CC BY
133
УДК 616.127-005.8/616-092.9
МЕХАНИЗМЫ РАЗОБЩЕНИЯ ДЫХАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ СЕРДЦА ПРИ РАЗВИТИИ СТРЕПТОЗОТОЦИН-ИНДУЦИРОВАННОГО ДИАБЕТА НА ФОНЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИНФАРКТА
М.В. Егорова, С.А. Афанасьев, С.В. Попов
ФГБУ "НИИ кардиологии" СО РАМН, Томск E-mail: mwegorova@yandex.ru
MECHANISMS OF UNCOUPLING OF MITOCHONDRIAL RESPIRATION IN THE DEVELOPMENT OF STREPTOZOTOCIN-INDUCED DIABETES IN THE BACKGROUND OF EXPERIMENTAL MYOCARDIAL INFARCTION
M.V. Egorova, S.A. Afanasiev, S.V. Popov
Federal State Budgetary Institution "Research Institute for Cardiology" of Siberian Branch under the Russian Academy
of Medical Sciences, Tomsk
Изучали механизмы разобщения окислительного фосфорилирования в изолированных митохондриях сердца крыс при экспериментальном инфаркте и стрептозотоцин-индуцированном диабете. Установлено, что при обеих патологиях и их сочетании ингибирование митохондриальной поры и/или адениннуклеотидтранслоказы приводит к подавлению свободного дыхания митохондрий сердца. Мы предполагаем, что разобщение окислительного фосфорилирования в МХ сердца при рассматриваемых патологиях выполняет защитную функцию. Причем этот процесс реализуется с одновременным включением как минимум двух механизмов - с участием АДФ/ АТФ-антипортера и циклоспорин-чувствительной поры.
Ключевые слова: митохондрии, ишемия миокарда, диабет, адаптация.
Mechanisms of uncoupling of oxidative phosphorylation in isolated heart mitochondria of rats with experimental myocardial infarction and streptozotocin-induced diabetes was studied. It was found that inhibition of mitochondrial pore and / or adenine nucleotide translocase led to suppression of free respiration of heart mitochondria of rats with separate pathologies and their combination. It was suggested that uncoupling of oxidative phosphorylation in heart mitochondria performs protective role and is implemented with the simultaneous inclusion of at least two mechanisms involving ADP/ATP-antiporter and cyclosporin-sensitive pore.
Key words: mitochondria, myocardial ischaemia, diabetes, adaptation.
Введение
В настоящее время сахарный диабет в связи с серьезными метаболическими изменениями рассматривается как фактор, осложняющий течение хронической сердечной недостаточности [1, 7, 10, 14]. При недостаточном кровоснабжении или диабете функциональные расстройства в миокарде связаны с накоплением токсичных промежуточных продуктов окисления [10, 14], стимулирующих неспецифическую проницаемость мембран и разобщение окислительного фосфорилирования [6, 8, 13, 14].
При увеличении активных форм кислорода (АФК) и накоплении ионов кальция разобщение окислительного фосфорилирования с участием свободных жирных кислот (СЖК) может быть обусловлено формированием и открытием митохондриальной Са2+-чувствительной неспецифической поры (МНП) [6, 13, 15].
В экстремальных природных условиях (гипоксия, гипо- и гипертермия и др.) повышенная проницаемость внутренней мембраны митохондрий и супрессия системы окислительного фосфорилирования являются временными и носят защитно-приспособительный характер [9]. Увеличение содержания триглицеридов в миокарде, изменение интенсивности окисления СЖК и индуциро-
ванное ими разобщение окислительного фосфорилиро-вания в митохондриях сердца в современной литературе рассматриваются и с позиции защиты миокарда от накопления вредных продуктов обмена в ткани сердца при сердечной недостаточности и сахарном диабете [10, 14]. Вероятно, этот механизм может участвовать в развитии ишемической резистентности миокарда у взрослых животных с небольшим сроком стрептозотоцин-индуциро-ванного диабета [3, 12].
Цель исследования: оценить защитное действие различных механизмов разобщения окисления и фосфорилирования в митохондриях, протекающих с участием СЖК, при развитии ишемического и диабетического повреждения миокарда.
Материал и методы
Исследования выполнены на половозрелых крысах-самцах (250-300 г) линии Вистар. Для моделирования инфаркта миокарда (И) животным под эфирным наркозом осуществляли перевязку левой передней нисходящей коронарной артерии [5]. Развитие постинфарктных изменений верифицировали морфологически. Гипертрофию миокарда определяли по соотношению массы сердца к
массе тела и массы левого желудочка к массе сердца, как описано ранее [4, 5].
Сахарный диабет (Д) индуцировали однократным введением стрептозотоцина (Sigma, США) в дозе 60 мг/кг внутрибрюшинно, разведенного 0,01 моль/л цитратным буфером (рН 4,5) [3]. Верификацию Д осуществляли по увеличению концентрации глюкозы в крови крыс в 34,5 раза, снижению массы тела, развитию полиурии и полидипсии [4].
Было сформировано 5 экспериментальных групп животных: I группа - контроль - интактные животные; II группа - животные после моделирования инфаркта миокарда (И); III группа - животные с индуцированным сахарным диабетом (Д); IV группа - постинфарктные животные со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом (И+Д); V группа - животные, у которых после индукции сахарного диабета моделировали инфаркт миокарда (Д+И) (табл. 1). В каждой группе выделены подгруппы соответственно срокам после моделирования рассматриваемых состояний - через 2, 4 и 6 недель (табл. 1).
По причине высокой смертности животных в V экспериментальной модели образовано только две подгруппы животных (табл. 1).
Митохондрии (МХ) из миокарда животных получали стандартным методом дифференциального центрифугирования в сахарозной среде, содержащей 250 мМ сахарозу, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES, рН 7,4 [4]. До исследования митохондрии суспендировали и хранили в среде, содержащей 250 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES, рН 7,4.
Скорость поглощения кислорода митохондриями определяли полярографически, с помощью электрода Кларка. Измерение проводили в среде (рН 7,4), содержащей: 300 мМ сахарозу, 10 мМ КС1, 5 мМ КН2РО4, 1,2 мМ MgC12, 1 мМ ЭГТА, 5 мМ сукцинат, 2 мкМ ротенон, 5 мМ HEPES. Добавки: олигомицин (олиго), ингибитор протонного канала АТФ-синтетазы, 2 мкг/мл+200 мкМ АДФ; А23187, Са2+-ионофор, 0,2 мкг/мл+1 мМ ЭГТА; карбокси-атрактилат (кАтр), ингибитор АТФ/АДФ-антипортера, 2 мкМ; циклоспорин А (циклоА), ингибитор МНП-поры, 2 мкг/мл. В работе использовали реактивы фирмы MP Biomedicals, Sigma и ICN (USA).
Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. Значения исследуемых показателей представлены в виде средних значений+стандартная ошибка среднего (M±m). Распределение величин исследуемых параметров не соответствовало закону нормального распределения (критерий Шапиро-Вилка; р>0,05). Статистическую значимость различий исследуемых параметров между сравниваемыми группами оценивали непараметрическим ранговым U-критерием Манна-Уитни, внутри групп - критерием Вилкоксона для зависимых переменных. За уровень статистической значимости принимали p<0,05.
Результаты и обсуждение
В нашем исследовании АДФ (в присутствии олигоми-цина) и кАтр снижали скорость потребления кислорода МХ во всех экспериментальных группах (табл. 2). Это
наблюдение согласуется с данными о том, что кАтр или АДФ (как субстрат АТФ/АДФ-антипортера) могут ингибировать протонофорное действие СЖК [6, 8]. Отсюда можно предположить, что при рассматриваемых патологиях и их сочетании увеличение скорости потребления кислорода обусловлено именно протонофорным действием СЖК.
Однако следует отметить, что в подгруппах сочетанной патологии И2Д6, И4Д6, И6Д6 и Д2И4 на отдаленных сроках развития реакция на кАтр и/или АДФ была слабо выражена. Возможно, что такой результат обусловлен перемещением СЖК к аспартат/глутаматному антипортеру под влиянием кАтр. Действительно, в исследовании [8] показано, что АДФ/АТФ- и аспартат/глутаматный ан-типортеры могут функционировать совместно как разобщающий комплекс с общим пулом СЖК.
С другой стороны, известно, что протонофорное действие СЖК зависит от интенсивности формирования АФК [6, 8, 13]. Так, в присутствии антиоксидантов разобщающая активность пальмитата приблизительно на 80% подавляется АДФ [8]. Соответственно, сохраненная реакция на АДФ свидетельствует о высокой активности антиок-сидантных систем в митохондриях, а уменьшение реакции на АДФ - по мере развития рассматриваемых патологий - может быть следствием истощения их антиокси-дантных возможностей.
Кроме того, СЖК, наряду с представленным выше механизмом, могут оказывать разобщающее действие на окислительное фосфорилирование более радикальным путем - с участием МНП [2, 6, 13, 15]. В нашем исследовании ингибирование МНП добавлением в среду инкубации циклоА приводило к статистически значимому подавлению дыхания митохондрий в группах животных с монопатологиями (табл. 2). При сочетанных патологиях ингибирующее действие циклоА проявлялось не во всех группах, а именно, отсутствовало в подгруппах И4Д2-Д6 (IV группа) и Д2И2-4 (V группа) (табл. 2). Следует отметить, что в подгруппе И4Д2-6 отсутствовала реакция не только на циклоА, но и на кАтр, а нарастание V при
^ ’ * ' г сукцинат г
этом было наиболее медленным в сравнении с остальными экспериментальными группами (табл. 2). Возможно, это объясняется некоторой стабилизацией морфофункциональных показателей в рассматриваемые сроки сочетанной патологии [4]. C другой стороны, отсутствие реакции на используемые нами ингибиторы в данных группах могло быть обусловлено включением других механизмов разобщения окислительного фосфорилиро-вания. Например, СЖК способны формировать циклоА-нечувствительные поры [2]. Разобщающее действие СЖК может осуществляться и с участием UCP-белков [6, 13, 14]. Подавление дыхания при рассматриваемых патологиях, как показано в нашей предыдущей работе, может быть обусловлено ингибированием митохондриальной фос-фолипазы А2 [12]. Нельзя исключать и того, что разнообразие ответных реакций на супрессоры дыхания митохондрий с участием СЖК в рассматриваемых подгруппах обусловлено одновременным включением разных механизмов разобщения.
Важно отметить, что все перечисленные выше механизмы разобщения являются кальций-чувствительными
Таблица 1
Структура групп экспериментальных животных
Экспериментальные группы и подгруппы Время между моделированием первой и второй патологии (недели) Время после моделирования второй патологии до вывода животного из эксперимента (недели) Общая длительность патологии (недели) Число крыс в группе (п)
I группа - контроль - - - 10
II группа - инфаркт (И2-И6):
И2 2 - 2 9
И4 4 - 4 6
И6 6 - 6 10
III группа - диабет (Д2-Д6):
Д2 2 - 2 5
Д4 4 - 4 5
Д6 6 - 6 12
IVгруппа - инфаркт+диабет (И+Д):
И2Д2 2 2 4 6
И2Д4 2 4 6 5
И2Д6 2 6 8 5
И4Д2 4 2 6 7
И4Д4 4 4 8 7
И4Д6 4 6 10 5
И6Д2 6 2 8 5
И6Д4 6 4 10 5
И6Д6 6 6 12 14
V группа - диабет+инфаркт (Д+И):
Д2И2 2 2 4 5
Д2И4 2 4 6 5
Таблица 2
Влияние различных супрессоров дыхания на скорость поглощения кислорода митохондриями сердца экспериментальных животных
Группы V сукцинат Добавки
+кАтр +олиго+АДФ +циклоА +ЭГТА+А23187
I группа 26,5+1,9 28,8+4,5 26,3+2,5 24,0+2,0 25,9+4,2
II группа: И2 76,0+1,9* 31,4+1,9# 44,2+4,2# 34,1+1,7# 24,3+2,2#
И4 78,3+6,2* 52,5+2,9# 56,3+2,5# 39,0+2,0# 31,4+3,9#
И6 126+3,4* 75,9 +3,5# 72,5+6,3# 91,4+4,1# 56,5+4,9#
III группа: Д2 92,3+5,8* 89,8+3,9 33,3+3,2# 63,5+5,3# 29,0+4,2#
Д4 135+3,9* 129 +6,2 71,6+3,5# 103+9,8# 97,9+9,9#
Д6 156+5,4* 129+8,3 91,1+2,7# 106+9,1# 99,2+6,7#
IV группа: И2Д2 65,4+2,5* 31,6+3,3 # 36,6+2,6# 35,6+1,6# 26,1+2,5#
И2Д4 3 оо 1+ 4* 83,6+3,9# 80,3+5,7# 99,2+6,4# 45,4+4,4#
И2Д6 158+14,1* 135+11,9 122+9,8# 116+12,0# 61,8+4,8#
И4Д2 78,6+5,2* 69,8 +4,4 54,1+3,7# 68,8 +5,2 49,9+4,9#
И4Д4 91,0+3,4* 89,2 +3,7 58,9+2,1# 86,3+3,9 55,8+3,4#
И4Д6 110+4,1* 86,9+9,9 99,8+5,4 114 +2,8 64,1+2,5#
И6Д2 87,3+4,4* 62,1+5,2# 54,4+3,2# 61,2+4,6# 32,1+5,7 #
И6Д4 135+9,4* 79,4+4,3# 62,4+3,2# 87,1+3,8# 46,1+4,3#
И6Д6 167+8,2* 143+7,2 129+6,2# 123+6,4# 65,6+4,8#
V группа: Д2И2 79,9+1,7* 56,9+6,2# 56,2+5,2# 73,2+3,6 50,6+7,9#
Д2И4 117+7,7* 72,1+7,5# 97,5+6,8 93,6+4,7 69,1+6,6#
Примечание: VсукцинаI - дыхание МХ при окислении сукцината; +кАтр, +олиго+АДФ, +циклоА, +ЭГТА+А23187 - дыхание МХ при введении в среду инкубации соответствующих добавок (см. Материал и методы); * - различия в колонке VсукцинаI статистически значимы (р<0,05) при сравнении с этим показателем в I группе; # - различия по дыханию МХ в каждой экспериментальной группе статистически значимы (р<0,05) при сравнении с показателем VсукцинаI в этой же группе.
[11]. Хорошо известно, что сочетание ЭГТА с А23187 приводит к уменьшению пула ионов кальция в митохондриях. В нашем исследовании в подобных условиях наблюдалось выраженное подавление свободного дыхания при всех рассматриваемых монопатологиях и их сочетаниях. В то же время в контрольной группе ЭГТА и А23187 в используемых концентрациях не оказывали значительного влияния на дыхание митохондрий. По нашим данным, на ранних стадиях развития патологий (подгруппы И2, Д2, а также И2Д2) использование ЭГТА+А23187 снижало скорость поглощения кислорода митохондриями миокарда практически до уровня контрольной группы. Выраженность ингибирующего влияния ЭГТА+А23187 на дыхание митохондрий во всех экспериментальных группах оказалась более значима, нежели действие других использованных нами супрессоров дыхания.
Такая чувствительность митохондрий к изменению внутримитохондриальной концентрации Са2+ является свидетельством обратимости процесса разобщения окислительного фосфорилирования во всех случаях, в том числе при формировании и открытии МНП. При физиологических условиях МНП функционирует в низкопро-водящем состоянии, пропускает протоны, ионы калия и кальция, открывается кратковременно и закрывается -при изменении рН матрикса митохондрий [15]. Избыточное накопление кальция и насыщение Са2+-сенсоров поры приводит к открытию поры в высокопроводящем состоянии, когда в матрикс митохондрий начинают проникать растворенные вещества массой до 1,5 кДа. Происходит выравнивание всех градиентов, набухание митохондрий, разворачивание крист, разрыв внешней мембраны и высвобождение факторов, запускающих гибель клетки по типу апоптоза или некроза [2, 6, 15].
Заключение
Разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях кардиомиоцитов при рассматриваемых патологиях направлено на предотвращение накопления активных форм кислорода и выполняет защитную функцию.
Разобщение окислительного фосфорилирования носит неспецифический характер и реализуется с одновременным включением как минимум двух механизмов: с участием АДФ/АТФ-антипортера и митохондриальной циклоспорин-чувствительной поры.
На ранних стадиях развития сочетанной патологии -как в случае инфаркт+диабета, так и диабет+инфаркта, -преимущественный вклад в разобщение окислительного фосфорилирования вносит процесс с участием АТФ/АДФ-и, возможно, аспартат/глутаматного антипортеров с постепенным включением и преобладанием на поздних стадиях механизма с участием митохондриальной цик-лоспорин-чувствительной поры.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям в рамках Федеральной целевой научно-технической
программы “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-техническо-
го комплекса России на 2007-2012 гг.” (Государственный контракт № 02.527.11.0007 от 30 апреля 2009 г.)
Литература
1. Александров А.А. Диабетическое сердце: схватка за митохондрии // Consilium medicum. - 2003. - Т. 5, № 9. - С. 509— 513.
2. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Миронова ГД Роль митохондриальной пальмитат/Са2+-активируемой поры в пальмитат-индуцированном апоптозе // Биофизика. - 2008. - Т. 53. - С. 967-971.
3. Дубилей ТА., Бадова ТА., Мигован С.А. и др. Влияние ишемии/реперфузии на функцию изолированного сердца у крыс разного возраста со стрептозотоциновым сахарным диабетом // Проблемы старения и долголетия. - 2007. -Т. 16, № 1. - C. 11-21.
4. Егорова М.В., Афанасьев С.А., Попов С.В. Состояние митохондрий и гипертрофия сердца при развитии стрептозо-тоцин-индуцированного диабета на фоне экспериментального инфаркта // Сиб. мед. журнал (Томск). - 2011. - Т. 26, № 3, вып. 1. - С. 119-124.
5. Кондратьева Д.С., Афанасьев С.А., Фалалеева Л.П. и др. Инот-ропная реакция миокарда крыс с постинфарктным кардиосклерозом на экстрасистолические воздействия // Бюл. экспер. биол. мед. - 2005. - № 6. - С. 613-616.
6. Мохова Е.Н., Хайлова Л.С. Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот // Биохимия. - 2005. - Т. 70, № 2. -С. 197-202.
7. Обрезан А.Г., Бицадзе РМ. Структура сердечно-сосудистых заболеваний у больных сахарным диабетом 2 типа, диабетическая кардиомиопатия как особое состояние миокарда // Вест. СПб. ун-та. - 2008. - Вып. 2. - С. 47-52.
8. Самарцев В.Н., Кожина О.В. Окислительный стресс как фактор регуляции разобщающего действия жирных кислот при участии ADP/ATP-антипортера и аспартат/глутаматного антипортера в митохондриях печени старых крыс // Биохимия. - 2008. - Т. 73. - С. 972-980.
9. Brand M.D., Bishop T., Boutilier R.G. et al. Mitochondrial proton conductance, standard metabolic rate and metabolic depression // Life in the Cold / ed. G. Heldmaier, M. Klingerspor. - Berlin : Springer, 2002. - P. 413-430.
10. Brindley D.N., Kok B.P.C., Kienesberger P.C. et al. Shedding light on the enigma of myocardial lipotoxicity: the involvement of known and putative regulators of fatty acid storage and mobilization // Am. J. Physiol. - 2010. - Vol. 298, No. 5. -P. E897-E908.
11. Duchen M.R., Verkhratsky A., Muallem S. Mitochondria and calcium in health and disease // Cell. Calcium. - 2008. -Vol. 44. - P. 1-5.
12. Egorova M.V., Afanasiev S.A., Kondratyeva D.S. et al. Possible mechanism of increasing resistance of the myocardium during combination of post infarction remodeling and diabetes mellitus // Natural Science. - 2011. - Vol. 3, No. 4. - P. 295-300.
13. Halestrap A.P., Pasdois P. The role of the mitochondrial permeability transition pore in heart disease // Biochim. Biophys. Acta. - 2009. - Vol. 1787, No. 11. - P. 1402-1415.
14. Lopaschuk G.D., Ussher J.R., Folmes C.D.L. et al. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease // Physiol. Rev. - 2010. -Vol. 90. - P. 207-258.
15. Novgorodov S.A., Gudz T.I. Permeability transition pore of the inner mitochondrial membrane can operate in two open states with different selectivities // J. Bioenerg. Biomembr. - 1996. -Vol. 28. - P. 139-146.
Поступила 09.11.2011
