CC BY
53
УДК 544.165
С. Н. Куликов, Р. З. Хайруллин ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ НА БИОЦИДНЫЕ СВОЙСТВА ХИТОЗАНОВОГО ПОЛИМЕРА
Ключевые слова: хитозан, молекулярная масса, степень ацетилирования, биоцидная активность.
Приводятся сведения о механизмах биоцидного действия хитозана. Обсуждается роль химической структуры хитозанового полимера в проявлении им антибактериальной и антимикотической активности.
Keywords: chitosan, molecular weight, degree of acetylation, biocides activity.
The information on the mechanisms of the biocidal action of chitosan. The role of the chemical structure of the polymer chitosan in the manifestation of their antibacterial and antimycotic activity.
Хитозан - природный полиаминосахарид, обладающий широким спектром биологических свойств, стал находить практическое применение только в последние два десятилетия [1]. Одними из первых свойств обнаруженных у хитозана, стали его антибактериальная и антимикотическая активности, которые могут быть использованы для защиты от развития гнили, плесневения и обеспечения более длительного хранения растительных продуктов [2] -плодов дыни [3], абрикоса [4], ягод клубники [5], соков [6, 7], для пищевой отрасли - изготовления плёнок и упаковочного материала из хитозана или содержащие хитозан с антибактериальными свойствами [8, 9]. Для лучшего сохранения рыбы и икры производные хитозана используют в композиции с консервантами [10, 11].
Взаимосвязь между химической структурой хитозанового полимера и его биологическим действием на клетки микроорганизмов остаётся до конца невыясненной. Установление подобной взаимосвязи осложняется тем, что хитозан, являющийся природным сополимером N ацетилглюкозамина и глюкозамина, объединяет гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени ацетилирования (дезацетилирования), расположению ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости, значению рКа [12, 13]. Подобная структурная неоднородность затрудняет идентификацию и определение количественных соотношений различных молекул в смеси, а также установление более точных связей между их физико-химическими характеристиками и биологической активностью. Однако, это же позволяет расширить рамки соотношения структура/свойства хитозанового полимера и направить исследования на поиск и получение более эффективных по антибактериальному и антимикотическому действию форм хитозана.
Известно, что биоцидная активность хитозана во многом определяется положительным зарядом аминогрупп хитозана. Можно считать установленным, что антимикробная и антимикотическая активность хитозана усиливается при увеличении его степени деацетилирования. Полимер с высокой степенью деацетилирования имеет большее количество свободных аминогрупп, а значит и сайтов связывания с поверхностными структурами клеток микроорганизмов. Это подтверждается
многочисленными исследованиями, в которых было
показано, что полимер, имеющий в своём составе более 90% сахарных остатков со свободными аминогруппами, обладает наибольшей биоцидной активностью [14]. Увеличение степени дезацетилирования повышает антибактериальную активность хитозана в отношении различных видов бактерий - как грамотрицательных так и грамположительных [10, 15-18].
Биоцидная активность хитозана усиливается при повышении кислотности, т. к. его молекулы приобретают свойства поликатиона [14, 19]. Положительный заряд позволяет хитозану связываться с анионными компонентами клеточных структур бактерий и грибов за счёт электростатического взаимодействия, а увеличение заряда полимера способствует более прочному связыванию хитозановой молекулы на поверхности клеток микроорганизмов. В щелочных условиях, из-за нейтрализации аминогрупп и потери ими положительного заряда, активность хитозана снижается, тем не менее это не является основанием для полной потери антимикробного действия, поскольку незаряженные аминогруппы способны хелатировать ионы металлов за счёт образования координационных связей.
В кислой среде для подавления роста клинических штаммов грибов рода Candida требовалось в 2-8 раз меньшая концентрация хитозана с молекулярной массой 70 кДа по сравнению с достижением аналогичного результата в нейтральных условиях [20].
Однако, противоречивыми остаются сведения о влиянии молекулярной массы хитозана на его антимикробное действие. Имеются данные о том, что антимикробный и антимикотический эффект увеличивается с возрастанием степени полимеризации хитозана [21-23]. Хитозан с молекулярной массой 150 кДа проявлял более высокую антибактериальную активность в отношении Listeria monocytogenes и S.typhimurium по сравнению с образцом в 5 кДа [24]. В отношении вегетативных клеток Bacillus cereus антимикробный эффект усиливался в ряду от олигосахаридов до образцов с молекулярной массой 100 и 628 кДа [25]. Аналогичная зависимость отмечена в отношении анаэробных бактерий -представителей нормофлоры человека [26]. Также отмечено усиление антибактериальной активности в отношении как грамотрицательных так и грамположительных бактерий при увеличение степени полимеризации в ряду олигомеров хитозана от
мономера до гексамера [27]. Увеличение молекулярной массы усиливало антимикотическое действие хитозанов в отношении дрожжеподобных и мицелиальных грибов [28, 29]. Биоцидное действие высокомолекулярного хитозана объясняется тем, что увеличение количества аминогрупп способствует более прочному связыванию полимера с поверхностными структурами клетки, большей степени агглютинации клеток в растворе, а также большей вязкости раствора, что может уменьшать скорость диффузии питательных веществ и кислорода в которых нуждается микробная клетка. Эти данные подтверждаются атомно-силовой микроскопией, указывающей на видимый эффект укрепления клеточной стенки вегетативных клеток бацилл [25].
Имеются противоположные данные о том, что более высокой антибактериальной активностью обладают низкомолекулярные образцы хитозана полученные с использованием ферментативной деполимеризации [27, 30, 31]. Гидролизированный хитозан более эффективно подавлял рост грибов по сравнению с нативным хитозаном [7]. Биоцидное действие низкомолекулярного хитозана связывают с тем, что такой хитозан, а также олигомеры, способны проникать через клеточную стенку бактерий, взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и другими цитоплазматическими компарментами, нарушая их функционирование, что влечёт за собой гибель клетки. Так, споры В. овгвиэ, устойчивые к действию высокомолекулярных форм хитозана подвержены действию олигомеров (менее 3 кДа), что подтверждается атомно-силовой микроскопией, которая свидетельствует о снижении защитных свойств споровых покровов [25].
Некоторые авторы указывают на отсутствие антимикробной активности у хитозана с молекулярной массой менее 10 кДа [32]. Имеются сведения о незначительном различии в антимикробной активности образцов с молекулярными массами 60 и 600 кДа в отношении и бактерий с различным строением клеточных стенок [33].
В некоторых работах указывается на эффективность хитозана с определённой молекулярной массой, изменение которой в сторону уменьшения или увеличения ведёт к снижению антибактериальной активности хитозанового полимера [31, 32, 34,]. Часто такие результаты не дают окончательного конкретного ответа на зависимость антибактериальной активности от молекулярной массы хитозана из-за малого количества образцов используемых в опыте [15], которые не способны отразить весь диапазон свойств обусловленный физико-химическими
характеристиками биополимера.
В ситуации когда биологическая активность линейно зависит от молекулярной массы хитозанового полимера, установление того, что низкомолекулярный хитозан обладает наибольшим антибактериальным эффектом [15] по сути оставляет открытым вопрос о молекулярной массе хитозана с лучшими антибактериальными свойствами - молекулярная масса такого оптимального образца может быть как меньше так и больше чем 28 кДа. Например,
уменьшение молекулярной массы (менее 5 кДа) усиливало антибактериальное действие хитозана против E. coli, тогда как в отношении S. aureus, а также C. albicans были более эффективны образцы с молекулярной массой превышающей 100 кДа [36, 37]. Хитозаны с молекулярными массами 17, 23 и 30 кДа по разному влияли на фитопатогенный гриб R.stolonifer. Низкомолекулярный образец эффективнее других подавлял рост мицелия, тогда как более высокомолекулярный сильнее ингибировал спорообразование и прорастание спор, а также сильнее влиял на их морфологию [38].
Следует отметить, что в некоторых работах указывается на противоположную зависимость антибактериальной активности хитозанов с различной молекулярной массой в отношении бактерий, принадлежащих к разным видам. Так, увеличение молекулярной массы усиливало антибактериальный эффект в отношении S. aureus и уменьшало его в отношении E. coli [39].
Противоречия в оценке влияния молекулярной массы хитозанового полимера на его антибактериальную и антимикотическую активность не позволяет однозначно интерпретировать его биоцидную эффективность. Одним из объяснений этого противоречия может являться неполная молекулярно-массовая характеристика используемых в экспериментах образцов хитозана. Очень часто характеристика хитозана сводится к определению его средневязкостной молекулярной массы, что для полимера, существующего в виде смеси разных по длине молекул недостаточно. Кроме того, для полидисперсных хитозановых образцов установление взаимосвязи их степени полимеризации с биоцидной активностью затрудняется тем, что биологический эффект хитозана может определяться минорной (2-3% от общего количества) долей молекул с молекулярной массой, значительно отличающейся от средней для данного образца величины [40]. Так, в одном из экспериментов по оценке биологической активности трёх различающихся по молекулярной массе узкодисперсных образцов хитозана (17, 23 и 30 кДа) были выявлены чёткие взаимосвязи между средней молекулярной массой образца и степенью ингибирования роста мицелия гриба и некоторыми другими эффектами [38]. Однако, как следует из методической части этой работы взятые образцы имели между собой существенное перекрытие хроматографических профилей: даже между наиболее различающимися по значению средней молекулярной массы образцами (17 и 30 кДа) площадь перекрытия хроматографических профилей составляла почти 50%, что свидетельствует об идентичности почти половины их состава. Между образцом со средней молекулярной массой 23 кДа и двумя остальными образцами сходство состава составляло существенно больше половины. Использование образцов хитозана не содержащих или содержащих в незначительной степени одинаковые по степени полимеризации молекулы полимера, позволило бы выявить ещё более сильные различия в проявлении ими биологических эффектах.
Кроме того биоцидная активность хитозана
меняется в зависимости от рН среды для низкомолекулярных и высокомолекулярных образцов хитозана. Известно, что значение рКа, при котором половина аминогрупп хитозана заряжена положительно, лежит в области 6,2-6,5. Для глюкозамина - мономера хитозана, рКа составляет 7,8. В связи с этим есть основания полагать, что олигомеры хитозана и некоторые олигохитозаны будут иметь константу диссоциации промежуточную между этими двумя значениями. Поэтому при нейтральных и слабощелочных значениях рН среды такие молекулы будут обладать большей антибактериальной активностью за счёт сохранения большего количества протонированных аминогрупп, по сравнению с высокомолекулярными образцами хитозана, низкие значения рКа которых не позволяют им в этих условиях сохранять достаточный уровень положительного заряда. При низких значениях рН, когда все молекулы хитозана заряжены, на первый план в их антибактериальной эффективности может выйти степень полимеризации, большая величина которой позволяет обеспечить более прочную связь с клеточными компонентами за счёт многоточечного взаимодействия. Таким образом, биоцидная активность хитозана может определяться несколькими факторами одновременно - молекулярной массой полимера, уровнем рКа и значением рН среды. Поэтому сравнительные исследования антимикробной эффективности хитозанов с различными молекулярными массами могут носить противоречивый характер из-за недооценки варьирования свойств полимера помимо молекулярно-массовых и структурных химических различий [41, 42, 43, 44].
В наших исследованиях по оценке антибактериальной активности в отношении S.aureus ряда образцов хитозана, различающихся по молекулярной массе (при степени СД более 90%) при различных значениях рН, установлено, что при увеличении рН среды выше 7,0 зависимость антибактериальной активности от молекулярной массы полимера претерпевает инверсию - в кислых условиях более сильным ингибирующим действием обладают образцы с большей молекулярной массой, а в слабощелочных условиях более активны олигомерные формы хитозана [44]. Предполагается, что антибактериальная активность хитозана определяется степенью протонирования его аминогрупп, которая является переменной величиной и зависит как от степени полимеризации вещества, так и значения рН среды. Также отмечена интересная особенность отдельных с небольшой молекулярной массой образцов проявлять наибольший ингибирующий эффект не при максимальной кислотности среды, а в области рН 6. Схожий эффект отмечался и для других поликатионов в отношении различных видов бактерий [45].
Более точному установлению взаимосвязи между физико-химическими свойствами и антибиотической активностью хитозана может способствовать получение узкодисперсных образцов полимера с различными молекулярными массами [46].
Литература
1. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / под ред.: К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Наука. 2002, - 368с.
2. S. Bautista-Banos, A.N. Hernandez-Lauzardo, M.G. Velazquez-del Valle, M. Hernandez-Lopez, E. Ait Barka, E. Bosquez-Molina, C.L. Wilson, Crop Protection, 25, 108118 (2006)
3. W. Chen, T.Z. Jin, J.B. Gurtler, D.J. Geveke, X. Fan, Int. J. Food Microbiol, 155, 3, 165-170 (2012)
4. M.M. Lou, B. Zhu, I. Muhammad, B. Li, G.L. Xie, Y.L. Wang, H.Y. Li, G.C. Sun, Carbohydr. Res, 346, 11, 12941301 (2012)
5. F. Devlieghere, A. Vermeulen, J. Debevere, Food Microbiol, 21, 703-714 (2004).
6.S. Roller, N. Covill, Int. J. Food Microbiol, 47, 67-77
(1999)
7. J. Rhoades, S. Roller, Appl. Environ. Microbiol, 66, 80-86
(2000)
8. R. Belalia, S. Grelier, M. Benaissa, V. Coma, J. Agric. Food Chem, 56, 5, 1582-1588 (2008)
9. N. Bordenave, S. Grelier, V. Coma, Biomacromol. 11, 1, 88-96 (2010)
10. G.-J. Tsai, W.-H. Su, H.-C. Cen, C.-L. Pan, Fisheries Science. 68, 170-177 (2002)
11. В.М. Быкова, С.В. Немцев, Л.И. Кривошеина, Е.А. Ежова, О.И. Глазунов, Рыбпром, 1, 33-34 (2009)
12. A.K. Singla, M. Chawla, J. Pharm. Pharmacol, 53, 10471067 (2001)
13. R.N. Tharanathan, F.S. Kittur, Crit. Rev. Nutr, 43, 61-87 (2003)
14. X.F. Liu, Y.L. Guan, D.Z. Yang, Z. Li, K.D. Yao, J. Appl. Polym. Sci, 79, 1324-1335 (2001)
15. H. Mellegärd, S.P. Strand, B.E. Christensen, P.E. Granum, S.P. Hardy, Int. J. Food Microbiol, 148, 1, 48-54 (2011)
16. Y.C. Chung, C.Y., Bioresource Technology, 99, 28062814 (2008)
17. J.Y. Je, S.K. Kim, J. Agric. Food Chem, 54, 18, 6629-6633 (2006)
18. Y.M. Chen, Y.C. Chung, L.W. Wang, K.T. Chen, S.Y. Li, Sci. Health A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng, 37, 7, 1379-1390(2002)
19. P.C. Tapia, M.D. Soto, G.L. Vergara, O.C. Alburquerque, R.A. Maccioni, C.A. Matamala, D.D. Hermosilla, V.S. Bucarey, Rev. Chil. Infect, 26, 6, 515-519 (2009)
20. C. Alburquenque, S.A. Bucarey, A. Neira-Carrillo, B. Urzua, G. Hermosilla, C.V. Tapia, Med. Mycol. 48, 8, 10181023 (2010).
21. B.C. Lee, M.S. Kim, S.H. Choi, K.Y. Kim, T.S. Kim, Int. J. Mol. Med. 24, 3, 327-333 (2009)
22. P. Eaton, J.C. Fernandes, E. Pereira, M.E. Pintado, F. Xavier Malcata, Ultramicroscopy, 108, 10, 1128-1134 (2008)
23. F. Seyfarth, S. Schliemann, P. Elsner, U.C. Hipler, Int. J. Pharm, 353, 1-2, 139-148 (2008)
24. S. Zivanovic, C.C. Basurto, S. Chi, P.M. Davidson, J. Weiss, J. Food Prot, 67, 5, 952-959 (2004)
25. J.C. Fernandes, P. Eaton, A.M. Gomes, M.E. Pintado, F. Xavier Malcata, Ultramicroscopy, 109, 8, 854-860 (2009)
26. J. Simünek, V. Brandysova, I. Koppova, J.Jr. Simunek, Folia Microbiol, 57, 4, 341-345 (2012)
27. A.B.V. Kumar, M.C. Varadaraj, L.R. Gowda, R.N. Tharanathan, Biochem J., 391, 2, 167-175 (2005)
28. Y. Park, M.H. Kim, S.C. Park, H. Cheong, M.K. Jang, J.W. Nah, K.S. Hahm, J Microbiol. Biotechnol, 18, 10, 1729-1734 (2008)
29. H. Liu, W. Tian, B. Li, G. Wu, M. Ibrahim, Z. Tao, Y. Wang, G. Xie, H. Li, G. Sun, Biotechnol. Lett, 34, 12, 22912298 (2012)
30. Д.В. Герасименко, И.Д. Авдиенко, Г.Е. Банникова, О.Ю. Зуева, В.П. Варламов, Прикладная биохимия и микробиология, 40, 3, 301-306 (2007)
31. A.B.V. Kumar, M.C. Varadaraj, R.N. Tharanathan, Biomacromol, 8, 2, 566-572 (2007)
32. D. Raafat, K. Bargen, A. Haas, H.G. Sahl, Appl. Env. Microbiol, 74, 12, 3764-3773 (2008)
33. Y.M. Chen, Y.C. Chung, L.W. Wang, K.T. Chen, S.Y. Li, J. Environ. Sci. Health A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng, 37, 7, 1379-1390 (2012).
34. X. Li, P. Wu, S. Cheng, X. Lv, J. Med. Chem, 55, 6, 27022710 (2012)
35. C. Qin, H. Li, Q. Xiao, Y. Liu, J. Zhu, Y. Du, Carbohydrate Polymers, 63, 367-374 (2006)
36. Y. Xu, H. Fan, C. Lu, G.F. Gao, X. Li, Biomacromolecules, 11, 7, 1701-1704 (2010)
37. J.C. Fernandez, F.K. Tavaria, J.C. Soares, O.S. Ramos, M.J. Monteiro, M.E. Pintado, F.X. Malcata, Food Microbiol, 25, 922-928 (2008)
38. A.N. Hernandez-Lauzardo, S. Bautista-Banos, M.G. Velazquez-del Valle, M.G. Mendez-Montealvo, M.M. Sanchez-Rivera, L.A. Bello-Perez, Carbohydr. Polym, 73, 541-547 (2008)
39. L.-Y. Zheng, J.-F. Zhu , Carbohydrate Polymers, 54, 527530 (2003)
40. С.Н. Куликов, С.Н. Чирков, А.В. Ильина, С.А Лопатин, В.П. Варламов, Прикладная биохимия и микробиология, 42, 2, 224-228 (2006)
41. Р.З. Хайруллин, С.Н. Куликов, В.Е. Тихонов, Е.А. Степанов, С.А. Лопатин, В.П. Варламов, Вестник Казанского технологического университета, 7, 148-152 (2010)
42. С.Н. Куликов, Р.З. Хайруллин, Вестник технологического университета, 18, 20, 249-252 (2015)
43. С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, Р.С. Фассахов, В.П. Варламов, Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии, 5, 91-98 (2009)
44. S. Kulikov, V. Tikhonov, I. Blagodatskikh, E. Bezrodnykh, S. Lopatin, R. Khairullin, Y. Philippova, S. Abramchuk, Carbohydrate Polymers, 87, 545-550 (2012)
45. L.A. Rawlinson, S.M. Ryan, G. Mantovani, J.A. Syrett, D.M. Haddleton, D.J. Brayden, Biomacromol, 11, 2, 443453 (2010)
46. С.А. Лопатин, М.С. Дербенева, С.Н. Куликов, В.П. Варламов, О.А. Шпигун, Журнал Аналитической Химии, 64, 6, 666-670 (2009)
© C. Н. Куликов - к.б.н, в.н.с. лаб. иммунологии и разработки аллергенов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора; с.н.с. кафедры микробиологии Казанского федерального университета, [email protected]; Р. З. Хайруллин - к.б.н., доц. каф. промышленной безопасности КНИТУ; с.н.с. лаб. иммунологии и разработки аллергенов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, [email protected].
© S. N. Kulikov - Ph.D., Leading researcher, Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology at Rospotrebnadzor; scientific researcher of Department of Microbiology Kazan Federal University; [email protected]; R. Z. Khayrullin - Ph.D., associate professor of the Department of Industrial Safety, KNRTU; Senior Researcher, Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology at Rospotrebnadzor; [email protected].
