CC BY
115
Антибактериальное исследование препаратов из видов Veronica L. Предуралья
Н. Ф. Гусев, к.б.н., доцент, О. Н. Немерешина, к. б.н, доцент, Оренбургский ГАУ
Антибактериальные свойства многих лекарственных растений известны очень давно и испытаны, в первую очередь, врачами Древней Греции, Арабского Востока, Китая и Индии (Богоявленский, 1960; Попов, [1, 2, 3, 4], 1956; Кузнецова, Резникова, 1992). Антимикробные свойства растений используются в научной и практической медицине для лечения инфекционных и воспалительных заболеваний [5], заболеваний полости рта [6], слизистых оболочек глаз [7, 8], болезней органов дыхания и желудочно-кишечного тракта [9].
Указанное связано с тем, что содержащиеся в растениях биологически активные вещества (БАВ) помимо антибиотической активности активируют факторы неспецифической иммунологической реактивности, стимулируют регенеративные процессы в тканях и оказывают противомикробное действие [10]. В последние годы исследуется антимикробная активность не только отдельных групп действующих веществ [11], но и комплексных соединений и экстракционных препаратов [12], так как в них возможно суммирование и потенцирование биологической активности [13].
Виды рода Вероника—Veronica L. издавна применяются в народной медицине, фитотерапии, гомеопатии и ветеринарии для лечения кожных заболеваний (дерматит), заболеваний органов дыхания (бронхит, трахеит, плеврит), при заболеваниях желудочно-кишечного тракта (гастрит, язва желудка, энтероколит) , воспалениях почек, мочевого пузыря, болезнях сердечно-сосудистой системы, как витаминное [14, 15]. В гомеопатии используются свежие растения вероник и спиртовые эссенции [16], а в народной медицине — водные извлечения и сборы [17].
Ранее нами изучались антибактериальные свойства извлечений из травы некоторых вероник, произрастающих в Кунгурско-Красноуфимской лесостепи Среднего Предуралья. Однако эти сведения неполны и нуждаются в уточнении. Литературные сведения об антимикробных свойствах видов рода Veronica L., произрастающих в районах Южного Предуралья, отсутствуют.
Вышеизложенное и явилось предпосылкой для проведения сравнительного изучения антибактериальной активности извлечений и препаратов из растений рода Veronica L. лесостепного и степного Предуралья.
Материал и методы исследования. Материал для исследования (трава видов рода Veronica L.) был собран в период цветения растений в различных зонах Предуралья. Так, V. officinalis L., V. chamaedris L., V. spuria L. были собраны в Кунгурско-Красноуфимс-кой лесостепи Среднего Предуралья. Первые два вида собраны в сосновом лесу (окрестности д. Кры-
лово Красноуфимского района Свердловской области), а вероника — ненастоящая — на остепненных лугах (Александровские сопки Красноуфимского района Свердловской области). Четыре вида собраны в районах Южного Предуралья: V. spicata L. — на степных участках Башкирии (окрестности г. Стер-литамака), V. teucrium L. — на остепненных лугах, в березовых колках (окрестности Тюльгана Оренбургской области), V. 1о^&На L. — на лугах, в пойме р. Урал (Оренбургский район Оренбургской области), V. шсапа L. — в типчаково-разнотравной степи (окрестности Саракташа Оренбургской области).
Растительный материал высушивали воздушнотеневым способом, измельчали, просеивали через сито с диаметром отверстий 2 мм и использовали для приготовления извлечений.
Водные извлечения (отвары) готовили в соотношении 1:10 из сырья, содержащего дубильные вещества, по методике, изложенной в Государственной фармакопее (1987).
Спиртовые извлечения (настойки) получены методом перколяции, в соотношении 1 : 5, при использовании этанола различной концентрации [18].
Сумму свободных полифенолов (оксикоричных кислот) получали из водных извлечений путем их экстракции диэтиловым эфиром [19]. Эфир отгоняли, а остаток растворяли в воде и проводили исследования на антимикробную активность.
Извлечение суммы иридоидов получали из сухого измельченного сырья по методу, описанному ^го§ег G., Simchen Р., 1967).
Из наиболее перспективных видов вероник (в. лекарственная, в. колосистая, в. седая) получали сухие экстракты, используя метод турбоэкстракции (Бобылев, 1971). Метод основан на вихревом перемешивании сырья (с количеством оборотов до 4000 в минуту) и экстрагента при одновременном измельчении сырья. В качестве экстрагента мы использовали воду, нагретую до 40°С и 90°С и этиловый спирт различной концентрации (25%, 30%, 40%, 70% и 90%). Вытяжку отстаивали при температуре +5°С в течение 3-х суток, затем фильтровали, сгущали и высушивали в сушильном шкафу при температуре 70°С. Полученный экстракт — порошок бурого цвета, исследовали на наличие флавоноидов методом двумерной хроматографии на бумаге. При этом обнаружено, что наибольшее количество флавоноидов извлекается 70%-ным этанолом. Так, в траве вероники лекарственной обнаружено шесть основных веществ флавоновой природы, в траве в. седой — пять, а в траве в. колосистой — семь.
Количественное определение суммы флавонои-дов в извлечениях и экстрактах из сырья видов рода \eronica L. проводили фотоэлектроколориметричес-ким методом [21].
Содержание суммы свободных полифенолов (ок-сикоричных кислот) проводили по общепринятой
методике [19], основанной на разделении полифенолов и собственно танидов диэтиловым эфиром и последующем титровании извлеченной фракции эфиром перманганатом калия с использованием индигосульфокислоты.
Содержание суммы иридоидов в извлечениях из сырья растений проводили (в пересчете на аукубин) [20].
Испытание на антимикробную активность извлечений и экстрактов, полученных из травы вероник, проводили в отношении грамположительных и гра-мотрицательных бактерий. В качестве тест-микроорганизмов были использованы штаммы, рекомендуемые для исследования препаратов: культура золотистого стафилококка —Stahpylococcus aureus, штамм-209 и культура кишечной палочки — Escherichia coli, штамм М-17.
Исследования проводили в жидких питательных средах методом двукратных серийных разведений. Для этого готовили двукратное разведение извлечений в мясо-пептонном бульоне. Разведение готовили непосредственно в пробирках, подлежащих засеву.
В каждом ряду разведений для контроля имели равное количество пробирок с соответствующими разведениями этилового спирта и две пробирки — со средой без извлечения, а при исследовании водных извлечений в качестве контроля брали две пробирки со средой без извлечения.
Культуры для экспериментов готовились следующим образом: суточные агаровые культуры переносили петлей в пробирку с физиологическим раствором, где готовилось исходное разведение в 500 млн. микробных тел в 1 мл по оптимальному стандарту. Полученную взвесь разводили бульоном, в начале в 100, а затем еще в 10 раз, для того, чтобы получить взвесь микробов, содержащую 500000 микробных тел в 1 мл, которая являлась рабочим разведением культуры. Изготовленную культуру вносили по 1 мл как в пробирки с извлечением, так и в контрольные, не содержащие извлечений.
Бактериальная нагрузка составляла, таким образом, 250000 микробных тел в 1 мл. Вслед за этим штативы с пробирками помещались в термостат при температуре 37°С. Результаты опыта учитывались через 20—24 часа. Регистрировали наличие роста (помутнение) или задержку роста в среде за счет бак-териостатического действия извлечений. За действующую дозу принимали ту наименьшую концентрацию извлечения, которая задерживала рост бактериальных культур.
Результаты исследований. Результаты проведенных опытов показали (табл. 1), что водные извлечения из травы видов рода \feronica L. обладают меньшей активностью, по сравнению со спиртовыми как в отношении грамположительных (St. aureus), так и грамотрицательных (E. coli) микроорганизмов.
Сухие экстракты из травы перспективных видов Veronica L. (V. spicata L., V. officinalis L., V. spuria L., V. incana L.), полученные при использовании в качестве экстракта дистиллированной воды, обладают слабой активностью и только в отношении грам-
положительных микроорганизмов (St. aureus), а в отношении E. Coli — они недеятельны (табл. 3).
Спиртовые извлечения из видов \feronica L., полученные при использовании в качестве экстрагента этилового спирта различной концентрации, проявляют значительную антимикробную активность в отношении St. aureus и E. rali (табл 1). При этом наиболее высокая активность отмечена в отношении E. rali в извлечениях, полученных при использовании 70% этанола из травы V. spicata L. и V. spuria L. (1:800). Несколько меньшую антимикробную активность (1:400) в отношении E. rali проявляют спиртовые извлечения из травы V. officinalis L., V. incana L. и V. chamaedris L. Довольно низкая антимикробная активность (1:200) в отношении обеих групп микроорганизмов (St. aureus и E. rali) наблюдалась в спиртовых извлечениях из травы V. longifolia L. и V. teucrium L.
Указанные исследования позволяют сделать вывод, что антимикробная активность спиртовых извлечений в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий зависит от содержания в них действующих веществ и концентрации используемого экстрагента.
Извлечения свободных полифенолов (оксико-ричных кислот) из травы видов рода Veronica L. обладают наиболее высокой активностью в отношении штаммов обоих микроорганизмов (табл. 2). При этом наибольшая антимикробная активность наблюдалась у извлечений из травы V. spicata L. в отношении St. aureus (1:160 000) и несколько меньшая — в отношении E. rali (1:20 000).
Извлечение свободных полифенолов с (оксико-ричных кислот) из травы V. officinalis L. проявляют значительно меньшую антимикробную активность как в отношении St. aureus (1:80 000), так и в отношении E. rali (1:10 000).
Выраженная антимикробная активность (1:40 000) в отношении St. aureus отмечена у извлечений свободных полифенолов (оксикоричных кислот) из травы V. spuria L., V. longifolia L. и V. incana L., а самая низкая активность по отношению к указанным микроорганизмам — у извлечений из травы V. chamaedris L. и V. teucrium L.
В отношении E. rali антимикробная активность (1:10 000) была одинаковой у извлечений свободных полифенолов (оксикоричных кислот) из травы V. spuria L., V. officinalis L., V. longifolia L. и V. incana L.
Низкой активностью в отношении E. ^li (1:5 000) обладают извлечения свободных полифенолов (оксикоричных кислот) из травы V. chamaedris L. и V. teucrium L.
Результаты исследований антимикробной активности суммы иридоидов из травы видов рода Veronica L. показали (табл. 2), что одинаково высокой активностью в отношении штаммов обоих микроорганизмов обладают извлечения из V. officinalis L. и V. spicata L. Причем извлечения из травы V. officinalis L., собранной в период плодоношения растений, проявляют большую активность по сравнению с растениями, собранными в фазу цветения.
Содержание суммы иридоидов в извлечениях из травы видов рода Veronica L. имеют различные зна-
1. Антимикробная активность извлечений из растений рода Veronica L. Предуралья и суммарное содержание в них полифенольных соединений
№ п/п Виды растений Извлечение и используемый экстрагент Вид микробов и активность Содержание полифенольных соединений
Stahpylococcus aureus, Echerichia coli Флавоноиды Оксикоричные кислоты
1 Veronica officinalis L. водное (отвар) 1:200 1:100 0,27 2,06
спиртовое (настойка): 40% этанол 1:200 1:200 1,84 -
спиртовое (настойка): 70% этанол 1:200 1:400 2,07 -
водно-эфирное: диэтиловый эфир 1:80 000 1:10 000 - 3,07
2 Veronica chamaedrys L. водное (отвар) 1:100 1:80 0,14 1,63
спиртовое (настойка): 40% этанол 1:200 1:200 1,12 -
спиртовое (настойка): 70% этанол 1:100 1:400 1,54 -
водно-эфирное: диэтиловый эфир 1:20 000 1:5 000 - 1,76
3 Veronica teucrium L. водное (отвар) 1:100 1:100 0,22 1,84
спиртовое (настойка): 40% этанол 1:200 1:200 1,17 -
спиртовое (настойка): 70% этанол 1:200 1:200 1,39 -
водно-эфирное: диэтиловый эфир 1:20 000 1:5 000 - 1,62
4 Veronica spicata L. водное (отвар) 1:200 1:200 0,23 2,54
спиртовое (настойка): 40% этанол 1:400 1:200 2,46 -
спиртовое (настойка): 70% этанол 1:200 1:800 2,93 -
водно-эфирное: диэтиловый эфир 1:160 000 1:20 000 - 2,84
5 Veronica longifolia L. водное (отвар) 1:400 1:200 0,31 2,4
спиртовое (настойка): 40% этанол 1:100 1:100 2,17 -
спиртовое (настойка): 70% этанол 1:200 1:200 2,45 -
водно-эфирное: диэтиловый эфир 1:40 000 1:10 000 - 2,68
6 Veronica spuria L. водное (отвар) 1:100 1:200 0,20 1,89
спиртовое (настойка): 40% этанол 1:200 1:200 1,86 -
спиртовое (настойка): 70% этанол 1:100 1:800 2,51 -
водно-эфирное: диэтиловый эфир 1:40 000 1:10 000 - 2,72
7 Veronica incana L. водное (отвар) 1:100 1:80 0,19 1,63
спиртовое (настойка): 40% этанол 1:200 1:100 1,78 -
спиртовое (настойка): 70% этанол 1:200 1:400 2,46 -
водно-эфирное: диэтиловый эфир 1:40 000 1:10 000 - 2,29
чения (табл. 2). Наибольшее их содержание отмечено в траве V. spicata L., V. officinalis L. и V. spuria L.(до 1,26%) и эти же виды проявляют повышенную антимикробную активность в отношении грамположи-тельных (St. aureus) и грамотрицательных (E. rali) микроорганизмов.
Среднее значение антимикробной активности в отношении обоих групп микроорганизмов установлено в извлечениях суммы иридоидов из травы V. incana L. и V. longifolia L., а самая низкая активность в отношении обоих микроорганизмов установ-
лена в извлечениях из травы V. chamamaedris L. и V. teucrium L.
Сухие спиртовые экстракты по содержанию фла-воноидов в перспективных видах Veronica L. (V spicata L., V. officinalis L., V. incana L., V. spuria L.) обладают антимикробной активностью только в отношении St. aureus, а в отношении E. rali — они недеятельны (табл. 3). Высокое содержание суммы флавоноидов (до 9%) и наибольшую антимикробную активность проявляют сухие экстракты из травы V. spuria L. (1:8 000), V. incana L. и V. officinalis L. (1:4000), при
2. Антимикробная активность извлечений суммы иридоидов из видов рода Veronica L. Предуралья
№ п/п Виды растений Фенофаза Вид микроба и антимикробная активность Содержание суммы иридоидов (% на абс. сух. вес)
St. aureus E. шіі
1 V. officinalis L. цетение 1:1 600 1:4ОО 0,86
плодонош. 1:1 600 - 1,04
2 V. chamaedris L. цветение 1:200 1:1ОО 0,53
3 V. teucrium L. цветение 1:200 1:8О 0,48
4 V. spicata L. цветение 1:1 600 1:1 бОО 1,16
5 V. longifolia L. цветение 1:600 1:4ОО 0,84
б V. spuria L. цветение 1:800 1:бОО 1,26
7 V. incana L. цветение 1:800 1:4ОО 0,87
получении которых в качестве экстрагента использовали 40%-ный этанол.
Наименьшее содержание суммы флавоноидов и слабую антимикробную активность проявляют сухие экстракты, полученные из травы вероник при использовании в качестве экстрагента дистиллированной воды и этилового спирта низкой концентрации. Однако известно, что флавоноиды многих цветковых растений обладают выраженной антимикробной активностью. Отсутствие антимикробной активности у препаратов — сухих экстрактов, полученных с использованием различных экстрагентов, объясняется наличием термической стадии их получения, что приводит к разрушению ряда ферментов, способствующих активности действующих веществ.
В результате исследований антимикробной активности извлечений и препаратов — сухих экстрактов из травы видов рода Veronica L. лесостепного и степного Предуралья — установлено следующее:
1. Водные и спиртовые извлечения (настойки) при использовании спирта слабой концентрации
проявляют незначительную антимикробную активность в отношении грамположительных и грамот-рицательных бактерий.
2. Высокую антимикробную активность в отношении St. aureus и E. coli проявляют извлечения свободных полифенолов (оксикоричных кислот) (от 1:5000 до 1:160 000) и извлечения суммы иридоидов (до 1:1600).
3. Сухие экстракты, полученные из травы видов рода Veronica L., проявляют активность только в отношении E. coli. Отсутствие антимикробной активности, вероятно, связано с термической обработкой сырья в процессе получения препаратов (Elich, 1962), что вызывает инактивацию ферментов, необходимых для отщепления агликонов, обладающих более высокой активностью по сравнению с глико-зидами.
4. Сухие экстракты из травы видов рода Veronica L., полученные с использованием в качестве экстрагента 40%-ного этанола, содержат повышенное количество суммы флавоноидов и проявляют более
3. Антимикробная активность препаратов сухих экстрактов из перспективных видов рода Veronica L. Предуралья и содержание в них флавоноидов
№ п/п Вид растения Используемый Вид микроба и активность Содержание суммы флавоноидов(%)
экстрагент Staphylococcus aureus Echerichia coli
вода (отвар) 20% этанол 1:80 1:1000 * * 1,04 2,49
1 Veronica officinalis L. 30% этанол 40% этанол 1:4000 1:4000 * * 4,76 5,62
70% этанол 1:2000 * 3,13
90% этанол 1:1000 * 2,68
вода (отвар) 20% этанол 1:100 1:1000 * * 1,12 2,61
2 Veronica spicata L. 30% этанол 40% этанол 1:1000 1:2000 * * 2,83 3,92
70% этанол 1:1000 * 2,14
90% этанол 1:1000 * 2,36
вода (отвар) 20% этанол 1:80 1:4000 * * 1,02 5,98
3 Veronica spuria L. 30% этанол 40% этанол 1:2000 1:8000 * * 3,53 8,67
70% этанол 1:2000 * 3,66
90% этанол 1:4000 * 5,82
вода (отвар) 20% этанол 1:80 1:1000 * * 0,90 2,67
4 Veronica incana L. 30% этанол 1:1000 * 2,48
40% этанол 1:4000 * 5,87
70% этанол 1:2000 * 3,50
90% этанол 1:1000 * 2,56
Примечание: * — отсутствие активности (недеятельные экстракты)
высокую антимикробную активность в отношении St. aureus и Е. coli по сравнению с другими спиртовыми вытяжками.
5. Наилучшим экстрактом для получения извлечений и препаратов — сухих экстрактов из травы видов рода Veronica L. — следует считать 40%-ный и 70%-ный этанол.
6. Высокую антимикробную активность в отношении St. aureus и Е. coli проявляют извлечения и препараты — сухие экстракты из травы V. spicata L., V. officinalis L., V. incana L. и V. spuria L., что представляет практический интерес для разработки на их основе антибактериальных лекарственных средств с целью их использования в медицинской практике и ветеринарии.
Литература
1 Авиценна, (Абу Али Ибн-Сина). Канон врачебной науки. Кн. 2. — Ташкент, 1956.
2 Богоявленский, Н. А. Древнерусское врачевание в XI—XVII вв. — М., 1960.
3 Кузнецова, М. А., Резникова А. С. Сказания о лекарственных растениях. — М.: «Высшая школа», 1992. — 272 с.
4 Попов, А. П. Лекарственные растения в народной медицине. — Киев, 1968.
5 Ягодка, В. С. Фитотерапия в дерматологии и косметике. Киев, 1987.
6 Данилевский, Н. Ф., Зинченко, Т. В., Кодола, Н. А. Фитотерапия в стоматологии. Киев, 1984.
7 Марголис, М.Г. Лекарственные растения в офтальмологии. // Вестник офтальмологии. — М., 1976. — № 6. — С. 81—82.
8 Можеренков, В. П., Агафонов Б. В. Фитотерапия глазных болезней // Офтальмологический журнал (Одесса). 1978. — № 5. - С. 366-369.
9 Соколов, С. Я., Замотаев, И. П. Справочник по лекарственным растениям (фитотерапия). — М.: «Недра», 1989.
10 Бондаренко, А. С. Высшие растения — продуценты антибиотиков // В сб. «Фитонциды» Киев, 1981. — С. 204—210.
пЦеденова, Л. П., Романов, О. Е., Романова, Т. О., Лаврентьева, Е. П. Антимикробная активность эфирного Ma^aArtemisia lerchiana Web. Ex Stechm., произрастающей в Калмыкии // Раст, ресурсы. 1999. — Т. 36. Вып. 4. — С. 58—60.
12Гребнева, Н. Ю., Потехина, Т. С., Лесновская, Е. Е., Харитонова, Н. П. Антимикробная активность водных извлечений растительного сбора «Полестея» для лечения легочных заболеваний // Растительные ресурсы, 2000. — Т. 36., Вып. 3. - С. 9-17.
13Айзенман, Б. Е. Сравнение антибиотиков, образуемых микроорганизмами и высшими растениями (сходство и различия) // В сб. «Фитонциды». — Киев, 1981. — С. 22—28.
14Акопов, И. Э. Важнейшие отечественные лекарственные растения. — Ташкент: Медицина, 1990. — 444 с.
15Преображенский, В. И. Современная энциклопедия лекарственных растений. — Изд. Баро-Пресс. Ростов-на-Дону, 2001. - 453 с.
16Gessner G. Die Gift und Arzneipflanzen von Mitteleurope. Heidelberg. 1953. — 804 c.
17Носаль, И. М. Лекарственные растения и способы их применения в народе. — Минск: «Полымя», 1997.
18Ажгихин, И. С. Технология лекарств. — М.: Медицина, 1975.
19Запрометов, М. Н. Основы биохимии фенольных соединений. — М., 1974.
20Grnger G., Simchen P. Zur Kentniss iridoider Pflanzenstoffe/ Die Pharmazie, 1967. - 22. - № 6. - S. 315.
21 Краснов, E. А., Березовская, Т. П. и др. Выделение и анализ природных биологически активных веществ. — Томск. Изд. Томского ун-та, 1987.
