CC BY
438
УДК 616.34-008.87:[579.861.2+579.842.17]: 615.324
антибактериальная активность хитозана в отношении
ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ И СТАФИЛОКОККОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ У ПАЦИЕНТОВ С ДИСБАКТЕРИОЗОМ КИШЕЧНИКА
Сергей Николаевич Куликов1, Юрий Александрович Тюрин ‘2, Руслан Зуфарович Хайруллин ‘
‘Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора (директор — проф. Р.С. Фассахов),
2 кафедра биологической химии (зав. — докт. мед. наук И. Г. Мустафин) Казанского государственного медицинского университета, е-mail: [email protected]
Реферат
Исследовано антибактериальное действие высокомолекулярного хитозана в отношении клинических изолятов энтеробактерий и стафилококков, выделенных у пациентов с дисбактериозом кишечника. Показано, что грамположительные стафилококки более чувствительны к хитозану, чем грамотрицательные энтеробактерии. Полученные in vitro данные представляют научный интерес в плане потенциальной возможности коррекции дисбактериозов с использованием хитозанового полимера.
Ключевые слова: хитозан, энтеробактерии, стафилококки, дисбактериоз толстого кишечника.
Наблюдаемое в настоящее время увеличение частоты и тяжести острых кишечных инфекций, торпидное течение и хронизация воспалительного процесса в кишечнике некоторыми исследователями объясняются развивающимся или имевшим место дисбактериозом. Очень часто дисбактериоз вызывают условно-патогенные энтеробактерии, многие из которых являются транзиторной микрофлорой желудочно-кишечного тракта. При различных состояниях, сопровождающихся ослаблением резистентности организма, энтеробактерии способны проникать в ткани и тканевые жидкости и составлять до 80% клинических изолятов всех грамотрицательных бактерий, вызывая до 50% всех случаев септицемий, до 70% гастроэнтеритов и выраженных микроэколо-гических нарушений кишечника [8]. При этом всё более серьёзной проблемой антибактериальной терапии при дисбактериозах становится широкое распространение полирезистентных штаммов среди энтеробактерий и стафилококков [13]. В связи с этим актуален поиск веществ, обладающих антибактериальной активностью и не вызывающих развитие побочных реакций, характерных для большинства антибиотиков широкого спектра действия.
656
Одним из таких веществ является хитозан — природный поликатион, состоящий из остатков глюкозамина и N-ацетилглюкозамина. Аминогруппы глюкозаминных звеньев хитозана позволяют ему связываться с отрицательно-заряженными поверхностными структурами клеток микроорганизмов, что приводит к нарушению барьерной функции наружной мембраны у грамотрицательных [15] и активации автолизинов у грамположи-тельных бактерий [9]. Проникая внутрь хитозан может взаимодействовать с различными компонентами цитоплазматического содержимого клетки, нарушая их нормальное функционирование [16, 10], что в итоге ведёт к гибели бактерий [17]. Проявляя ингибирующее действие в отношении микробов, хитозан при этом оказывает меньшее влияние на клетки млекопитающих [22, 23].
В настоящее время антибактериальные свойства хитозана используются при создании ранозаживляющих повязок, бинтов, хирургических нитей, текстильных материалов, кремов и мазей [12, 14]. Показан терапевтический эффект хито-зана в отношении Staphylococcus mutans [26]. Таким образом, препараты на основе хитозанового полимера, разрешённые для приёма внутрь, могут быть использованы как природные вещества, способствующие подавлению роста условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике при развитии дисбактериозов и бактериальных кишечных инфекций.
Цель работы — исследовать антибактериальную активность хитозана в отношении клинических изолятов энтеробактерий и стафилококков, выделенных у пациентов с дисбактериозом кишечника.
Клиническиеизолятыстафилококков— Staphylococcus aureus и Staphylococcus
epidermidis — были выделены из кишечника 10 детей в возрасте до одного года с клинико-лабораторным синдромом стафилококкового дисбактериоза кишечника субкомпенсированной формы. Массивность роста стафилококков в кишечнике детей составила для S. aureus >105 КОЕ/г кала, для S. epidermidis 104-105 КОЕ/г кала. Клинические изоляты грамотрицатель-ных бактерий выделены из кишечника 25 пациентов с дисбактериозом, ассоциированным с массивным ростом условно-патогенных энтеробактерий (>105 КОЕ/г кала) — Enterobacter agglomerans, Esсherichia coli (hem+ и hem-), Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis. Использовали по 5 штаммов каждого вида микроорганизмов, E. coli — 10, поровну hem+ и hem- штаммы.
В работе применялся высокомолекулярный полифракционный хитозан (ЗАО «Биопрогресс», г. Щёлково), полученный из крабового хитина с помощью щелочного деацетилирования. Средневязкостную молекулярную массу определяли виско-зиметрическим методом: она составляет 240 кДа [27]. Степень деацетилирования хитозана — 85%.
Антибактериальную активность хито-зана исследовали in vitro. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли используя серийные двойные разведения хитозана на мясопептонном бульоне [2]. В каждую пробирку вносили по 50 мкл физиологического раствора, содержащего суспензию бактерий в концентрации 6^107 КОЕ/мл. Контролем служила пробирка, содержащая чистую питательную среду. После 18 часов инкубации результаты учитывали по изменению оптической плотности среды, измеряемую при длине волны 600 нм.
Влияние концентрации хитозана на динамику роста культуры в жидкой питательной среде исследовали по модифицированному методу [16]. Для этого 50 мкл суспензии 18-часовой культуры бактерий, содержащей 6^107 КОЕ/мл, добавляли к 100 мкл мясопептонного бульона, содержащего хитозан в различной концентрации, и рН 6,0. В контрольный вариант хи-тозан не добавлялся. Смесь инкубировали при 37° С на качалке при 180 об/мин. Рост культуры оценивали по возрастанию плотности раствора, измеряемую при длине волны 600 нм.
© 42. «Казанский мед. ж.», № 3
Таблица 1
Антибактериальная активность высокомолекулярного хитозана в отношении клинических штаммов бактерий
Виды микроорганизма МИК, %
Е. agglomerans 0,002 ± 0,001
E. coli (hem-) 0,0025 ± 0,001
E. coli (hem+) 0,0025 ± 0,001
K. pneumoniae 0,003 ± 0,001
P. mirabilis 0,0025 ± 0,001
S. aureus 0,0001 ± 0,00005
S. epidermidis 0,00005 ± 0,00003
Антибактериальное действие в отношении энтеробактерий исследовали в соответствии с принятой методикой [2] используя 0,1% раствор препарата.
Статистическую обработку результатов производили с помощью программы MS Ехе1 2003.
МИК соответствует наибольшему разведению хитозана, тормозящему рост тест-культуры. В отношении клинических изолятов энтеробактерий МИК хи-тозана составила порядка 0,0025%; более чувствительными к действию вещества оказались золотистый стафилококк и Б. epideгmidis (табл. 1). Близкие данные об ингибирующей активности хитозана приведены и в литературе [16, 19]. Таким образом, грамотрицательные энтеробактерии оказались более устойчивыми к действию этого полимера по сравнению с грамположительными кокками. Возможно, это связано с наличием у грамот-рицательных бактерий внешнего липополисахаридного слоя, который выполняет барьерную функцию от проникновения олигомерных молекул хитозана в клетку. У грамположительных бактерий подобной структуры не имеется, но даже при наличии микрокапсулы на поверхность клеток часто выходят тейхоевые кислоты, пронизывающие муреиновую стенку [3]. Поликатионная природа хитозана позволяет формировать с тейхоевыми кислотами комплекс, из которого могут вытесняться автолизины, что приводит к неконтролируемому лизису клеточной стенки [9].
Энтеробактерии оказались более устойчивыми к действию хитозана и в опыте по влиянию концентрации препарата на рост культуры в жидкой питательной среде. Ингибирование роста кишечной
Рис.1. Влияние концентрации высокомолекулярного хитозана на рост культуры гемолитической E. œli (А), S. aureus (В), S. epidermidis (С).
палочки, как и других видов энтеробактерий, отмечено при концентрации хитозана, равной 0,0025%, золотистого стафилококка при 0,005% (рис. 1). Самым чувствительным оказался эпидермальный стафилококк, рост которого не обнаруживался уже при концентрации хитозана 0,003%.
Исследование антибактериального действия хитозана показало, что при часовой инкубации энтеробактерий с 0,1% раствором количество живых клеток у всех штаммов уменьшалось на порядок и более (рис. 2). Ингибирующая активность хитозана была одинаковой для штаммов кишечной палочки, как обладающих гемолитической активностью, так и не имеющих таковую. Мутантный штамм S. typhimurium, во внешней мембране которого присутствует аномальный положительнозаряженный ЛПС, обладал большей устойчивостью к действию хитозана [11]. Аналогичная картина отмечена для мутантных штаммов S. aureus, которые не имели ферментов, обеспечивающих биосинтез нормального количества тейхоевой кислоты [20]. Однако даже в отношении таких микроорганизмов хитозан обладал антибактериальным эффектом при увеличении его концентрации всего в несколько раз. По всей видимости, это связано с тем, что хитозан, в отличие от классических антибиотиков, воздействует сразу на несколько “мишеней” в бактериальной клетке. Действительно, антибактериальный эффект хитозанового полимера опосредован его взаимодействием с различными
клеточными структурами — тейхоевыми кислотами, ЛПС, мембранными белками, ЦПМ, возможно, с нуклеиновыми кислотами, что подтверждает его эффективность в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных микроорганизмов [21]. Было показано, что в результате действия хитозана в клетках золотистого стафилококка изменяется уровень экспрессии 166 генов, из которых 84 индуцируются и 82 супрессируются [20]. При этом транскрипционный профиль S. aureus не совпадает с транскрипционными профилями при действии антибиотиков [18], что затрудняет сравнение механизма действия хитозана с классическими антимикробными веществами.
Очень важным является наличие у хитозана мощного противолипополиса-харидного эффекта [1]. Таким образом, перспективность аффинной энтеросорбции продуктами хитозана при активации грамотрицательной микрофлоры и образовании большой концентрации бактериальных экзо- и эндотоксинов не вызывает сомнений. Следует отметить, что биологическая активность препаратов на основе хитозана будет зависеть от физико-химических характеристик биополимера [5, 6]. Хитозан, являющийся природным сополимером N-ацетилглюкозамина и глюкозамина, объединяет гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени ацетилирования, расположению ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости и значению рКа [24, 25]. Ранее было показано, что увеличение степени деацетилирования и уменьшение рН среды усиливает антибактериальное действие хитозанового полимера [14]. Имеются данные о более высокой эффективности высокомолекулярных образцов хитозана, что объясняет их способность образовывать более прочные связи с бактериальными клетками [20]. В то же время в некоторых работах указывается на увеличение антибактериальной активности при уменьшении молекулярной массы полимера, что связывают с большей его способностью проникать через клеточную стенку [2].
Нами ранее было показано, что антибактериальная активность хитозанового полимера может зависеть от уровня его рКа [7]. При этом в среде с нейтральным
и слабощелочным рН эффективнее низкомолекулярные и олигомерные фракции хитозана, которые обладают более высоким уровнем рКа, и, следовательно, будут иметь большее количество положительно заряженных аминогрупп. Среда в нижних отделах кишечного тракта имеет нейтральную или слабощелочную реакцию. Поэтому препараты, которые могут быть разработаны для лечебно-профилактических целей, должны состоять из олигомерных молекул, сохраняющих антибактериальные свойства в нейтральной и слабощелочной средах.
Другим подходом для решения проблемы растворимости хитозана в щелочных условиях может стать создание производных, в структуру которых введены боковые группы. Введение моно- или дисахаридных остатков в молекулу полисахарида с использованием реакции Майера меняет картину растворимости производных при значениях рН выше кажущейся константы кислотности аминогрупп хитозана (6,2—6,5). Основание Шиффа, образующееся на первой стадии, а также промежуточные соединения, являющиеся результатом перегруппировки Амадори, как полагают, ответственны за антимикробную активность [4].
Таким образом, высокомолекулярный хитозан обладает ингибирующим действием в отношении энтеробактерий и стафилококков, выделенных у пациентов с выраженными микроэкологическими нарушениями кишечника. Материалы работы представляют научный интерес в плане потенциальной возможности использования хитозанового полимера для коррекции дисбактериозов. Дальнейшие исследования антибактериального действия низкомолекулярных форм полимера позволят провести сравнительную оценку биологической активности вещества с различной молекулярной массой и определить наиболее эффективные образцы.
Работа выполнена при финансовой поддержке регионального гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 09-04-99035 р_офи).
ЛИТЕРАТУРА
1. Большаков И.Н., Насибов С.М., Куклин Е.Ю., Приходько А.А. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. — М.: Наука, 2002. — С. 280—301.
2. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е. и др. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов// Прикл. биохим. микробиол. — 2004. — Т. 40. — № 3. — С. 301—306.
3. Дмитриева Н.Ф., Тимофеев Ю.М., Брико Н.И. Ли-потейхоевые и тейхоевые кислоты патогенных стрептококков: структура, функции, роль во взаимодействии возбудителя с макроорганизмом// Журн. микробиол. — 2007. — Т. 6. — С. 100—107.
4. Ильина А.В., Куликов С.Н., Чаленко Г.И. и др. Получение и исследование моносахаридных производных низклмолекулярного хитозана//Прикл. биохим. мик-робиол. — 2008.— № 5. — С. 606—614.
5. Куликов С.Н., Варламов В.П. Роль структуры в эли-ситорной активности хитозана / Учёные записки Казанского ун-та. Серия “Естественные науки”. — 2008. — Т. 150. — Кн. 2. — С. 43—58.
6. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Долбин Д.А., Хайрул-лин Р.З. Роль структуры в биологической активности хитозана // Вестн. Казанск. технологическ. ун-та. — 2007. — № 6. — С. 10—15.
7. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Албулов А.И. и др. Антибактериальная активность хитозана: практика и теория / Мат. IX Международн. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». — М.: ВНИРО. — 2008. — С. 184—187.
8. Медицинская микробиология / Гл. ред. В.И. Покровский, О.К. Поздеев. — М.: ГЭОТАР Медицина,
1999. — 1200 с.
9. Bierbaum G, Sahl H.G. Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoil-L-alanine amidase // J. Bacteriol. — 1987. — №. 169. — P. 5452—5458.
10. Choi B.K., Kim K.Y., Yoo Y.J. et al. In vitro antimicrobial activity of a chitooligosaccharide mixture against Actinobacillus actinomycetemcomitans and Streptococcus mutans // Int. J. Antimicrob. Agent. — 2001. — №. 18. — P. 553—557.
11. Helander I.M., Nurmiaho-Lassila E.L., Ahvenainen R. et al. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of gram-negative bacteria // Int. J. Food Microbiol. — 2001. — №. 71. — P. 235—244.
12. Kumar R., Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C. et al. Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives // Chem. Rev. — 2004. — №. 104. — P. 6017—6084.
13. Leclercq R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications // Clin. Infect. Dis. — 2002. — №. 34. — P. 482-492.
14. Lim S.H., Hudson S.M. Review of chitosan and its derivatives as antimicrobial agents and their uses as textile chemicals // J. Macromol. Sci. —2003. —Vol. C43. — № 2. — P. 223—269.
15. Liu H, Du Y, WangX, Sun L. Chitosan kills bacteria through cell membrane damage // Int. J. Food Microbiol. — 2004. — №. 95. — P. 147—155.
16. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z. et al. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan // J. Appl. Polym. Sci. — 2001. — №. 39. — P. 1324—1335.
17. Moon J.-S, Kim H.-K., Koo H.C. et al. The antibacterial
and immunostimulative effect of chitosan-oligosaccharides against infection by Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2007. — №. 75. — P. 989—998.
18. Pag U, Oedenkoven M, Sass V. et al. Analysis of in vitro activities and mode of action of synthetic antimicrobial peptides derived from an a-helical “sequence template”// . Antimicrob. Chemother. — 2008. — №. 61. — P. 341—352.
19. Park P.J., Je J.Y., Byun H.G. et al. Antimicrobial activity of hetero-chitosans and their oligosaccharides with different molecular weights// J. Microbiol. Biotechnol. — 2004. — № 14. — P.317—323.
20. Raafat D., Bargen K., Haas A., Sahl H.G. Insight into the mode of action of chitosan as an antibacterial compound // Appl. Env. Microbiol. — 2008. — № 12 (74). — P. 3764—3773.
21. Rabea E.I., Badawy M.E, Stevens C.V. et al. Chitosan as antimicrobial agent: application and mode of action // Biomacromol. — 2003. —№ 3 (4). — P. 1457—1465.
22. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Appl. Environ. Microbiol. —
2000. — № 66. — P. 80—86.
23. Roller S., Covill N. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice // Int. J. Food Microbiol. — 1999. — № 47. — P. 67—77.
24. Singla A.K., Chawla M.Chitosan: some
pharmaceutical and biological aspects - an update // J. Pharm. Pharmacol. — 2001. — Vol. 53. — P. 1047—1067.
25. Tharanathan R.N., KitturF.S. Chitin - the undisputed biomolecule of great potential // Crit. Rev. Nutr. — 2003. — № 43. — P. 61—87.
26. Virga C, Beltramo D, Landa C. et al. A comparative study in vivo of the therapeutic effect of triclosan, hexetidine and chitosan // Acta Odontol. Latinoam. — 2002. — № 15. — P. 3—9.
27. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. — 1991. — № 5 (13). — P. 281—285.
Поступила 10.12.09.
ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF CHITOSAN AGAINST ENTERoBACTERIA AND STAPHYLOCOCCI ISOLATED FROM PATIENTS WITH INTESTINAL DYSBACTERIOSIS
S.N. Kulikov, YuA. Tyurin, R..Z. Khairullin
Summary
Studied was the antibacterial activity of macromolecular chitosan on the clinical isolates of enterobacteria and staphylococci isolated from patients with intestinal dysbacteriosis. It was shown that Grampositive staphylococci are more sensitive to chitosan than Gram-negative enterobacteria. These in vitro data are of interest for potential correction of dysbacterioses by using the chitosan polymer.
Key words: chitosan, enterobacteria, staphylococci, intestinal dysbacteriosis.
