CC BY
26
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
4-2006
УДК 615:547.857:616-005.6
АНТИТРОМБОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО АНТАГОНИСТА ПУРИНОВЫХ Р2УГРЕЦЕПТОРОВ
А.А. Спасов, А.Ю. Стуковина, М.В. Черников, О.Ю. Гречко, В.А. Анисимова
Лаборатория экспериментальной фармакологии ВНЦ РАМН и АВО, кафедра фармакологии ВолГМУ
Исследования Р2-рецепторов в настоящее время приобрели выраженную клиническую прикладную направленность [1], позволяющую ожидать в ближайшее время создание новых лекарственных средств, избирательно модулирующих различные функции организма. Одним из весьма перспективных направлений изучения Р2-рецепторов является поиск веществ, избирательно ингибирующих пуриновые Р2Y-рецепторы, в качестве потенциальных корректоров функциональной активности тромбоцитов при нарушениях гемостаза.
На поверхности тромбоцитов имеется 3 подтипа Р2-рецепторов: P2Xr, P2Yr и P2Y12-ре-цепторы [8]. P2X1-рецепторы сопряжены с неспецифическими катионными каналами, и активация этих рецепторов АДФ вызывает быстрый поток ионов кальция из среды в тромбоциты [7]. P2Y1-рецепторы являются метаботропными, сопряжены с Gq-белками, при их лигандировании происходит активация фосфолипазы С и последующая мобилизация ионов кальция из внутриклеточных депо [5]. Начальное повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция вызывает активацию тромбоцитов ("shape-change"), для прохождения агрегации необходима активация P2Y12-рецепторов с угнетением аденилатциклазы через Gi-белки [6]. Последовательность действия АДФ на Р2-рецепторы тромбоцитов располагается в следующем порядке: ЕСбоР2Х1< ЕСаоР2^< <ЕСаоР2^2 [2].
В ранее проведенных исследованиях [3] конденсированное производное Ng-имидазобен-зимидазола - соединение РУ-286, продемонстрировало выраженные P2Y1-блокирующие свойства, подавляя активацию тромбоцитов в без-кальциевой среде.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить влияние тромбоцитов P2Xr и P2Y12-подтипов на пуриновые рецепторы в условиях in vitro и антитромботических свойств соединения РУ-286 на модели генерализованного тромбоза.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучение влияния веществ на пуриновые рецепторы выполнено на образцах плазмы 8 кроликов породы шиншилла массой 4-4,5 кг.
Функциональную активность тромбоцитов исследовали методом малоуглового светорассеяния [2] на приборе "Лайт-Скан" (НПФ "Люмекс", Россия). Особенностью метода является изучение функциональной активности тромбоцитов в солевой среде, с разбавлением плазмы, обогащенной тромбоцитами. Изменяя условия среды, можно отдифференцировать действие соединения на тот или иной тип пуринорецепторов. Активация тромбоцитов в присутствии 1 мМ CaCl2 отражает эффективность действия исследуемых соединений на P2X1- и P2Y1-рецепторы, а в безкальциевой среде (5 мМ ЭДТА) - только на Р2У1-рецепторы. Эффективность действия на пуриновые P2Y12-рецепторы тромбоцитов оценивается по ингибированию агрегации. В качестве индуктора активации и агрегации тромбоцитов использовалась динатриевая соль адено-зин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) ("Реанал", Венгрия). В качестве препаратов сравнения использовались Reactive blue 2 ("Sigma", США), PPADS ("Sigma", США). Для оценки влияния исследуемых веществ на процессы активации и агрегации тромбоцитов использовались следующие параметры: величина прироста сигнала ДА, начальная скорость агрегации V0, характеризующие процессы активации и агрегации соответственно. Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с использованием парного критерия Стьюдента, при этом выборка проверялась на нормальность распределения.
Для моделирования генерализованного тромбоза использовались 45 белых неимбред-ных мышей-самцов массой 20-26 г. В течение 18 часов до проведения экспериментов животные находились в условиях полной пищевой де-привации со свободным доступом к воде. В качестве индуктора агрегации вводили смесь растворов коллагена и адреналина (0,5 и 0,06 мг/кг соответственно) в хвостовую вену животного [4]. В качестве препаратов сравнения использовались тиклопидин и клопидогрель. Соединение РУ-286 (10,24 мг/кг), тиклопидин (6 мг/кг) и клопидогрель (7,32 мг/кг) вводились перорально за 2 часа до моделирования тромбоза. Животным контрольной группы вводилась вода дистиллированная в эквивалентном объеме. В качестве критерия эффективности исследуемых соеди-
4-2006
БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН
нений фиксировалось количество выживших животных по сравнению с контрольной группой и наличие тромбов в сосудах легких. За выжившими животными в течение 4 часов осуществлялось наблюдение, затем проводился забой под эфирным наркозом с последующей морфологической оценкой состояния легких. Обсчет результатов испытаний проводился с помощью точного критерия Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки влияния на ионотропные Р2Хгрецепторы проводилось изучение подавления активации тромбоцитов в кальциевой среде. Эффект соединения РУ-286 превышал таковой у Basilen blue, но был значительно меньше, чем у неселективного Р2Х-антагониста PPADS (табл. 1).
Сравнивая полученные результаты влияния соединений для кальциевой и безкальциевой сред, можно отметить, что долевое участие взаимодействия соединения РУ-286 с Р2ХГ рецепторами тромбоцитов для активации в кальциевой среде незначительно, подавление активации реализуется преимущественно за счет влияния на пуриновые P2Y1-рецепторы.
Соединение РУ-286 в концентрации 10-610-4 М достоверно ингибировало агрегацию тромбоцитов, индуцированную 200 нМ АДФ. Для данного вещества было определено ЕС20, которое составило 1,5-10-6 М.
Таблица 1
Влияние производного бензимидазола (10-6М) и антагонистов Р2-рецепторов Reactive blue 2 и PPADS на АДФ-индуцированное изменение функциональной активности тромбоцитов в средах с различным содержанием кальция (Д %, M+m)
Соединение Подавление активации д %****
в кальциевой среде** в безкальциевой среде***
РУ-286 -32,41+2,80* -29,43+2,62* -2,98
Reactive
blue 2 -25,02+2,38* -21,50+2,08* -3,52
PPADS -71,83+5,99* -30,00+2,74* -41,83
* - данные достоверны по отношению к контролю, ¿-критерий Стьюдента (р<0,05);
** - АДФ-индуцированная активация тромбоцитов в кальциевой среде отражает антагонистическую активность соединений по отношению к пуриновым Р2Х-1- и Р2У-т рецепторам тромбоцитов;
*** - АДФ-индуцированная активация тромбоцитов в безкальциевой среде отражает антагонистическую активность соединений по отношению к пуриновым Р2Уг рецепторам тромбоцитов;
**** - является разницей между эффектами соединений по влиянию на активацию тромбоцитов в кальциевой и без-кальциевой средах, отражает антагонистическую активность соединений по отношению к пуриновым Р2Х-|-рецепторам.
Таким образом, можно утверждать, что в условиях in vitro соединение РУ-286 эффективно подавляет функциональную активность тромбоцитов путем блокирования P2Yr и P2Y12-под-типов рецепторов.
Для изучения антитромботической активности в условиях целостного организма использовался метод, основанный на способности коллагена и адреналина при совместном внутривенном введении лабораторным животным вызывать глобальную внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов, приводящую к множественному тромбозу паренхиматозных органов [4].
При введении раствора, содержащего 0,5 мг коллагена и 0,06 мг адреналина из расчета на килограмм массы тела, в хвостовую вену животным контрольной группы были отмечены характерные признаки нарушения дыхательной функции легких: увеличение частоты и поверхностный характер дыхания, выраженный экзофтальм и изменение цвета радужной оболочки. Также для этой экспериментальной группы отмечался парез задних конечностей: мыши не двигались даже в ответ на толчки, не были способны отдергивать задние лапки при сильном нажатии. Визуально наблюдались тетанические судороги, животные принимали характерную позу, при которой задние лапы были выпрямлены и отведены назад. В течение 1-3 минут после введения индукторов тромбоза животные погибали. Выживаемость в контрольной группе составила 6,3 % (табл. 2). Извлеченные после гибели мышей легкие были темно-красного цвета, на всей их площади наблюдались множественные тромбы.
В экспериментальной группе, получивших тиклопидин, выживаемость достоверно не отличалась от контрольной группы и составила 30 %. При морфологической оценке отмечалось уменьшение площади легких, подвергшихся тромбозу.
Таблица 2
Влияние производного бензимидазола, тиклопи-дина и клопидогреля в эквимоляльных дозах (per os) на выживаемость белых мышей на модели коллаген-адреналинового генерализованного тромбоза
Соединение Количество животных в группе Выживаемость, %
Контроль 16 6,3
РУ-286 10 70
Тиклопидин 10 30
Клопидогрель 10 90**#
* - данные достоверны по отношению к контролю, точный критерий Фишера (р < 0,05);
** - данные достоверны по отношению к контролю, точный критерий Фишера (р < 0,01);
# - данные достоверны по отношению к группе крыс, получавших тиклопидин, точный критерий Фишера (р < 0,05).
ФОЮФ
I_БЮЛЛЕТЕНЬ ВОЛГ
Выживаемость в группе, получавшей клопи-догрель, составила 90 %, данные достоверны как по отношению к контролю (р < 0,01), так и по отношению к группе мышей, получавшей тиклопидин (р < 0,05). Легкие животных, которым вводили клопидогрель, имели нормальную окраску с минимальными точечными потемнениями.
При пероральном введении соединения РУ-286 гибель животных уменьшалась в 11,2 раза по сравнению с контролем (р < 0,01) и в 2,3 раза по сравнению с группой, получавших тиклопидин. По сравнению с клопидогрелем смертность в группе крыс, получивших соединение РУ-286, была выше на 20 %, однако различия не были статистически достоверны. Животные были более активны, наблюдалось уменьшение выраженности двигательных нарушений. Можно также отметить, что внешние проявления генерализованного тромбоза развивались постепенно в отличие от контрольной группы. Макроскопическая оценка при морфологическом исследовании легких показала сокращение площади массивного тромбоза, легкие в целом имели нормальную светло-розовую окраску.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии антитромботических свойств у антагонистов пуриновых P2Y1-
ДСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РАМН 4-2006 |
рецепторов, что позволяет рассматривать их как потенциальный класс новых антитромботиче-ских средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зиганшин А. У., Зиганшина Л. Е., Бернсток Дж. // Бюлл. эксперимент. биол. и медицины. - 2002. - Т. 134, № 10. - С. 364-370.
2. Сакаев М. Р., Миндукшев И. В., Лесиовская Е. Е. и др. // Эксперим. и клинич. фармакол. - 2000. - № 3. - С. 65-69.
3. Стуковина А. Ю., Черников М. В., Гоечко О. Ю. // Тез. докл. VIII Регион. конф. молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград, 2003. - С. 40-41.
4. Di Minno G., et al. // J. Clin. Invest. - 1985. - Vol. 75. - P. 328-338.
5. Hallam T. J., Rink T. J // J. Physiol. (Lond). -1985. - Vol. 368. - P. 131-146.
6. Hourani S. M. O., Hall D. A. // Trends Pharmacol. Sci. - 1994.-Vol. 15.-P. 103-108.
7. MacKenzie A. B., Mahaut-Smith M. P. // Biochim. Biophys. Acta. - 1996.-Vol. 1278, № 1.-P. 131-136.
8. Ralevic V., Burnstock J. // Pharmacol. Rev. -1998. - Vol. 50, №3. - P. 415-492.
Выражаем благодарность фирме "Sanofi-syntelabo", Франция, за любезно предоставленную субстанцию вещества клопидогрель.
© Коллектив авторов, 2006
УДК 615:547.854.4:616.98-097-022
СИНТЕЗ И АНТИ-ВИЧ-1 АКТИВНОСТЬ 1-[2-(2-БЕНЗИЛ-4-МЕТИЛФЕНОКСИ)ЭТИЛ]ПРОИЗВОДНЫХ
УРАЦИЛА
М. С. Новиков, Ю. А. Орлова, А. А. Озеров, Т. Хартман, Р. У. Букхайт
Лаборатория фармацевтической химии ВНЦ РАМН и АВО, ImQuest BioScience Inc. (США)
Ингибиторы обратной транскриптазы (ОТ) явились первым классом анти-ВИЧ препаратов, применяемым в клинике для лечения СПИДа. Они блокируют ранние стадии жизненного цикла вируса. В настоящее время известны две группы ингибиторов ОТ: нуклеозидные аналоги (зи-довудин, ламивудин) и ненуклеозидные ингибиторы ОТ ВИЧ (невирапин, делавердин, эфави-ренц). С теоретической точки зрения ингибиторы ОТ ВИЧ необходимо применять как для терапии, так и с профилактическими целями, поскольку они могут предотвращать интеграцию провирусной ДНК в клеточную ДНК.
С середины 1990-х годов в комбинированной терапии ВИЧ-инфекции и СПИДа стали применяться ингибиторы протеазы. Это дало заметное понижение заболеваемости и смертности от
оппортунистических инфекций. Использование в терапии СПИДа комбинации ингибиторов ОТ и ингибиторов протеазы способно обеспечить длительную супрессию репликации вируса и предупреждение лекарственной резистентности вируса, что приводит к долговременной клинической пользе [6, 7].
Однако применение в клинике ингибиторов ОТ и протеазы ограничено их специфическими недостатками: нуклеозидные ингибиторы ОТ имеют относительно невысокий терапевтический индекс и обычно вызывают у людей серьезные побочные эффекты; ненуклеозидные ингибиторы ОТ обладают меньшей токсичностью и более высокой специфичностью, однако к ним быстро развивается устойчивость вируса [10]; использование ингибиторов протеазы сопрово-
