CC BY
16
УДК 577.23
Антиоксидантные свойства фуростанолового гликозида
из диоскореи дельтовидной. Исследование на изолированных
митохондриях печени
11 2 1
'О.В. Кожина, 'М.А. Шаталова, 2А.М. Носов, 'В.Н. Самарцев
1 Марийский государственный университет, Йошкар-Ола 2Институт физиологии растений РАН, Москва
В работе показано, что в изолированных митохондриях печени в контролируемом состоянии при окислении сукцината в присутствии ротенона и олигомицина происходит аккумуляция диеновых конъюгатов. Это свидетельствует о протекании в митохондриях свободно-радикальных реакций, инициирующих перекисное окислением липидов. Инкубация митохондрий с фуростаноловым гликозидом приводит к замедлению аккумуляции диеновых конъюгатов. Аналогичным действием обладают известные антиоксиданты - уборщики свободных радикалов - тиомочевина и тролокс. Фуростаноловый гликозид не влияет на дыхание митохондрий в отсутствие или в присутствии только пальмитата. Вместе с тем, дыхание в присутствии пальмитата не подавляется аспартатом или карбоксиатрактилатом при введении этих соединений после пальмитата, но при добавлении их в другой последовательности - карбокси-атрактилата после аспартата или аспартата после карбоксиатрактилата - эти агенты в существенной степени ингибируют дыхание. Эти данные рассматриваются как свидетельство формирования разобщающего комплекса при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров. Сделано заключение, что фуростаноловый гликозид из диоскореи дельтовидной обладает антиоксидантными свойствами. Действие его заключается: во-первых, непосредственно в снижении образования активных форм кислорода в митохондриях; во-вторых, в усилении одного из путей антиоксидантной защиты - протонофорного разобщающего действия жирных кислот.
The accumulation of conjugated dienes in the resting state in liver mitochondria at oxidation of succinate in the presence of rotenone and oligomycin is shown in the present work. It testifies to free radical reactions in mitochondria which initiate lipid peroxidation. Incubation of mitochondria with furostanol glycoside results in inhibition of accumulation of conjugated dienes. Similar action have antioxidants - free radical scavengers - thiourea and trolox. Furostanol glycoside does not influence respiration of mitochondria in the absence or in the presence of palmitate only. At the same time in the presence of palmitate respiration of mitochondria is not suppressed by aspartate or carboxyatractylate being added after palmitate, but at their addition in the reverse order - carboxyatractylate after aspartate or aspartate after carboxyatractylate -these agents essentially inhibit the respiration. These data are considered to be the evidence of formation of uncoupling complex with participation of ADP/ATP- and aspartate/glutamate antiporters. The conclusion emphasizes the fact that furostanol glycoside from Dioscorea deltoidea has properties of antioxidants. Its action is evident firstly, in direct decrease of reactive oxygen species formation in mitochondria, secondly, in amplification of one of ways of antioxidant protection - protonophore action of fatty acids.
Живые организмы при действии на них различных раздражителей физической или химической природы реагируют проявлением неспецифических признаков. Эти признаки в своей совокупности составляют основу «общего адаптационного синдрома», вызываемого различными повреждающими агентами. Этот важнейший биологический феномен, называемый также стрессом, присущ всем живым существам с достаточно высокой степенью структур-но-функци-ональной организации [1-3]. После воздействия стрессорного фактора выделяют три фазы общего адаптационного синдрома: реакция тревоги -«аварийная фаза», переход к устойчивой адаптации и фаза истощения или дезадаптации. В первую фазу
возникают существенные сдвиги метаболизма, носящие катаболический характер, в частности, происходит усиление активности липаз и фосфолипаз, увеличение интенсивности свободнорадикальных реакций, приводящих к перекисному окислению липидов клеточных мембран, мутации ДНК, окислению белков [2-4]. Адаптация в эту фазу является несовершенной. Наблюдается избыточная активация систем жизнеобеспечения, что само по себе может приводить к повреждению клеток [2, 3]. Не вызывает сомнения, что большое значение имеет поиск способов и средств коррекции адаптивно-компенсаторных реакций организма. Известно, что негативное проявление стресса может быть ослаблено с помощью различных фарма-
кологических средств растительного происхождения. Среди них наше внимание привлекли обладающие широким спектром фармакологической активности фуро-станоловый гликозид из растения диоскореи дельтовидной [5].
Под влиянием стрессорного фактора в первую фазу развития общего адаптационного синдрома наблюдается повышение содержания свободных (неэтерифи-цированных) жирных кислот [6, 7]. Эти соединения являются природными разобщителями окислительного фосфорилирования. В митохондриях печени в отсутствие ионов кальция протонофорное разобщающее действие жирных кислот осуществляется при участии белков-переносчиков внутренней мембраны: АЭР/АТР-и аспартат/глутаматного антипортеров [8-11]. В этом случае ингибитор АЭР/АТР-антипортера карбоксиат-рактилат и субстраты аспартат/глутаматного антипортера аспартат и глутамат способны подавлять разобщающее действие жирных кислот [10, 11].
Одним из основных источников активных форм кислорода, образующихся в клетках, являются митохондрии [4, 12]. В процессе одноэлектронного восстановления кислорода в I и III комплексах дыхательной цепи образуется непосредственно супероксидный анион-радикал, из которого вследствие последующих химических реакций как ферментативных, так и неферментативных, могут образовываться пероксид водорода, гидроксильный радикал и другие активные формы кислорода [4, 13, 14]. Митохондриальные структуры чрезвычайно чувствительны к окислительному стрессу, вызванному активными формами кислорода, образующимися в дыхательной цепи, или действием различных окисляющих агентов [4, 13]. Образование активных форм кислорода в митохондриях может быть снижено путем индуцированного жирными кислотами протонной проводимости внутренней мембраны (мягкое разобщение) или другими механизмами активации свободного дыхания [8, 15].
Целью настоящей работы является исследование антиоксидантных свойств фуростанового гликозида на изолированных митохондриях при условии образования в них активных форм кислорода, а также изучение влияния этого соединения на протонофорное разобщающее действие жирных кислот как одного из путей антиоксидантной защиты митохондрий.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Митохондрии были выделены из печени белых беспородных крыс общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью свободного от жирных кислот бычьего сывороточного альбумина [11]. Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали бычий сывороточ-
ный альбумин. Дыхание митохондрий регистрировали при температуре 25°С с помощью кислородного электрода Кларка и полярографа LP-9. Концентрация белка митохондрий в кислородной ячейке ~1,2 мг/мл. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ KCl, 5 мМ сукцинат калия, 2 мМ MgCl2, 0,5 мМ ЭГТА, 5 мМ морфолинопропансульфоновую кислоту-трис (рН 7,0). Олигомицин (2 мкг/мл) и 2 мкМ роте-нон добавляли в кислородную ячейку сразу после митохондрий.
Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата выражали в процентах и определяли как отношение величины ингибирования дыхания в присутствии пальмитата одним из этих ресопря-гающих агентов к величине стимуляции дыхания пальмитатом по формуле:
100хД/и/(./и - J), где Ju и Jo - скорости дыхания соответственно в присутствии и в отсутствие пальмитата;
DJu - величина снижения скорости дыхания ре-сопрягающим агентом.
Содержание диеновых коньюгатов в митохондриях определяли после экстракции в гептане спектрофо-тометрическим методом [16]. Митохондрии (1,4 мг белка на мл) суспендировали в среде инкубации при перемешивании при 25°С. Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях выражали в относительных единицах как фактор а, который определяли по формуле:
а = (АА - ДА0) / ДА0, где АА0 и АА - оптическая плотность гептанового экстракта при 233 нм в начальный момент времени инкубации митохондрий и через 5 мин соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии опытов было исследовано влияние фуростанолового гликозида на способность митохондрий продуцировать диеновые конъюгаты в отсутствие синтеза АТР или разобщения окислительного фосфо-рилирования (контролируемое состояние). В этих опытах для сравнения использовались хорошо изученные антиоксиданты - уборщики свободных радикалов: водно-растворимый аналог а-токоферола тролокс [17] и тиомочевина [18]. Как известно, в контролируемом состоянии дыхательная цепь митохондрий продуцирует активные формы кислорода [8, 17]. В наших опытах (табл. 1) инкубация митохондрий в контролируемом состоянии в присутствии сукцината, ротенона и олигомицина сопровождается аккумуляцией диеновых конъюгатов. Продукция диеновых конъюгатов в биологических системах рассматривается как свидетельство усиления свободно-радикальных реакций, инициирующих перекисное окисление липидов [16, 19]. Добавление фуростанолового гликозида к
митохондриям приводит к замедлению аккумуляции диеновых конъюгатов в контролируемом состоянии (табл. 1). Аналогичным действием обладают тиомо-чевина и тролокс (табл. 1). Подавление аккумуляции диеновых конъюгатов наблюдается также при инкубации митохондрий в присутствии пальмитата (табл. 1), что согласуется с известными данными о способности жирных кислот подавлять образование активных форм кислорода в митохондриях путем индукции мягкого разобщения [8, 15]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фуростано-ловый гликозид способен подавлять свободно-радикальные реакции в митохондриях в той же степени, как известные антиоксиданты тиомочевина и тролокс.
Таблица 1 - Влияние фуростанолового гликозида (ФСГ) и антиоксидантов на аккумуляцию диеновых конъюгатов в митохондриях печени в контролируемом состоянии
Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, рН 7,0. Исследуемые соединения были добавлены сразу после митохондрий. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.
*Различия между опытом (присутствие модулирующего агента) и контролем (отсутствие модулирующего агента) статистически достоверны, р < 0,01 (критерий Стьюдента).
В следующей серии опытов было исследовано влияние фуростанолового гликозида на протонофорное разобщающее действие жирных кислот. При изучении разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени в среде инкубации обязательно присутствовали ЭГТА, ионы магния, олигомицин и ротенон. В присутствии этих реагентов, как показано нами ранее [20], стимуляция дыхания митохондрий жирными кислотами обусловлена только их протонофорным действием, главным образом, при участии ЛОР/ЛТР-и аспартат/глутаматного антипортеров. В наших экспериментах применялся пальмитат, как анион одной из наиболее распространенных природных жирных кислот [21]. В предварительных опытах было установлено, что зависимость скорости дыхания митохондрий печени крыс от концентрации пальмитата в пределах от 0 до 40 мкМ близка к линейной. Во всех последующих экспериментах концентрация пальми-тата составляла 30 мкМ. Карбоксиатрактилат и аспар-тат были использованы в качестве ресопрягающих агентов, т.е. соединений, подавляющих разобщающее действие жирных кислот. Этот их эффект может быть
оценен по способности ингибировать дыхание митохондрий в присутствии пальмитата [8-11]. Карбокси-атрактилат специфически реагирует с ADP/ATP-антипортером. Подавление этим ингибитором разобщающего действия жирных кислот рассматривается как свидетельство участия в разобщении ADP/ATP-антипортера [8, 9]. По аналогии с этим вывод об участии в разобщении аспартат/глутаматного антипортера был сделан на основании способности его субстратов глутамата и аспартата подавлять разобщающее действие жирных кислот [8-11].
Как показано в таблице 2, без фуростанолового гликозида дыхание митохондрий печени в присутствии пальмитата подавляется при последующем добавлении аспартата, а затем карбоксиатрактилата (А), или сначала карбоксиатрактилата, а затем аспартата (Б). Фуростаноловый гликозид не влияет на дыхание митохондрий в отсутствие или в присутствии только пальмитата. Вместе с тем, дыхание в присутствии пальмитата не подавляется аспартатом или карбокси-атрактилатом при введении этих соединений после пальмитата, но при добавлении их в другой последовательности - карбоксиатрактилата после аспартата или аспартата после карбоксиатрактилата - эти агенты в существенной степени ингибируют дыхание (табл. 2).
Таблица 2 - Влияние аспартата и карбоксиатрактилата (А) или карбоксиатрактилата и аспартата (Б) на стимулированное пальмитатом дыхание митохондрий печени в отсутствие (контроль) и в присутствии фуростанолового гликозида (ФСГ)
Добавки Скорость дыхания, нмоль О2/мин на 1 мг белка
контроль (n = 4) ФСГ 300 мкМ (n = 4)
А. Без добавок Пальм Пальм + Асп Пальм + Асп + Катр Пальм + Асп + Катр + ДНФ 11,4 ± 0,3 2,9 ± 1,1 19,6 ± 1,0 13,9 ± 0,6 83,3 ± 5,4 11,5 ± 0,4 26,2 ± 0,8 24,3 ± 0,7* 14,0 ± 0,4 73,2 ± 5,2
Б. Без добавок Пальм Пальм + Катр Пальм + Катр + Асп Пальм + Катр + Асп + ДНФ 11,1 ± 0,4 26,0 ± 1,2 20,4 ± 1,0 13,6 ± 0,4 80,4 ± 5,5 11,2 ± 0,5 26,1 ± 1,0 25,4 ± 1,1* 13.6 ± 0,7 76.7 ± 4,6
Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, рН 7,0. Пальм - 30 мкМ пальмитата, Катр - 1 мкМ карбоксиатрактилата, Асп - 3 мМ аспартата, ДНФ - 50 мкМ 2,4-динитрофенола. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.
* Различия между опытом (присутствие ФСГ) и контролем (его отсутствие ) статистически достоверны, р < 0,01 (критерий Стьюдента).
Способность карбоксиатрактилата или аспартата подавлять разобщающее действие жирных кислот можно выразить количественно как ресопрягающий эффект [10, 20]. В отсутствие влияния на разобщение ресопрягающий эффект равен 0, при полном подавле-
Условия эксперимента AÄ0 а (отн. единицы)
Контроль(n = 9) ФСГ 300 мкМ (n = 5) Тиомочевина 200 мкМ (n = 5) Тролокс 30 мкМ (n = 5) Пальмитат 25 мкМ (n = 6) 0,073 ± 0,003 0,072 ± 0,002 0,075 ± 0,003 0,074 ± 0,002 0,073 ± 0,004 0,203 ± 0,018 0,088 ± 0,028* 0,060 ± 0,022* 0,065 ± 0,010* 0,079 ± 0,020*
нии стимуляции дыхания пальмитатом величина ре-сопрягающего эффекта достигает своего максимального значения 100%.
Таблица 3 - Влияние фуростанолового гликозида (ФСГ) на ресопрягающие эффекты аспартата и карбоксиатрактилата при добавлении их по отдельности или одновременно после пальмитата
Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части, рН 7,0. Катр - 1 мкМ карбоксиатрактилата, Асп - 3 мМ аспартата. Остальные добавки, как в таблице 2. Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.
* Различия между опытом (присутствие ФСГ) и контролем (его отсутствие ) статистически достоверны, р < 0,01 (критерий Стьюдента).
В таблице 3 приведены величины ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата в отсутствие и в присутствии фуростанолового гликозида. Эти данные свидетельствуют о том, что инкубация митохондрий в контролируемом состоянии с этим антиок-сидантом, в соответствии с условиями таблицы 1, приводит к изменению характера ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата. Каждый из этих ресопрягающих агентов не оказывает влияния на действие пальмитата, в то время как совместно они на 80% подавляют его разобщающее действие. Это, как предполагалось нами ранее [22-24], может свидетельствовать о формировании разобщающего ком -плекса ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипор-теров с общим пулом жирных кислот.
В предыдущих работах [22-24] формирование разобщающего комплекса при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров было вызвано окислением критических SH-групп митохондрий. Было предположено, что этот феномен связан с деструктивными изменениями в митохондриях при окислительном стрессе [22-24]. Формирование разобщающего комплекса при участии ADP / ATP- и аспартат / глута-матного антипортеров можно также рассматривать как усиление протонофорного действия жирных кислот путем снятия ресопрягающих эффектов аспартата или карбоксиатрактилата. Поскольку, как уже отмечалось во введении, индукция протонофорного действия жирных кислот приводит к снижению продукции активных форм кислорода в митохондриях, можно предположить, что формирование разобщающего комплекса при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипор-теров является адаптационным процессом, направленным на защиту митохондрий от протекающих в них свободно-радикальных реакций.
Таким образом, проведенные исследования на изолированных митохондриях печени показали, что фуростаноловый гликозид из диаскореи дельтовидной обладает антиоксидантными свойствами. Действие его заключается, во-первых непосредственно в снижении образования активных форм кислорода в митохондриях; во-вторых, в усилении одного из путей антиоксидантной защиты - протонофорного разобщающего действия жирных кислот.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 05-04-48688) и Программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008 годы)» по мероприятию 1 в рамках тематического плана Марийского государственного университета (№ 1.1.06).
ЛИТЕРАТУРА
1. Селье Г. Новое о гормонах и механизме их действия. - Киев: Наукова Думка, 1977. - С. 27-51.
2. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. - Новосибирск: Наука, 1983. - 234 с.
3. Начала физиологии: Учеб. для вузов. 2-е изд., испр. / Под ред. акад. А.Д. Ноздрачева. - СПб.: Изд-во «Лань», 2002. - 1088 с.
4. Lenaz G. // Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - Vol. 1366. - P. 53-67.
5. Носов А.М., Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1986. - С. 76-79.
6. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. - М.: Наука, 1989. - 564 с.
7. Lenton L.M., Behm C.A., Bygrave F.L. // Biochim. J. - 1995. -Vol. 307. - P. 425-431.
8. Skulachev V.P. // Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - Vol. 1363. - № 2. - P. 100-124.
9. Мохова Е.Н., Хайлова Л.С. // Биохимия. - 2005. - Т. 70. -Вып. 2. - С. 197-202.
10. Samartsev V.N., Mokhova E.N., Skulachev V.P. // FEBS Lett. -1997. - Vol. 412. - № 1. - P. 179-182.
11. Samartsev V.N., Smirnov A.V., Zeldi I.P., Markova O.V., Mokhova E.N., Skulachev V.P. // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - Vol. 1339. - P. 251-257.
12. Brand M.D., Affourtit C, Esteves T.C., Green K., Lambert A J, Miwa S., Pakay J.L., Parker N. // Free Rad. Biol. Med. - 2004. - Vol. 37. -P. 755-767.
13. Skulachev V.P. // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2002. - Vol. 959 -P. 214-237.
14. Андреев А.Ю., КушнареваЮ.Е., Старков А.А. // Биохимия. 2005. - Т. 70. - Вып. 2. - С. 246-264.
15. Korshunov S.S., Korkina O.V., Ruuge E.K., Skulachev V.P., Starkov A.A. // FEBS Lett. - 1998. - Vol. 435. - P. 215-218.
16. Ambrosio G., Flaherty J.T., Duilio C., Tritto I., Santoro G., Elia P.P., Condorelli M, ChiarielloM.J. // Clin. Invest. - 1991. - Vol. 87. -P. 2056-2066.
17. DaviesM.J., Forni L.G., Willson R.L. // Biochem. J. - 1988. -Vol. 255. - P. 513-522.
18. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. - М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. - 343 с.
19. Slater T.F. // Biochem. J. - 1984. Vol. 222. - P. 1-15.
20. Самарцев В.Н., Маркова О.В., Зелди И.П., Смирнов А.В. // Биохимия. - 1999. - Т. 64. - С. 1073-1084.
21. Wojtczak L., Schönfeld P. // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. -Vol. 1183. - P. 41-57.
22. Samartsev V.N., Kozhina O.V., PolishchukL.S. // Biochim. Biophys. Acta; EBEC Short Reports. - 2006. - Vol. 14. - P. 389.
23. Самарцев В.Н., Кожина О.В., Полищук Л.С. // Биол. мембраны. - 2005. - Т. 22. - № 2. - С. 92-97.
24. Самарцев В.Н., Кожина О.В., Полищук Л.С. // Биол. мембраны. - 2005. - Т. 23. - № 5. - С. 402-411.
Ресопрягающие соединения Ресопрягающий эффект, %
контроль(n = 4) ФСГ 300 мкЫ (n = 4)
Асп 45,S i 2,3 12,2 i 1,1*
Катр 37,5 i 1,9 S,3 i 1,2*
Асп + Катр S3,9 i 2,9 S2,6 i 2,7
