двухмесячной инфекцией (табл.), их суммарные распределения оказались однотипными для исследованных групп животных (рис. 2 и 3).
Инфицированность микобактериями клеток культур костного мозга и перитонеальных макрофагов мышей проанализировали на разных сроках от начала заражения вакциной БЦЖ in vitro (рис. 4а-б и 5а-б). Если на 4 ч инфекции клетки-предшественники макрофагов костного мозга содержали в среднем по две микобактерии, то в дальнейшем наблюдали снижение числа таких клеток с постепенным увеличением количества макрофагов с числом
100
90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 -0
f
Sl
i
i
20д-КМ-Гран
20д-Гран
1м-Гран
10 19 BCG
100
□ 1_4 BCG □ 5_9 BCG
□ 20_50BCG И >50 BCG
Рисунок 2. Среднее число гранулем (Гран), полученных из костного мозга (КМ) и селезенок мышей спустя 20 дней (20д), 1 месяц (1м) и 2 месяца (2м) после заражения in vivo, с макрофагами с определенным числом BCG-микобактерий (BCG) *Р < 0,01, **Р < 0,001.
90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 -0
f
гЬ
i
fcɱ
CtL
20д-КМ-Гран 20д-Гран
1м-Гран
2м-Гран мыши
□ 1_4 BCG □ 5_9 BCG [J 10J9BCG
□ 20_50 BCG ■ > 50 BCG
Рисунок 3. Среднее число макрофагов с определенным числом BCG-микобактерий (BCG) в гранулемах (Гран), полученных из костного мозга (КМ) и селезенок мышей спустя 20 дней (20д), 1 месяц (1м) и 2 месяца (2м) после заражения in vivo *Р < 0,01.
а
в
4 ч
24 ч
48 ч
72 ч
96 ч
4 ч
24 ч
120 ч
48 ч
72 ч
96 ч
120 ч
а
б
Рисунок 4. Клетки с BCG-микобактериями в культурах костного мозга (а) и перитонеальных макрофагов (б) мышей на разных сроках инфекции вакциной БЦЖ in vitro
Окраска Циля-Нильсена. На макрофаги с BCG указывают черные стрелки. (а) Нейтрофилы с BCG (4 ч) и фибробласт без BCG (24 ч) отмечены черными звездочками. Масштабная черта 10 мкм.
70 60 -50 -40 30 -20 -10 -0
i
Ь
is.
Ti fifí
4ч
24 ч
48 ч
72 ч
96 ч
120 ч
□ 1_4 BCG □ 5_9 BCG ■ 10_19 BCG □ 20_50 BCG ■ >50 BCG
Рисунок 5. Среднее число макрофагов костного мозга (а) и перитонеальных макрофагов мышей (б) с определенным числом BCG-микобактерий (BCG) на разных сроках инфекции вакциной БЦЖ in vitro
бацилл больше 10. На 120 ч анализа значительное число макрофагов в популяции клеток костного мозга характеризовалось повышенной зараженностью микобактериями (рис. 4а и 5а). Параллельно обнаружили снижение числа макрофагов с одиночными бациллами.
В культурах костного мозга на 4 ч инфекции в 33,07+5,24, 13,36+3,51 и 2,14+0,26% нейтрофи-лов обнаружили от 1 до 4, от 5 до 9 и от 10 до 19 BCG-микобактерий, соответственно (рис. 5а). Начиная с 24 ч анализа, нейтрофилов в культурах костного мозга почти не наблюдали. Единичные выявленные нейтрофилы кислотоустойчивых бацилл не имели. Популяции клеток костного мозга на 24—120 ч инфекции in vitro были представлены в основном макрофагами с разным числом микобактерий, в значительно меньшем количестве — фибробластами, изредка содержавшими единичные бациллы, и дендритными клетками без BCG-микобактерий.
В культурах перитонеальных макрофагов мышей, инфицированных вакциной БЦЖ in vitro, повышенную зараженность большого числа клеток кислотоустойчивыми бациллами обнаружили сначала на 4 ч анализа (рис. 4б и 5б). Однако на 24 ч инфекции количество таких клеток значительно снизилось, вероятно
в результате их гибели путем некроза, на что указывала характерная морфология некоторых клеток, выявленных в исследуемой популяции на 4 ч инфекции. В процессе дальнейшего анализа (48—96 ч) наблюдали постепенное увеличение числа жизнеспособных макрофагов с повышенным содержанием микобактерий параллельно со снижением количества клеток с единичными бациллами (рис. 4б и 5б). Некоторые фибробласты в популяциях пери-тонеальных макрофагов на 96 и 120 ч анализа содержали единичные бактерии. В дендритных клетках всех исследованных культур BCG-микобактерий не обнаружили.
В целом совокупность полученных данных указывает на активный и, вероятно, репли-кативный рост числа кислотоустойчивых ми-кобактерий в макрофагах популяций клеток костного мозга и перитонеальных макрофагов мышей в течение 120 ч инфекции in vitro. Таким образом, макрофаги гранулем мышей с латентной туберкулезной инфекцией хотя и были неспособны уничтожить часть микобактерий в клетках, но могли контролировать их размножение как in vivo, так и в культуре ex vivo, в отличие от макрофагов, зараженных BCG-мико-бактериями in vitro.
Обсуждение
Исследование содержания BCG-микобак-терий в макрофагах гранулем мышей на латентном этапе туберкулезной инфекции показало, что при индивидуальной вариабельности количества бактерий в клетках гранулем из разных мышей они имели в основном единичные бациллы. В то же время при заражении вакциной БЦЖ in vitro клеток культур костного мозга и перитонеальных макрофагов мышей наблюдали, наоборот, значительный рост числа бацилл в течение 5 суток инфекции. Следовательно, макрофаги гранулем мышей могли контролировать размножение микобактерий в клетках, в отличие от макрофагов интакт-ных мышей, которые оказались не способны ограничить прогресс инфекции при заражении in vitro. Известно, что провоспалительные цито-кины IFNy, TNFa и IL-1, синтезируемые макрофагами, лимфоцитами и другими клетками иммунной системы животных, осуществляют контроль туберкулезной инфекции [3, 6, 8]. Возможно, анализ их продукции позволит определить факторы, влияющие на инфекционный процесс в разных клеточных системах.
Распределение как по количеству гранулем с макрофагами, содержавшими определенное число BCG-микобактерий, так и по количеству макрофагов с разным количеством микобак-терий в клетках, отличалось между мышами с двадцатидневной и мышами с одно- и двухмесячной инфекцией вакциной БЦЖ in vivo. Однако эти распределения были однотипными для гранулем, изолированных из селезенок мышей спустя 1 и 2 месяца после инфицирования. Полученные данные согласуются с исследованиями на основе бактериологического метода определения содержания бацилл в различных органах и тканях мышей [9], в которых установили стабилизацию количества бацилл к четвертой неделе после заражения животных и сохранение его на постоянном уровне в последующие месяцы латентной инфекции. Причины роста и стабилизации числа микобактерий на разных сроках туберкулезной инфекции мышей пока не известны.
В исследованиях [7, 11] обнаружили элиминацию BCG-микобактерий в клетках различных миелоидных линий мыши и человека в течение 2—7 суток анализа после их инфицирования in vitro, тогда как микобактерии вирулентных
штаммов, наоборот, активно размножались в зараженных клетках. В результате предположили [l0, ll], что для внутриклеточного размножения микобактерий необходим RDl локус генов, кодирующий белки ESX-l секреционной системы. Аттенуированный фенотип BCG-мико-бактерий также связывают с делецией района RDl, характерного для ДНК вирулентных М. bovis и M. tuberculosis, но отсутствующего в геноме всех известных вакцинных штаммов BCG [5, ll]. Однако в проведенном нами исследовании BCG-микобактерии вакцинного штамма БЦЖ-l, как известно [5], с делецией RDl локуса активно размножались в некоторых макрофагах гранулем мышей с латентной туберкулезной инфекцией и в большинстве клеток культур, инфицированных in vitro. Заметим, что макрофаги с повышенным содержанием бацилл в основном не имели морфологических признаков гибели ни по пути некроза, ни по механизмам апоптоза. Необходим поиск факторов, влияющих на рост и выживаемость микобактерий, в том числе вакцинных штаммов, как в клетках культур in vitro, так и в организме-хозяине с латентным туберкулезным процессом.
В заключение отметим, что исследованная нами внутриклеточная персистенция BCG-микобактерий в макрофагах гранулем зараженных in vivo мышей и в инфицированных in vitro клетках из разных органов мышей представляет интересный пример специфических взаимодействий между микро- и макроорганизмом как на стадии латентной инфекции, так и при остром заражении клеток. Предложенные экспериментальные модели на основе использования микобактерий вакцины БЦЖ, при работе относительно безопасной для человека, перспективны не только для исследования взаимоотношений внутриклеточных патогенов с клетками-хозяевами туберкулезной инфекции на разных ее стадиях, но и, вероятно, для оценки действия антимикобактериальных препаратов на клетки с различной динамикой зараженности BCG-микобактериями.
Благодарности
Автор выражает благодарность сотрудникам ЦКП ИЦиГ СО РАН С.И. Байбородину и Т.Е. Алешиной за помощь в работе, академику РАМН Л.Е. Панину за внимание и поддержку данного исследования.
Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet 2014, vol. 4, no. 3, pp. 213-220
ORIGINAL ARTICLES
DIFFERENT CHARACTERISTICS OF INFECTION WITH MYCOBACTERIA IN GRANULOMA CELLS FROM MICE WITH LATENT TUBERCULOSIS INFECTION AND IN BONE MARROW AND PERITONEAL MACROPHAGES AFTER BCG VACCINE APPLICATION IN VITRO
Ufimtseva E.G.
Institute of Biochemistry, SB RAMS, Novosibirsk, Russian Federation
Abstract. The aim of the study was to compare the content of BCG-mycobacteria in granulomas obtained from various organs of BALB/c mice with latent tuberculosis after in vivo exposure to BCG vaccine and in mouse bone marrow and peritoneal macrophages after BCG infection in vitro. The granuloma cells obtained from mice through 20 days, one and two months after their BCG-infecting in vivo were differed with respect to both the number of granulomas with macrophages containing the defined numbers of BCG-mycobacteria and the quantity of cells with the defined numbers of bacilli in granulomas. However, in the preparations obtained from each mice, granuloma macrophages contained solitary BCG-mycobacteria. At the same time, a shorter acute infection of mouse peritoneal and bone marrow macrophages by BCG vaccine resulted in considerable growth of bacilli in the host cells for 5 days in the culture in vitro. Therefore, granuloma macrophages could control BCG infection both in mice with latent tuberculosis in vivo and in the ex vivo culture, on the contrary, the bone marrow and peritoneal macrophages were not capable to control the BCG infection in the culture in vitro.
Key words: latent tuberculosis infection, Bacillus Calmette—Gudrin vaccine, infectiousness of cells with BCG-mycobacteria, macrophages. Author:
Ufimtseva E.G.El, PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular Mechanisms of Cell-Cell Interactions, Institute of Biochemistry, RAMS, Siberian Branch.
630117, Russian Federation, Novosibirsk, Timakova str., 2, Institute of Biochemistry of the Siberian Branch of the RAMS. Phone: (913) 480-62-11. E-mail: [email protected].
Список литературы/References
1. Уфимцева Е.Г. Клетки с микобактериями в гранулематозных образованиях мышей на латентной стадии туберкулезной инфекции в культуре ex vivo // Инфекция и иммунитет. 2013. Т. 3, № 3. C. 229—234. [Ufimtseva E.G. Kletki s mikobak-teriyami v granulematoznykh obrazovaniyakh myshei na latentnoi stadii tuberkuleznoi infektsii v kul'ture ex vivo [The cells with mycobacteria in granulomatous inflammatory aggregates from mice with latent tuberculous infection in ex vivo culture]. Infekciya i immunitet = Infection and Immunity, 2013, vol. 3, no. 3, pp. 229—234.].
2. Adams K.N., Takaki K., Connolly L.E., Wiedenhoft H., Winglee K., Humbert O., Edelstein P.H., Cosma C.L., Ramakrishnan L. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell, 2011, vol. 145, no. 1, pp. 39-53.
3. Ahmad S. Pathogenesis, immunology, and diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection. Clin. Develop. Immun., 2011, vol. 2011, 17 p.
4. Aldridge B.B., Fernandez-Suarez M., Heller D., Ambravaneswaran V., Irimia D., Toner M., Fortune S.M. Asymmetry and aging of mycobacterial cells lead to variable growth and antibiotic susceptibility. Science, 2012, vol. 335, no. 6064, pp. 100-104.
5. Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., Salamon H., Schoolnik G.K., Rane S., Small P.M. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science, 1999, vol. 284, no. 5419, pp. 1520-1523.
6. Flynn J.L., Chan J., Lin P.L. Macrophages and control of granulomatous imflammation in tuberculosis. Mucos. Imm., 2011, vol. 4, no. 3, pp. 271-278.
7. Gutierrez M.G., Master S.S., Singh S.B., Taylor G.A., Colombo M.I., Deretic V. Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages. Cell, 2004, vol. 119, no. 6, pp. 753-766.
8. Jordao L., Vieira O.V. Tuberculosis: new aspects of an old disease. Int. J. Cell Biol., 2011, vol. 2011, 13p.
9. Mucoz-Elms E.J., Timm J., Botha T., Chan W.-T., Gomez J.E, McKinney J.D. Replication dynamics of Mycobacterium tuberculosis in chronically infected mice. Infect. Immun., 2005, vol. 73, no. 1, pp. 546-551.
10. Tobin D.M., Ramakrishnan L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cell. Microbiol., 2008, vol. 10, no. 5, pp. 1027-1039.
11. Van der Wel N., Hava D., Houben D., Fluitsma D., van Zon M., Pierson J., Brenner M., Peters P.J. M. tuberculosis and M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell, 2007, vol. 129, no. 7, pp. 1287-1298.
Received 04.02.2014
Accepted 05.05.2014
