CC BY
14УДК 616.992:576.882.8
АНТИМИКОТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ХИТОЗАНА С РАЗЛИЧНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА МОРФОЛОГИЮ КЛЕТОК ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ
Жуликов С.Н. (ст.н.сотр.)*/ 1Хайруллин Р.З. (соискатель), Лисовская С.А. (ст.н.сотр.)/
1 Глушко Н.И. (ст.н.сотр.), 2Тихонов В.Е. (ст.н.сотр), 2Степнова Е.А. (науч.сотр.), 3Лопатин С.А. (ст.н.сотр.), 3Варламов В.П. (зав. лабораторией)
'ФГУН Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань, Россия; 2Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва; 3Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия
© Коллектив авторов, 2010
Исследовали антимикотическую активность хитозана с различной молекулярной массой в отношении ЬрожжепоЬоб-ных грибов. Показано влияние низкомолекулярного хитозана на морфологию грибных клеток. С помощью световой микроскопии установили, что хитозановый полимер в сублетальных концентрациях ингибирует образование клетками Candida albicans ростковых трубок и псевдогиф.
Ключевые слова: антимикотическая активность, молекулярная масса, хитозан
ANTIMYCOTIC ACTIVITY OF CHITOSAN WITH DIFFERENT MOLECULAR MASS AND ITS INFLUENCE IN FUNGAL CELL MORPHOLOGY
1 Kulikov S.N. (senior researcher), ^hairullin R.Z. (searcher for scientific degree), ^isovskaya S.A. (senior researcher),
Glushko N.I. (senior researcher), 2Tikhonov V.E. (senior researcher), 2Stepnova E.A. (scientific researcher), 3Lopatin S.A. (senior researcher), 3Varlamov V.P. (head of the laboratory)
'Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Rospotrebnadzor, Kazan, Russia; 2A,N. Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds RAS, Moscow; 3Centre «Bioengineering» RAS, Moscow, Russia
© Collective of authors, 2010
The antifungal activity of chitosan with different molecular mass against yeast-like fungi was studied. The influence of low-molecular mass chitosan in fungal cell morphology has been investigated. According to light microscopy chitosan in sublethal concentrations is cause of significant morphological changes on fungal cell surfaces and inhibition of germ tube formation at Candida albicans.
Key words: antifungal activity, chitosan, molecular weight
ВВЕДЕНИЕ
На протяжении всей жизни человек постоянно сталкивается с представителями грибного царства. Иногда такое взаимодействие приводит к нежелательным последствиям в виде грибковых заболеваний, микотоксикозов, аллергических реакций. Для борьбы с грибами успешно используют многочисленные антимикотики и фунгициды. Однако разработка новых форм препаратов сохраняет свою актуальность и в настоящее время из-за появления резистентных штаммов микроорганизмов, а также в связи с всё возрастающими требованиями по безопасности к противогрибным веществам.
Одним из таких веществ является хитозан -биополимер, получаемый из хитина методом щелочного деацетилирования и состоящий из остатков глюко-замина и ацетилглюкозамина (Рис.1).
сн.
со
ин
СНіОН
СН;0Н
' CHjOH
СН.0Н
№,
NH
CO
СНл
CHjOH
Контактное лицо: Куликов Сергей Николаевич тел.: (843)238-99-79
Рис.1. Структурная формула пентамера частично деацети-лированного хитозана
Хитозан известен как нетоксичное, биодегра-дируемое, биосовместимое вещество [1]. Наличие многочисленных аминогрупп делает удобным проведение разнообразных химические модификаций с получением на основе полимера различных производных с улучшенными свойствами.
Хитозановый полимер обладает широким спектром активности, поскольку, в отличие от классических веществ с антибиотическими эффектами, не имеет единственной мишени для своего действия, а как антимикотик проявляет совокупность нескольких возможных механизмов, складывающихся
в сложный процесс, который приводит в конечном итоге к гибели клеток микроорганизмов, из таких как: изменение проницаемости цитоплазматической мембраны (ЦПМ), разрыв электронно-транспортной цепи, нарушение гликозилирования белков [2]. Клетки дрожжей, у которых в результате мутаций или действия соответствующих специфических ингибиторов снижена активность генов, продукты которых принимают участие в синтезе и процессинге РНК, организации актинового цитоскелета, координации эндоцитоза, гликозилировании протеинов, синтезе эргостерола и образовании клеточной стенки, становятся гиперчувствительными к действию хитозана [3]. Возможно, подобно дефензинам, положительнозаряженный хитозан опосредует своё противогриб-ное действие через сфинголипиды ЦПМ [4]. Важно отметить, что клетки млекопитающих не имеют отрицательно заряженных сфинголипидов в составе ЦПМ, чем можно объяснить их меньшую чувствительность кхитозану [5].
Остаётся до конца невыясненной также взаимосвязь между химической структурой хитозанового полимера и его биологическим эффектом на клетки микроорганизмов. Установление подобной взаимосвязи осложняется тем, что хитозан, являющийся природным сополимером ацетилглюкозамина и глю-козамина, представляет собой гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени ацетилирования, расположению ацетили-рованных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости, значению рКа.
Для точного установления взаимосвязи между физико-химическими свойствами и «антибиотической» активностью хитозана необходимо использовать узкодисперсные образцы полимера с охарактеризованным молекулярно-массовым распределением, получение и анализ которых до последнего времени были сложными задачами. В связи с этим многие исследования биологической активности хитозана, в том числе и биоцидной активности полимера, ранее проводили с использованием полидисперс-ных образцов, дающих неоднозначные или противоречивые результаты.
В связи с вышеизложенным, интерес представляло изучение влияния молекулярной массы хитозанов на его противогрибную активность в отношении некоторых видов дрожжевых организмов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Низкомолекулярный хитозан. Низкомолекулярные хитозаны были получены с помощью кислотного гидролиза высокомолекулярного крабового хитозана. Степень деацетилирования определяли методом ПМР.
Хроматографический анализ хитозанов. Полученные образцы низкомолекулярных хитозанов анализировали хроматографическим методом, описанным в работе [6]. Определяли средневесовую молекулярную массу (ММ) и значение полидисперсности
хитозанов (ММ/Мп). В работе использовали образцы хитозана со средневесовой молекулярной массой от 728 до 19991 Да.
Приготовление рабочих растворов низкомолекулярных хитозанов. Низкомолекулярные хитозаны в виде гидрохлоридов растворяли в дистиллированной воде до концентрации 8 мг/мл (массу хитозана рассчитывали без противоиона), стерилизовали полученные растворы посредством фильтрации через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм и хранили перед использованием при 4 °С.
Штаммы грибов и условия их культивирования. В работе использовали клинические штаммы Candida albicans, C. parapsilosis, C. scottii, C. tropicalis, C. krusei, Torulopsis candida, а также Saccharomyces cerevisiae и Rhodotorula mucilaginosa (rubra). Рабочие культуры грибов хранили на косяках с мясо-пептонным агаром (МПА) при 4 °С. Для приготовления культуры грибов в 100 мл колбу с жидкой средой Сабуро добавляли инокулят в количестве 5% (об/об) из суспензии культуры и инкубировали при 30 °С на качалке при 120 об/мин в течение 24 ч.
Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) хитозанов. Для оценки анти-грибной активности хитозанов в отношении дрожжеподобных грибов готовили двойные разведения вещества в жидкой среде Сабуро (pH 5,5-5,7) в 96-лу-ночных планшетах, затем добавляли суточную суспензию грибных клеток до конечного количества клеток 2-10s КОЕ/мл. После 48 ч инкубации при 30 °С определяли МИК хитозанов по полному отсутствию роста культуры в лунках с минимальной концентрацией вещества.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В научной литературе имеются данные по ингибирующему эффекту хитозана и его производных в отношении различных грибов - как мицелиальных так и дрожжеподобных [2, 7]. Однако использование образцов хитозана, различающихся по физикохимическим характеристикам, прежде всего по молекулярной массе, приводит к получению разных результатов в оценке эффективности хитозановых образцов. Поскольку препараты хитозана всегда состоят из набора молекул с различной степенью полимеризации, то для более точного определения зависимости биологической активности хитозана от его молекулярной массы мы использовали узкодисперсные образцы.
Нами были получены подобные образцы низкомолекулярных хитозанов с молекулярной массой (ММ) от 0,7 до 20 кДа, имеющие низкие величины полидисперсности (ММ/Мп) - от 1,39 до 1,66 (табл.1). Только для одного образца со средне-молекулярной массой 5977 значение степени полидисперсности превышало 2. Образцы с молекулярными массами 728, 1524 и 2090 соответствуют олигомерным формам хитозана, со средней степенью полимеризации 4, 8 и 12 соответственно.
Таблица 1 Характеристика образцов хитозана
ММ, Да СП* (ММ/172) ММ/Мп сд,%
728 4 1,41 95
1524 8 1,39 93
2090 12 1,40 97
5977 34 2,28 78
8300 49 1,50 99
9686 56 1,44 97
15057 87 1,61 94
19991 116 1,66 98
* СП - степень полимеризации
При оценке МИК хитозанов показано, что различные виды дрожжеподобных грибов, используемых в эксперименте, обладали различной чувствительностью к действию низкомолекулярных хитозанов (табл. 2). Наиболее чувствительными были С. scottii и R. muicilaginosa (rubra), тогда как наиболее устойчивыми оказались С. albicans и S. cerevisiae.
Таблица 2
Влияние молекулярной массы на МИК хитозанов
Виды грибов ММ хитозанов, Да
728 1524 2090 5977 8300 9686 15057 19991
С. albicans >2000* >2000 2000 1000 500 500 250 250
С. krusei >2000 >2000 1000 250 62 62 62 31
С. para psilosis >2000 >2000 2000 125 31 31 31 31
С. tropicalis >2000 >2000 500 125 31 31 31 31
С. scottii 250 250 62 31 15 15 15 15
Т. candida >2000 >2000 500 62 31 31 31 31
S. cerevisiae >2000 >2000 1000 250 125 125 125 125
R. muicilaginosa (rubra) 125 125 31 15 7,8 7,8 7,8 7,8
* мкг/мл, представлены средние значения трёх повторностей
Было показано, что антигрибная активность хитозана зависела от его молекулярной массы. При увеличении молекулярной массы антигрибная активность образцов возрастала. Олигомеры с молекулярной массой 728 и 1524 были одинаково малоэффективны и не отличались друг от друга по МИК. Усиление антигрибной активности хитозана отмечали для образца с молекулярной массой равной 2 кДа. При дальнейшем увеличении массы молекул возрастала и антигрибная активность образцов. При достижении
8,3 кДа активность хитозана достигала своего максимума, поскольку дальнейшее увеличение молекулярной массы практически не приводило к уменьшению МИК. Таким образом, для эффективного действия хитозановых препаратов целесообразно получать образцы, содержащие в своём составе молекулы полимера с молекулярной массой не менее 5 кДа.
Отметим, что различные виды грибов по разному реагировали на изменение молекулярной массы хитозана. Так, наименее восприимчивыми к изменению молекулярной массы применяемых образцов хитозана были С. albicans, а также S. cerevisiae, С. scottii и R. muicilaginosa (rubra). Интересно отметить, что первые два принадлежат к наиболее устойчивым к хитозану видам микроорганизмов, а два последнеих - к самым чувствительным. Переход от более низкой к более высокой молекулярной массе хитозана
для этих видов грибов сопровождался менее выраженным изменением МИК вещества по сравнению с остальными видами.
Приведённые в таблице данные отображают концентрацию хитозана, при котором после двух суток инкубации не наблюдали роста культуры (Рис. 2).
Рис. 2. Влияние концентрации хитозана на рост культуры С. albicans (48 ч). К - контроль без хитозана; 7,8.15, 31,62,
125, 250, 500 и 1000 - концентрации хитозана в мкг/мл.
Увеличение: окуляр х10, объектив х20
Однако и в концентрациях меньших, чем МИК, при микроскопическом анализе отмечали существенные изменения в морфологии клеток [8]. Так, при использовании образца с молекулярной массой
8,3 кДа при возрастании концентрации хитозана до 15 и 31 мкг/мл у клеток С. albicans уменьшается количество или совсем перестают образовываться ростовые трубки и псевдогифы. Вероятно, это связано с тем, что псевдогифы имеют поверхностную структуру, отличную от таковой у дрожжеподобных, - она более тонкая, имеет иной состав и может быть менее устойчивой к действию поликатиона. Известно, что хитозан оказывает сильное воздействие на клеточную стенку грибов, что влечёт активизацию группы генов, которые участвуют в биогенезе клеточной стенки и поддержании её нормальной структуры, например, гены, кодирующие 1,3 - (5 -1 л к > ка 11 с и п те та з у, и белки, участвующие в гликозилировании маннопро-теинов клеточной стенки, а также имеющие отношение к ЦПМ [3]. Таким образом, действие хитозана приводит к изменению экспрессии тех генов, которые имеют отношение к структурам-мишеням для хитозанового полимера, каковыми являются клеточная стенка и ЦПМ, а также ЭПР, в котором образуются составные компоненты для поверхностных структур [3]. При возрастании концентрации начинают появляться конгломераты клеток, напоминающие по форме грозди винограда. При концентрации 125 мкг/мл эти грозди приобретают звёздчатый вид, по всей видимости, связанный с нарушением расхождения клеток после почкования. Клетки в конгломератах более мелкие по размеру, с утолщенными клеточными стенками, увеличенным количеством вакуолей и плохо различимыми ядрами; одиночные клетки в среде практически отсутствуют. При увеличении
концентрации до 250 мкг/мл конгломераты приобретают неправильную звёздчатую форму становятся более плотными на вид. В самой среде находилось большое количество материала от погибших клеток, который, благодаря агглютинирующим свойствам хитозана, образовывал различного размера конгломераты. При концентрации 500 мкг/мл количество и размер конгломератов клеток резко уменьшаются, в среде много агглютинированного клеточного материала, присутствуют лишь единичные неразрушенные клетки. При концентрации 1000 мкг/мл неразрушенные клетки отсутствуют, наблюдается только клеточный материал.
На основании полученных результатов можно думать о различии ингибирующей активности у хито-занов с различной молекулярной массой в отношении дрожжеподобных грибов, в том числе условнопатогенных, что представляет научный интерес в плане потенциальной возможности более эффективного применения хитозанового полимера как анти-грибного компонента в составе различных лекарственных средств таких, как гели, мази и присыпки.
Следующим этапом для усиления антимикотических свойств хитозана может стать его химическая модификация по аналогии с получением подобных производных с улучшенными противомикробными свойствами [9].
ВЫВОДЫ
1. Показано, что противогрибные свойства хитозана зависят от его молекулярной массы: практически не были эффективны олигомеры с молекулярной массой до 2 кДа, а наибольшей активностью обладали низкомолекулярные образцы с массой от 5 кДа.
2. Установлено, что при использовании концентраций хитозана меньших, чем минимальная ингибирующая концентрация, клетки С. albicans перестают образовывать ростовые трубки и псевдогифы, существенно изменяется морфология клеток и нарушается их расхождение после почкования.
Работа выполнена при финансовой поддержке регионального гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 09-04-99035 р офи).
ЛИТЕРАТУРА
1. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. - М.: Изд-во Наука, 2002. - 368 с.
2. Zakrzewska A., Boorsma A., Brul S., et al. Transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to the plasma membrane-perturbing compound chitosan // Eukar. Cell. - 2005. - Vol. 4, № 4. - P. 703-715.
3. Zakrzewska A., Boorsma A., Delneri D., et al. Cellular processes and pathways that protect Saccharomyces cerevisiae cells against the plasma membrane-perturbing compound chitosan // Eukar. Cell. - 2007. - Vol. 6, №4. - P. 600-608.
4. Thevissen K., Warnecke D.C., Francois I.E., et al. Defensins from insects and plants interact with fungal glucosylceramides // J. Biol. Chem. - 2004. -Vol. 279. - P. 3900-3905.
5. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol. 66. - P. 80-86.
6. Аопатин C.A., Дербенева M.C., Куликов C.H. и др. Фракционирование хитозана методом ультрафильтрации // Журнал Аналитической Химии. - 2009. - Т. 64, № 6. - С. 666-670.
7. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., et al. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan II]. Appl. Polym. Sci. - 2001. - Vol. 79. - P. 1324-1335.
8. Куликов C.H., Лисовская C.A., Глушко Н.И. и др. Действие низкомолекулярного хитозана в отношении Candida albicans II Практическая Медицина. - 2009. - № 3 (35). - С. 69-71.
9. Ильина А.В., Куликов С.Н., Чаленко Г.И, и др. Получение и исследование моносахаридных производных низкомолекулярного хитозана // Прикладная Биохимия и Микробиология. - 2008. - Т.44, №5. - Р. 606-614.
Поступила в редакцию журнала 22.01.2010 Рецензент: Г.А. Бабенко
