CC BY
36УДК 616-002.8:582.282.23
АНТИМИКОТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ХИТОЗАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ В ОТНОШЕНИИ CANDIDA ALBICANS
Жуликов С.Н. (с.н.с.)*, 2Шакирова Д.Р. (студент), 3Тихонов В.Е. (с.н.с.)/ ЗБезродных Е.А. (н.с.), 4Ильина А.В.
(в.н.с.), 4Левов А.Н. (с.н.с.), 4Варламов В.П. (зав. лаб.)
'Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань; 2Казанский Федеральный Университет, Казань; 3Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва; 4Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия
© Коллектив авторов, 2012
Исследовали антимикотическую активность хитозана и его производных в отношении Candida albicans. Установлено, что повышение антимикотической активности связано с модуляцией положительного заряда поликатиона. Показано, что хитоза-новый полимер в сублетальных концентрациях ингибирует образование клетками С. albicans мицелиальных структур. Наиболее сильными ингибиторами гифообразованияявлялись производные олигохитозанов, содержащие четвертичные аминогруппы, для которых эффект был отмечен при концентрациях в 1/128 МИК.
Ключевые слова: антимикотическая активность, гифообразо-вание, молекулярная масса, производное хитозана, степень деза-цетилирования, хитозан
ANTIMYCOTIC ACTIVITY OF CHITOSAN ANT ITS DERIVATIVES AGAINST CANDIDA ALBICANS
Kulikov S.N. (senior scientific collaborator), 2Shakirova D.R. (student), 3Tikhonov V.E. (senior scientific collaborator), 3Bezrodnykh Ye.A. (scientific collaborator), 4M'ina A.V. (leading scientific collaborator), 4Levov A.N. (senior scientific collaborator), 4Varlamov V.P. (head of the laboratory)
'Kazan Scientific Research Institute of epidemiology and microbiology, Kazan; 2Kazan Federal University, Kazan; 3A.N.Nesmeyanov Institute of elements organic connections of RAS, Moscow; 4Center «Bioengineering» of RAS, Moscow, Russia
© Collective of authors, 2012
* Контактное лицо: Куликов Сергей Николаевич
тел.: (843) 238-99-79
Antifungal activity ofchitosan and its derivatives against Candida albicans have been investigated. It was found that increasing of antimycotic activity is associated with the modulation of the positive change of chitosan poly cation. It was shown that chitosan polymer in sublethal concentrations inhibits forming offilamentous structures. The most potent inhibitors were derivatives containing quaternary amine groups, when was observed at concentrations of 1/128 MIC.
Key words: antifungal activity, chitosan, chitosan derivative, degree of deacetylation, gifal formation, molecular mass
ВВЕДЕНИЕ
Candida spp. являются одной из основных причин возникновения оппортунистических микозов. Наиболее значимым представителем данного рода, с точки зрения медицинской микологии, долгое время является Candida albicans. Этот микроорганизм способен поражать самые разнообразные органы и ткани человека. Кроме этого, клинические штаммы С. albicans всё чаще характеризуются как устойчивые к тем или иным противогрибковым препаратам. Поэтому разработка новых антимикотических средств сохраняет свою актуальность.
Одним из таких веществ является хитозан - биогенный полимер, получаемый из хитина методом щелочного дезацетилирования и состоящий из остатков глюкозамина и ацетилглюкозамина. В отличие от классических антимикотиков, хитозан не имеет единственной мишени для своего действия, а его противогрибной эффект является совокупностью нескольких возможных механизмов, складывающихся в сложный процесс, который приводит, в конечном итоге, к гибели клеток микроорганизма [1]. В последних исследованиях показано, что набор генов, которые вовлечены в активацию при действии хитозана и антимикотиков, существенно отличается [2], следовательно, хитозан может быть использован в качестве эффективной альтернативы классическим фунгицидам для борьбы с резистентными штаммами патогенных грибов.
Ранее нами были продемонстрированы антими-котические свойства низкомолекулярных хитозанов (от 1 до 20 кДа) в отношении различных условно-патогенных дрожжеподобных грибов [3]. Более сильной антимикотической активностью могут обладать модифицированные хитозаны, к которым присоединены химические группы, придающие хитозановому полимеру новые или улучшенные свойства, - растворимость при высоких значениях pH, имеющие более сильный положительный заряд, сродство к гидрофобным структурам (за счет введения гидрофобных заместителей), в том числе - к липидным мембранам. В многочисленных исследованиях [4, 5], выявили высокую эффективность подобных модифицированных хитозанов в отношении бактерий; менее изученной остаётся антимикотическая активность таких производных и практически неизученной -влияние хитозанового полимера и его производных на формирование грибом мицелиальных структур, что является важным фактором вирулентного потенциала микроорганизма.
В связи с вышеизложенным, интерес представляло сравнение антимикотических свойств низкомолекулярных и олигомерных форм хитозана и их химических модификаций в отношении С. albicans, а также их влияние на образование грибом мицели-альных структур.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы хитозанов. Низкомолекулярные хи-тозаны со средневязкостной молекулярной массой (ММ) 22 кДа и степенью дезацетилирования 58 и 89% были получены из крабового высокомолекулярного хитозана путём ферментной деполимеризации с использованием ферментного препарата Целло-виридин Г20х. Для получения образца со степенью дезацетилирования 58%, вышеупомянутый образец был реацетилирован [6]. Олигохитозан со средневесовой молекулярной массой (Mw) 7 кДа и степенью дезацетилирования >90% был получен путём химической деполимеризации.
В работе использовали М,їчГ,їчГ-триметиламмоний хитозан, полученный из олигохитозана с М„ 7 кДа и содержанием четвертичных аминогрупп 30 моль% (Рис. 1А).
■О но.
о=с сЬн 2
ні —сооыа СН2
ін
6н
£=о
і
сн2
ін.
(СН2)8
£н3
Рис. 1. Структура производных хитозана. А - N,N,N1-триметиламмоний хитозан, Б - Ы-капроноилхитозан,
В - Ы-миристиноилхитозан, Г - 1\1-(додеценил)сукциноил -Ы.Ы.Ы-триметиламмоний хитозан В работе использовали ацилированные (с длиной жирнокислотного остатка 6 и 14 атомов углерода) по аминогруппе производные олигохитозана с М„ 8,3 кДа и степенью дезацетилирования 99%, полученные, как описано в работе [8], (Рис. 1Б и 1В). Сте-
пень замещения ацильными остатками составляла 8 моль%. Также использовали производное олигохитозана с молекулярной массой 4,6 кДа, содержащий С12 алифатическую группу 12 моль% и четвертичный аммоний 25 моль% [9] (Рис. 1Г).
Хроматографический анализ хитозанов. Полученные образцы низкомолекулярных хитозанов анализировали хроматографическим методом, как описано в работе [10].
Приготовление рабочих растворов низкомолекулярных хитозанов и их производных. Образцы растворяли в дистиллированной воде до концентрации 8 мг/мл, полученные растворы стерилизовали фильтрацией через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм и хранили при 4 °С.
Штаммы грибов и условия их культивирования. В работе использовали музейные штаммы С. albicans № 4 (коллекция КНИИЭМ) и АТСС 90028, а также клинический штамм С. albicans № 2515, любезно предоставленный Лисовской С.А. (лаборатрия микологии КНИИЭМ). С. albicans № 2515, выделенный со слизистой оболочки зева, характеризовался устойчивостью к кетоконазолу, флуконазолу, тербинафи-ну, клотримазолу и натамицину, высокой чувствительностью к нистатину и интраконазолу. Свежевыделенный штамм хранили на агаризованной среде Сабуро при 4 °С не более двух недель до проведения исследования. Условия хранения и культивирования штаммов грибов, а также определение минимальных ингибирующих концентраций проводили, как описано в работе [11].
Оценку ингибирования образования мицелиаль-ных структур у клинического штамма С. albicans выполняли с применением световой микроскопии [11]. Для этого из эксперимента по определению МИК хитозанов и их производных, в ходе которого готовили ряд двойных разведений вещества, после 48 часов инкубации при 30 °С отбирали аликвоту суспензии объёмом 20 мкл. Суспензию помещали на предметное стекло и с помощью светового микроскопа подсчитывали в 10 разных полях зрения количество дрожжеподобных клеток. В тех же полях зрения подсчитывали количество мицелиальных структур. Рассчитывали долю мицелиальных структур по отношению к общему количеству дрожжеподобных клеток в опыте. Долю мицелиальных структур в контрольном варианте без добавления хитозана принимали за 100%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что биоцидная активность хитозана во многом определяется положительным зарядом аминогрупп хитозана. В нашем исследовании были взяты два образца низкомолекулярного хитозана (22 кДа) с высокой (89%) и низкой (58%) степенью дезацетилирования, которые подтвердили взаимосвязь высокой антимикотической активности полимера с количеством свободных аминогрупп (табл. 1).
А
Б
В
сн
н,с
.Х»СН
с=о
о
о
и
о-
и
J
г
о
Таблица 1.
Влияние физико-химических характеристик образцов хитоза на МИК (мкг/мл) хитозанов и их производных в отношении С. albicans
Образецхитозана Штамм С. albicans
№4 АТСС 90028 №2515
7 кДа 128 512 512
8,3 кДа 128 512 512
7 кДа, К 32 64 64
8,3 кДа,С6 128 512 512
8,3 кДа, С14 128 512 512
5 кДа, К, С12 32 64 64
22 кДа, СД 58% 256 1024 >2000
22 кДа, СД 89% 64 256 256
Представлены средние значения данных из трёх независимых экспериментов
Высокодезацетилированный образец показал более высокую антимикотическую активность, что выражалось в уменьшении значения МИК в отношении всех взятых в эксперимент штаммов С. albicans, по сравнению с образцом, у которого почти половина аминогрупп ацетилирована.
Низкомолекулярный образец (ММ 22 кДа, СД 89%) также обладал более высокой антимикотиче-ской активностью, по сравнению с олигомерными формами хитозана (7-8,3 кДа), что подтверждено ранее полученными результатами на дрожжеподобных грибах [3]. Однако олигохитозаны, при немного худшей антимикотической эффективности, обладают рядом привлекательных свойств - лучшей растворимостью при pH >7, более высоким рКа и более низкой вязкостью. На основе олигосахарида (ММ 7 кДа) было синтезировано производное с четвертичной аминогруппой - КГ,КГ,КГ-триметиламмопий хитозан. Такое производное обладает более выраженными катионными свойствами, чем немодифи-цированный хитозан. Показатель МИК кватернизи-рованного производного уменьшался в четыре раза, по сравнению с немодифицированным хитозаном, из чего заключили, что положительный заряд играет важную роль в проявлении хитозаном антимикоти-ческих свойств, а её модуляция позволяет усиливать биологический эффект полимера.
Также нами были использованы производные олигохитозана (ММ 8,3 кДа), содержащие алифатические группы различной длины (Рис. 1Б, В). Благодаря наличию гидрофобной части такие модифицированные хитозаны могут обладать повышенным сродством к мембранным структурам микроорганизмов, усиливая негативное воздействие на них поликатиона. Ранее нами было продемонстрировано, что ацильные производные олигохитозанов с боковыми ацильными остатками жирных кислот, содержащих 6 и 14 атомов углерода, усиливают антибактериальные свойства полимера в отношении бактерий [8]. При этом было отмечено усиление антибактериального эффекта производных не только в отношении грамотрицательных энтеробактерий, которые
обладают внешней бислойной мембраной, но также в отношении грамположительных бактерий, у которых плазмалемма защищена толстой клеточной стенкой. В связи с этим предположили возможность проникновения производных хитозана через клеточную стенку не только бактерий, но также дрожжеподобных грибов. Однако, как видно из таблицы 1, МИК для ацильных производных не отличается от МИК исходного образца. Вероятно, это связано с особенностями строения ЦПМ грибных клеток, делающих эти структуры более устойчивыми к действию поликатиона. Известно, что жирнокислотный состав ЦПМ может сильно влиять на чувствительность грибных клеток к действию хитозанового полимера [12]. Возможно, что клеточные покровы грибных клеток обладают большими барьерными свойствами, препятствуя проникновению молекул хитозана к ЦПМ.
Также нами было исследовано производное хитозана (ММ 7 кДа), содержащее одновременно кватернизированные аминогруппы и боковые остатки с алифатическимим составляющими (Рис. 1 Г). МИК данного образца в отношении всех штаммов С. albicans была сопоставима с МИК кватернизирован-ного образца (8,3 кДа). Следовательно, антимикоти-ческая активность хитозана в отношении С. albicans модулируется путём внесения в состав молекулы кватернизированных аминогрупп, но не с помощью внесения гидрофобных группировок (ацильных, до-децильных).
Наряду с определением МИК хитозанов и их производных, мы исследовали способность этих веществ влиять на образование мицелиальных структур С. albicans. Поскольку музейные штаммы при культивировании практически не образовывали мицелий, в эксперимент был взят клинический штамм хорошо образующий эти структуры (Рис. 2А).
Было показано, что все образцы в той или иной мере способны в субингибирующих концентрациях подавлять гифообразование (табл. 2).
Таблица 2
Влияние концентрации хитозана с различной молекулярной массой на образование мицелиальных
структур у С. albicans № 2515
Образец хитозана Концентрация хитозана, МИК
1/4 1/16 1/32 1/64 1/128 кон- троль
7 кДа 0 15±6 30±6 50±8 74±8 72±10
8,3 кДа 0 17±6 31 ±5 55±7 76±13 73±11
7 кДа, К 0 0 5±4 30±6 50±6 71 ±10
8,3 кДа, С-6 0 14±5 27±6 44±7 71 ±6 72±9
8,3 кДа, С-14 0 15±6 25±5 44±7 68±10 74±10
4,6 кДа, К, С-12 0 0 6±4 29±5 49±6 70±7
22 кДа, СД 58% 20±5 45±5 50±6 65±7 69±8 70±10
22 кДа, СД 89% 0 5±4 15±5 40±5 70±9 69±9
К - кватернизированное производное; С-6, С-12 и С-14 - производные с гидрофобными заместителями; СД - степень дезацетилирования. Представлены данные трёх независимых экспериментов.
ЭКСДЕРИМШ1МЫНМ]ШК0Д0Р4Я
Рис. 2. Типичный вид С. albicans № 2515 в отсутствии хито-зана (А) и в присутствии субингибирующей концентрации хитозана (Б)
Ингибирующий эффект зависел от концентрации вещества. В присутствии сравнительно высоких концентраций хитозанов (1/4 МИК) почти все образцы полностью подавляли образование Candida мицели-альных структур (Рис 2Б). В таких условиях в культуре присутствовали только дрожжеподобные клетки.
Не полностью подавлял гифообразование только образец низкомолекулярного хитозана (22 кДа) с низкой степенью дезацетилирования, что также согласуется и с его самой низкой антимикогической активностью. Низкомолекулярный хитозан (22 кДа, СД 89%) проявлял немного более высокую эффективность в подавлении гифообразования грибом, чем олигохитозаны (7 и 8,3 кДа), что также указывает на зависимость эффекта от молекулярной массы полимера. Лучшими в подавлении гифообразования были производные хитозана, содержащие кватерни-зированные группы, - образование мицелия значительно ингибировалось ими при 1/16 МИК, а эффект сохранялся даже при 1/128 МИК.
ВЫВОДЫ
Таким образом, были получены производные олигохитозанов с усиленными антимикотическими свойствами в отношении С. albicans. Выявили, что повышение антимикотической активности связано с модуляцией положительного заряда поликатиона. Внесение в молекулу полимера гидрофобных заместителей, отличающихся длиной заместителя алифатических групп различного происхождения, на про-тивокандидозную активность производных не влияло. Установлено, что в субингибирующих концентрациях исследуемые вещества подавляют образование грибом мицелиальных структур. Наиболее сильными ингибиторами гифообразования являлись производные олигохитозанов, содержащие четвертичные аминогруппы, для которых эффект был отмечен при концентрациях в 1/128 МИК. Обнаруженный эффект ингибирования роста псевдогиф хитозаном может быть использован для создания средств, уменьшающих патогенный потенциал микроорганизмов со сниженным воздействием на нормальную микробиоту человека.
Работа выполнена при финансовой поддержке регионального гранта Российского фонда фундаментальных исследований №12-04-97039 р Поволжье а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Zakrzewska A., Boorsma A., Delneri D., et al. Cellular processes and pathways that protect Saccharomyces cerevisiae cells against the plasma membrane-perturbing compound chitosan // Eukar. Cell. - 2007. - Vol. 6, № 4. - P. 600-608.
2. JaimeM.D., Lopez-LlorcaL.V., ConesaA., etal. Identification ofyeast genes that confer resistance to chitosan oligosaccharide (COS) using chemogenomics // BMC Genomics. - 2012. - Vol. 13, №1. - R 267-312.
3. Куликов C.H., Хайруллин P.3., Лисовская C.A. и др. Антимикотическая активность хитозана с различной молекулярной массой и его влияние на морфологию клеток дрожжеподобных грибов /7 Проблемы медицинской микологии. - 2010. - Т. 12, №2. - С. 32-35.
4. Kong М., Chen X.G., Xing К., ParkH.J. Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: a state of the art review // Int. J. Food Microbiol. - 2010 - Vol. 144, №1. - P. 51^63.
5. him S.H., Hudson S-M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. - 2003. -Vol. 43, №2. - P. 223-269.
6. Ильина А.В., Ткачёва Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38, №2. - С. 132-135.
7. Ильина А.В., Варламов В.П. Влияние степени ацетилирования на ферментативный гидролиз хитозана препаратом Целловиридин Г20Х й Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т.39, № 3. - С, 273-277.
8. Куликов С.Н., Хайруллин Р.З., Степнова Е.А. и др. Получение низкомолекулярных хитозанов и их ацильных производных и исследование их антибактериальных свойств // Бутлеровские сообщения. - 2010. - Tv 20, № 6. - С. 59-64.
9. Stepnova Е.А., Tikhonov V.E., Babushkina Т.А., et al. New approach to the quaternization of chitosan and its amphiphilic derivatives.// Europ. Polymer J. - 2007. - Vol. 43. - P. 2414-2421.
A
10. Лопатин С.А., Дербенева М.С., Куликов С.Н. и др. Фракционирование хитозана методом ультрафильтрации // Журнал аналитической химии. - 2009. - Т. 64, №6. - С. 666-670.
11. Куликов С.Н., Лисовская С.А., Глушко Н.И.и др. Действие низкомолекулярного хитозана в отношении Candida albicans 11 Практическая медицина . - 2009. - Т. 35, №3. - С. 69-71.
12. Palma-Guerrero J, Lopez-Jimenez J.A., Perez-Berna A.J., et al. Membrane fluidity determines sensitivity of filamentous fungi to chitosan // Mol. Microbiol. - 2010. - Vol. 75, №4. - P. 1021-1032.
Поступила в редакцию журнала 04.10.2012
Рецензент: Н.П. Блинов
