CC BY
140
Антиоксидантный и прооксидантный эффекты арбутина и гидрохинона в эксперименте in vitro
Волобой Н.Л., Зверев Я.Ф., Брюханов В.М., Талалаева О.С., Замятина C.B., Зяблова О.Н., Смирнов И.В.
Antioxydant and prooxydant effects of arbutin and hydrohinon in experiment in vitro
Voloboy N.L., Zverev Ya.F., Bryukhanov V.M., Talalayeva O.S., Zamyatina S.V., Zyablova O.N., Smirnov I.V.
Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул
© Волобой Н.Л., Зверев Я.Ф., Брюханов В.М. и др.
Проведено сравнение антиоксидантной и прооксидантной активности арбутина и гидрохинона in vitro. Антиокси-дантную и прооксидантную активность арбутина и гидрохинона оценивали по их способности подавлять (индуцировать) окисление ТВИН-80. Арбутин и гидрохинон обладают антиоксидантными и прооксидантными свойствами. В эксперименте in vitro установлено, что в разных концентрациях влияние исследуемых веществ на процессы свободнорадикального окисления неодинаково: гидрохинон в большей степени является антиоксидантом, арбутин — прооксидантом.
Ключевые слова: арбутин, гидрохинон, свободнорадикальное окисление, антиоксидантная активность, прооксидантная активность.
The object of research is to compare antioxidant and prooxydant activity of arbutin and hydrochinon in vitro. Antioxidant and prooxydant activity of arbutin and hydrochinon is estimed of their ability to suppress/ induct oxydation ТВИН-80. Arbutin and hydrochinon have antioxydant and prooxydant properties. The conclusions are, that hydrochinon is more antioxydant, arbutin is more prooxydant.
Key words: arbutin, hydrochinon, free radical oxydation, prooxydant activity.
УДК 615.014.425:547.918:547.565.2]:57.085.2
Введение в антирадикальной системе может регулироваться природными и синтетическими антиоксидантами. На сегодняшний день очевидно, что генерация сво- Наличие антиоксидантных свойств в природных сое-бодных радикалов является одним из универсальных динениях открывает возможности создания новых лекар-патогенетических механизмов повреждения клетки. ственных препаратов и биологически активных добавок, От функционирования процессов свободнорадикаль- предназначенных для лечения и профилактики различного окисления (СРО) в значительной степени зависит ных заболеваний, нормализации обмена веществ и т.д. структурно-функциональная целостность клеток и тка- С другой стороны, известно, что большинство антира-ней организма. Антиоксидантная система противостоит дикальных соединений характеризуются двухфазным повреждающему эффекту свободных радикалов, непре- действием, т.е. антиоксидантный эффект при превы-рывно образующихся в организме человека [9]. шении некоторой пороговой величины сменяется про-Использование антиоксидантов, веществ, способ- оксидантным действием [5]. Основными выявленными ных ингибировать процессы СРО в объектах природно- на настоящий момент факторами, определяющими воз-го происхождения, получило широкое распространение можность инверсии антиоксидантных свойств, являют-в различных областях химии, биологии и медицины [6]. ся концентрация самого антиоксиданта, концентрация При патологических состояниях организма дисбаланс и химическая структура субстрата окисления и наличие
Волобой H.A., Зверев Я.Ф., Брюханов В.М. и др.
Антиоксидантный и прооксидантный эффекты арбутина...
в реакционной среде катионов металлов переходной валентности [8].
В связи с этим вопрос о необходимости детального изучения механизмов влияния природных антиоксидан-тов на процессы СРО является важной задачей современной науки.
В ряду известных антиоксидантов наибольшим разнообразием химических свойств и биологической активности обладают фенольные соединения [1], к которым относятся арбутин и гидрохинон. Считается, что арбутин и продукт его гидролиза гидрохинон обусловливают мочегонное, противовоспалительное и антисептическое действие многих растений, применяемых в урологической практике [12, 13]. Кроме того, установлено, что арбутин тормозит перекисное окисление линолевой кислоты, а с гидрохиноном связывают анти-гипоксические свойства листьев толокнянки [11]. Экспериментально доказано, что экстракты из растений, содержащих арбутин, в опытах на животных оказывают выраженное антиоксидантное действие [2, 9]. Однако какова роль арбутина и гидрохинона в реализации этого антиоксидантного эффекта? Ранее были проведены исследования по определению антиоксидантной активности арбутина и гидрохинона in vivo [4]. Полученные результаты потребовали дополнительных исследований для уточнения влияния арбутина и гидрохинона на процессы свободнорадикального окисления in vitro, чему и посвящена данная работа.
Материал и методы
Для оценки прооксидантной и антиоксидантной активности арбутина и гидрохинона в условиях in vitro проведено две серии опытов: в первой серии экспериментов исследовали растворы арбутина и гидрохинона в концентрациях 1 • 10-2 моль/л, во второй — растворы арбутина и гидрохинона в концентрациях 1 • 10-3 моль/л.
Определение общей антиоксидантной активности (ОАА) арбутина и гидрохинона основано на их способности подавлять Ре2+/аскорбатиндуцированное окисление твин-80 в модельной системе с последующим колориметрическим измерением продуктов окисления твин-80, ассоциированных с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [3]. К 2 мл 1%-го раствора твин-80 добавляли 0,1 мл исследуемого раствора, 0,2 мл раствора сульфата железа (II) концентрацией 1 ммоль, 0,2 мл раствора аскорбиновой кислоты концентрацией 10 ммоль, плотно укупоривали
и инкубировали при температуре 40 °С в течение 48 ч. Затем в полученную смесь добавляли 1 мл 40%-го раствора ТХУ и вновь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. После чего центрифугировали при 6 000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супер-натант в количестве 2 мл смешивали с 1 мл 0,25%-го раствора ТБК и инкубировали при температуре 100 °С в течение 15 мин. Затем пробы охлаждали и измеряли их оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 535 нм против дистиллированной воды. Расчет общей антиоксидантной активности проводили относительно контрольной пробы, для приготовления которой вместо опытного раствора добавляли эквиобъ-емное количество дистиллированной воды:
ОАА (% ) = ÜklM 100;
Ек
где Ек — оптическая плотность в контроле; Ео — оптическая плотность опытной пробы.
Общую прооксидантную активность (ОПА) оценивали по способности арбутина и гидрохинона индуцировать окисление твин-80 [7]. Для этого к 2 мл 1%-го раствора твин-80 добавляли 0,2 мл исследуемого раствора, плотно укупоривали и инкубировали при температуре 40 °С в течение 48 ч. Затем к полученной смеси добавляли 1 мл 40%-го раствора ТХУ и вновь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. После этого пробы центрифугировали при 6 000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант в количестве 2 мл смешивали с 1 мл 0,25%-го раствора ТБК. Смесь инкубировали при температуре 100 °С в течение 15 мин и после охлаждения измеряли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 535 нм против дистиллированной воды. Расчет общей прооксидантной активности (%) проводили относительно контрольной пробы, для приготовления которой вместо опытного раствора использовали эквиобъемное количество дистиллированной воды:
ОПА= (о ~Ек) 100;
Ео
где Ек — оптическая плотность в контроле; Ео — оптическая плотность опытной пробы.
Аналогично определяли ОАА и ОПА гидрохинона.
Результаты обрабатывали статистическим методом вариационных рядов Стьюдента с использованием программы Biostat для Windows.
Результаты
Результаты проведенных экспериментов показали, что в концентрации 1 • 10-2 моль/л гидрохинон проявляет выраженную антиоксидантную активность, подавляя Бе2+/аскорбатиндуцированное окисление твин-80 на 78,3% (таблица). Как видно из таблицы, последнее реализуется в увеличении показателя ОАА. Интересно, что в той же концентрации общую прооксидантную активность модельной системы гидрохинон стимулирует незначительно. Заметим, что показатель ОАА гидрохинона в концентрации 1 • 10-2 моль/ л был в 5 раз выше показателя ОПА в этой же его концентрации. Увеличение же концентрации раствора до 1 • 10-3 моль/л сопровождалось падением общей антиоксидантной активности гидрохинона в 2,3 раза и увеличением ОПА в 2,8 раза. Это, в свою очередь, устранило разницу между значениями ОАА и ОПА.
Антиоксидантный эффект арбутина in vitro оказался не столь выраженным. Так, ОАА арбутина в концентрации 1 • 10-2 моль/л был выше по сравнению с концентрацией 1 • 10-3 моль/л в 2 раза, а ОПА возрастала в концентрации 1 • 10-3 моль/л в 1,6 раза по сравнению с концентрацией 1 • 10-2 моль/л. При этом в концентрации 1 • 10-2 моль/л арбутин проявлял одинаковые про-и антиоксидантный эффекты. А вот в концентрации 1 • 10-3 моль/л показатель ОПА арбутина возрастал, превышая значения ОАА в 2,5 раза.
И, наконец, сравнение антиоксидантной активности гидрохинона и арбутина показало, что показатель ОАА гидрохинона в концентрации 1 • 10-2 моль/л в 1,7 раза выше, чем таковой у арбутина в той же концентрации. Однако в этих же концентрациях ОПА арбутина превышала данный показатель гидрохинона в 2,4 раза. В концентрациях 1 • 10-3 моль/л ОАА гидрохинона также превышала аналогичный показатель арбутина в 1,5 раза и, напротив, ОПА гидрохинона была достоверно ниже такового показателя арбутина в 1,4 раза.
Обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что арбутин и гидрохинон проявляют как антиоксидант-ные, так и прооксидантные свойства в эксперименте in vitro. При этом в данных экспериментальных условиях значительно преобладала антиоксидантная активность гидрохинона в концентрации 1 • 10-2 моль/л. Возможно, выявленные различия в эффектах арбутина и гидрохинона обусловлены особенностями их химической структуры. Известно, что арбутин является фенологликозидом и имеет в молекуле один фенольный гидроксил. Гидрохинон же при наличии двух фенольных гидроксилов активнее связывает Fe2+, препятствуя тем самым образованию свободных радикалов под действием Fe2+/аскорбатиндуциро-ванного окисления твин-80. Понятно, что в таком случае антиоксидантная активность гидрохинона будет выше.
Прооксидантные свойства изучаемых молекул, по всей видимости, также связаны с наличием в структуре фенольных гидроксилов. Следует отметить, что проокси-дантный эффект для обоих исследуемых веществ был более выражен в концентрациях 1 • 10-3 моль/л. Возможно, это объясняется тем, что в случае, когда эффективная концентрация антиоксиданта мала относительно концентрации зарождающихся свободных радикалов, большая часть молекул антиоксиданта быстро превращается в фе-ноксильные радикалы, которые способны с относительно высокой скоростью включаться в продолжение цепей реакций перекисного окисления липидов. В этом случае антиоксидант будет выступать не как ингибитор, а как субстрат реакций свободнорадикального окисления [8].
Интересно, что, сравнивая данные эксперимента in vitro с ранее полученными результатами оксидант-ной и антиоксидантной активности в опытах на крысах в условиях формалинового воспаления [4], можно отметить схожую картину поведения арбутина и гидрохинона в крови крыс и in vitro в концентрации
Показатели свободнорадикального окисления гидрохинона и арбутина in vitro
Гидрохинон Арбутин
ОАА, % ОПА, % ОАА, % ОПА, %
1 • 10-2 1 • 10-3 n = 12 n = 12 78,3 ± 1,01 33,8 ± 2,26* 1 • 10-2 1 • 10-3 n = 12 n = 10 15,2 ± 1,34 42,2 ± 3,15* 1 • 10-2 1 • 10-3 n = 12 n = 11 44,3 ± 3,09 22,8 ± 2,59* 1 • 10-2 1 • 10-3 n = 11 n = 12 37,0 ± 5,72 57,8 ± 3,64*
Примечание. n — количество экспериментов; звездочками обозначены достоверные изменения (p < 0,01) показателей ОАА и ОПА каждого вещества в разной концентрации, подчеркнутые цифры отражают достоверные изменения показателей арбутина и гидрохинона в одинаковых концентрациях между собой.
Boлoбoй H.A., Зверев Я.Ф, Брюхатв B.M. u др.
1 • 10-2 моль/л. Это дает возможность предполагать, что исследуемые вещества реализуют свое действие на оксидантно-антиоксидантную систему по схожему механизму как в живом организме, так и in vitro.
Заключение
Tаким образом, при сравнении антиоксидантных и прооксидантных свойств арбутина и гидрохинона in vitro установлено, что в разных концентрациях влияние исследуемых веществ на процессы CTO неодинаково. В концентрации 1 • 10-3 моль/л данные препараты проявляют в основном прооксидантное действие, причем у арбутина оно более выражено, а в концентрации 1 • 10-2 моль/л преобладает антиоксидантный эффект, при этом он значительно выше у гидрохинона.
Сравнительный анализ показателей оксидантно-антиоксидантной системы в экспериментах in vivo и in vitro позволяет предполагать схожий механизм действия изучаемых веществ в пробирке и в живом организме.
Литература
1. Aнmоновa H.A. Редокс-свойства и антиоксидантная активность соединений, содержащих фрагмент пространственно-затрудненного фенола: автореф. дис. . канд. хим. наук. Aстрахань, 2010. 24 с.
2. Aрбузовa ß.C, Замятина C.B. O6 антиоксидантной активности растений семейства грушанковых и сборов, созданных на их основе // Oкисление, окислительный стресс, антиоксиданты. Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. академика H.M. Эмануэля. Доклады и тезисы. M.: Изд-во РУДН, 2006. C. 160—162.
3. Благородов C.B., Шелепов A.Ï., Дмитриева H.A. и др. Mе-тод определения антиокислительной способности и синтетические антиоксиданты в ряду производных оксазина и
Антиоксидантный и прооксидантный эффекты арбутина.
непредельных хлоркетонов // Тезисы II Всесоюзной конференции «Биоантиоксидант». Черноголовка, 1986. С. 28—29.
4. Брюханов В.М., Смирнов И.В., Бондарев А.А. и др. Влияние арбутина и гидрохинона на процессы свободно-радикального окисления в крови крыс // Биомедицина. 2011. № 1. С. 41—49.
5. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высшая школа, 1989. 199 с.
6. Вторушина А.Н. Метод вольтамперометрии в определении антиоксидантных свойств некоторых биологически активных соединений: автореф. дис. ... канд. хим. наук. Томск, 2008. 21 с.
7. Галатионова Л.П., Молчанов А.В., Ельчанинова С.А. и др. Состояние перекисного окисления у больных с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки // Клиническая и лабораторная диагностика. 1998. С. 11—14.
8. Зайцев В.Г. Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиоксидантно-го действия лекарственных препаратов: автореф. дис. . канд. биол. наук. Волгоград, 2001. 23 с.
9. Замятина С.В., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф. и др. Влияние некоторых сборов из лекарственных растений Алтайского края на процессы свободнорадикального окисления в эксперименте // Юбилейный сборник научных статей. Барнаул, 2005. С. 80—88.
10. Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю., Горобец Н.И. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия. Киев: Морион, 2004. 160 с.
11. Куцик Р.В., Зузук Б.М., Недоступ А.Т., Пецко Т. Толокнянка обыкновенная Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. (аналитический обзор) // Провизор. 2003. № 18. Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.provisor.com.ua.
12. Frohne D. The urinary disinfectant effect of extract from leaves uva ursi // Planta Med. 1970. № 18. P. 1—25.
13. Matsuda H., Tanaka T, Kubo M. Pharmacological study sheet Arctostaphylos uva-ursi (L). Spreng. III. A combined effect of arbutin and indomethacin on immuno-inflammation // Yakugaku zasshi: Journal of the Pharmaceutical Society of Japan. 1991. V. 111 (4—5). P. 253—258.
Поступила в редакцию 10.04.2011 г.
Утверждена к печати 01.06.2011 г.
Сведения об авторах
H.A. Волобой — преподаватель кафедры фармакогнозии и ботаники АГМУ (г. Барнаул). Я.Ф. Зверев — д-р мед. наук, профессор кафедры фармакологии АГМУ (г. Барнаул).
B.М. Брюханов — д-р мед. наук, профессор кафедры фармакологии АГМУ (г. Барнаул). О.С. Талалаева — канд. мед. наук, ассистент кафедры фармакологии АГМУ (г. Барнаул).
C.В. Замятина — канд. мед. наук, ассистент кафедры фармакологии АГМУ (г. Барнаул). ОН. Зяблова — преподаватель кафедры фармакогнозии и ботаники АГМУ (г. Барнаул).
И.В. Смирнов — канд. мед. наук, доцент кафедры фармакогнозии и ботаники АГМУ (г. Барнаул). Для корреспонденции
Волобой Нина Аеонидовна, тел. 8-923-720-7074; e-mail: [email protected]
