CC BY
8
DOI: 10.37489/0235-2990-2020-65-7-8-3-7
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Антибактериальная активность модифицированных углеродных сорбентов, перспективных для аппликационного применения
*В. Т. ДОЛГИХ1, Л. Г. ПЬЯНОВА2, Е. В. НАУМКИНА3, А. В. ЛАВРЕНОВ2, Е. В. МАТУЩЕНКО3, Н. В. КОРНИЕНКО2
1 НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского ФНКЦ РР, Москва
2 Центр новых химических технологий ФГБУН «Института катализа им. Г. К. Борескова СО РАН», Омск
3 Омский государственный медицинский университет Минздрава России, Омск
Antibacterial Activity of Modified Carbon Sorbents, Prospective for Application
*V. T. DOLGIKH1, L. G. PYANOVA2, E. V. NAUMKINA3, A. V. LAVRENOV2, E. V. MATUSHCHENKO3, N. V. KORNIENKO2
1 V. A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology, Moscow
2 Center of New Chemical Technologies of Boreskov Institute of Catalysis of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Omsk
3 Omsk State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, Omsk
Цель — изучить антибактериальные и антимикотические свойства углеродных сорбентов, модифицированных биологически активными веществами, в отношении возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. Материал и методы. Изучалась активность растворов модификаторов и модифицированных образцов углеродных сорбентов в отношении тест-штаммов условно-патогенных микроорганизмов в сравнении с исходным образцом углеродного сорбента. Из тест-штаммов микроорганизмов готовили взвесь с известным содержанием микробных клеток, инкубировали в лунках с исследуемыми образцами в течение 48 ч. Выживаемост ь микроорганизмов определяли путём количественных высевов из каждой лунки смеси «образец — микроорганизм» через определённые промежутки времени термостатирования на чашки Петри с простым питательным агаром, затем подсчитывали количество жизнеспособных микробных клеток в исследуемой смеси. Результаты. Проведённые исследования продемонстрировали высокую антибактериальную и антимикотическую активность модифицированных углеродных сорбентов. Наилучший результат в сравнении с исходным образцом показал углеродный сорбент, модифицированный олигомерами молочной кислоты с иммобилизованным лизоцимом. Проведённые исследования показали перспективность использования модифицированных образцов углеродного сорбента для аппликационной терапии бактериальных инфекций.
Ключевые слова: углеродные сорбенты, модификаторы, синтез, сорбционная терапия, микробиоценоз, тест-штаммы микроорганизмов.
The aim of the work is to study the antibacterial and antimycotic properties of carbon sorbents modified with biologically active substances in relation to pathogens of purulent-inflammatory diseases. Material and methods. The activity of modifier solutions and modified samples of carbon sorbents was studied in relation to test strains of opportunistic microorganisms in comparison with the initial sample of carbon sorbent. A suspension with a known content of microbial cells was prepared from test strains of microorganisms; it was incubated in wells with test samples for 48 hours. The survival of microorganisms was determined by quantitative inoculation from each well of the sample and microorganism mixture at regular intervals of incubation on Petri dishes with simple agar nutrient, then the number of viable microbial cells in the test mixture was counted. Results. Studies have shown high antibacterial and antimycotic activity of modified carbon sorbents. The best result in comparison with the initial sample was demonstrated by a carbon sorbent modified with lactic acid oligomers and immobilized lysozyme. Studies have shown the promise of using modified carbon sorbent samples for the application therapy in bacterial infections.
Keywords: carbon sorbents, modifiers, synthesis, sorption therapy, microbiocenosis, test strains of microorganisms.
Введение
В последнее десятилетие в медицине критических состояний исследуется эффективность использования сорбционной терапии — детоксика-ция организма с помощью перфузии биологической жидкости (крови, лимфы) через колонку с
© Коллектив авторов, 2020
*Адрес для корреспонденции: Е-шай: prof_dolgih@mail.ru
сорбентом, либо энтерального или аппликационного применения углеродных сорбентов [1]. Ге-мосорбенты, энтеросорбенты и вульнеросорбен-ты предназначены для удаления из организма эндогенных и экзогенных токсичных продуктов с одновременным повышением чувствительности организма к базисной фармакотерапии.
Основными методами лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями различной локализации является этиотропная и патоге-
нетическая терапия. Вместе с тем, антибактериальные препараты оказывают эффект по истечении длительного времени, негативно влияют на микробиоценоз, увеличивают число антибиоти-корезистентных микроорганизмов и оказывают побочное действие на организм. В этой связи для лечения больных с раневой инфекцией и тяжёлыми гнойно-септическими заболеваниями бактериальной природы необходимы новые подходы и препараты, отличающиеся по механизму действия от антибиотиков и обладающие высокой антимикробной и антимикотической активностью.
По нашему мнению, одним из приоритетных направлений сорбционной терапии является аппликационная сорбция — вульнеросорбция [2—4], сущность которой заключается в извлечении токсичных веществ, продуктов клеточной деградации, микробных клеток, бактериальных токсинов из ран при контакте сорбционного материала с раневой поверхностью. Сорбция раневого содержимого позволяет в короткие сроки уменьшить травматический или воспалительный отёк мягких тканей, улучшить микроциркуляцию в тканях, снизить количество микроорганизмов в ране в среднем в 100—1000 раз по сравнению с традиционными асептическими перевязочными материалами. Вульнеросорбция позволяет существенно улучшить исходы лечения травматических, гнойных и ожоговых ран, трофических язв и др. Широко используется внутриполостная сорбция при гнойно-воспалительных процессах: перитоните, абсцессах лёгких и печени [5, 6].
Углеродные сорбенты проявляют довольно высокую активность в отношении бактерий и их токсических продуктов, но нередко активны в отношении узкого спектра возбудителей. Повышение биоспецифических свойств возможно за счёт нанесения на поверхность сорбентов модификаторов — препаратов, проявляющих активность в отношении широкого спектра возбудителей, но не оказывающих отрицательного воздействия на организм. В качестве модификаторов применяются биологически активные вещества различной природы, обладающие антибактериальными и антимикотическими свойствами. Действие модифицированных сорбентов основано на совмещении адсорбционных свойств нанопористой углеродной матрицы и антибактериальных, анти-микотических свойств модификаторов.
В Центре новых химических технологий ФГБУН «Институт катализа им. Г. К. Борескова СО РАН» создан гранулированный сорбент на основе нанодисперсного углерода, обладающий высокой совместимостью с биологическими жидкостями и мезопористой структурой [7]. В Институте в течение последних лет ведутся исследования по созданию модифицированных углеродных сорбентов биологически активными
веществами (поливинилпирролидон, бетулин, молочная кислота, лизоцим и т. д.), обладающими антибактериальными и антимикотическими свойствами.
Цель исследования — изучить антибактериальные и антимикотические свойства углеродных сорбентов, модифицированных биологически активными веществами, в отношении возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний.
Материал и методы
Углеродный сорбент и его модифицированные образцы получены в Центре новых химических технологий Института катализа им. Г. К. Борескова СО РАН. В качестве модификаторов применяли поливинилпирролидон («Sigma-Aldrich», Германия), бетулин (ФГБУН Институт химии и химической технологии СО РАН, Красноярск), молочная кислота («Мосреак-тив», Россия), лизоцим (Sigma-Aldrich, Германия). Методика модифицирования углеродного сорбента (УМ) олигомерами молочной кислоты с иммобилизованным лизоцимом МК-Л-УМ включает пропитку сорбента раствором молочной кислоты с последующей термообработкой, активацию поверхностных функциональных (карбоксильных) групп и иммобилизацию лизоцима на поверхности сорбента [8]. Модифицирование углеродного сорбента поли-К-винилпирролидоном совместно с бетулином (Б-ПВП-УМ) проводили путём пропитки углеродного материала раствором бетулина в N-винилпирролидоне с последующей полимеризацией (инициатор полимеризации — динитрил азобисизомасляной кислоты, ДИНИЗ) и термообработкой модифицированного сорбента в инертной среде [9].
В исследование включено 7 образцов сорбентов: образец № 1 — исходный гранулированный немодифицированный углеродный сорбент ВНИИТУ-1 (УМ); образец № 2 — сорбент, модифицированный 80% раствором молочной кислоты (МК); образец № 3 — сорбент, модифицированный бетулином (Б); образец № 4 — сорбент, модифицированный поливинил-N-пирролидоном (ПВП); образец № 5 — сорбент, модифицированный раствором лизоцима в ацетатном буфере; образец № 6 — гранулированный сорбент, модифицированный поли-К-ви-нилпирролидоном с последующим нанесением бетулина (Б-ПВП-УМ); образец № 7 — сорбент, модифицированный молочной кислотой и лизоцимом (МК-Л-УМ).
В качестве тест-культур использовались следующие штаммы: Staphylococcus aureus АТСС 25923, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Klebsiella pneumoniae 418, Esherichia coli АТСС 25922 и ассоциация микроорганизмов — Candida albicans (клинический штамм) + Esherichia coli АТСС 25922. Выбор видов микроорганизмов обусловлен их наибольшей клинической значимостью в этиологии гнойно-воспалительных процессов, в том числе женской половой системы в соответствии с возможной сферой применения данных образцов. Состав тестируемой бактериально-грибковой ассоциации объясняется частой встречаемостью при рецидивирующем уроге-нитальном кандидозе.
Испытуемые образцы №№ 1—7 предварительно стерилизовали при 121°С в течение 20 мин. Для тестирования использовали суточные культуры, выращенные на простом питательном агаре. Эталонные штаммы были проверены на чистоту и отсутствие диссоциаций; клинический штамм C.albicans, выделенный из биоматериала от пациентки с урогенитальным кандидозом, верифицирован методом Maldi-Tof масс-спектрометрии (Vitec-MS). Суточную агаровую культуру исследуемых штаммов смывали стерильным физиологическим раствором, из полученной суспензии готовили взвеси микроорганизмов в концентрации 500 млн микробных тел в 1 мл раствора (0,5 МЕ по Мс Farland). Затем путём десятикратных разведений взвеси доводили до рабочей концентрации 106/мл микроб-
Рис. 1. Динамика снижения численности тест-микроорганизмов при испытании исходного образца.
ных тел. В лунки стерильного планшета помещали исследуемый образец, затем добавляли рабочую взвесь тест-культуры в количестве 2,0 мл до полного смачивания, ориентировочно 1:1. Смесь «образец — микроорганизм» тщательно перемешивали и инкубировали в термостате при температуре 37°С.
Выживаемость микроорганизмов определяли путём количественных высевов из каждой лунки смеси «образец — микроорганизм» через определённые промежутки времени термоста-тирования на чашки Петри с простым питательным агаром методом секторных посевов (Голда). На каждое сочетание «образец — микроорганизм» делали по три повторения параллельных высевов. Видовую принадлежность культур подтверждали результатами изучения культуральных, морфологических и биохимических свойств.
Первый высев (контроль) делали сразу после добавления образца в взвесь микроорганизмов без термостатирования, далее через 3 — 6 — 24 — 48 ч инкубации. После инкубации чашек с простым питательным агаром при 37°С в течение 24 ч регистрировали наличие или отсутствие роста и количество микробных клеток в 1 мл смеси.
Результаты исследования
В качестве контроля на первом этапе было проведено изучение антибактериальной активности исходного образца углеродного сорбента ВНИИТУ-1.
Динамика снижения концентрации используемых тест-штаммов микроорганизмов при инкубации с исходным немодифицмрованным сорбентом представлена на рис. 1. При исходной концентрации 106 КОЕ/мл уже через 3 ч инкубации отмечалось снижение микробной нагрузки различной степени по видам микроорганизмов, которое продолжалось в течение 6 ч, и затем при высеве через 24 ч во всех случаях отмечалось полное отсутствие роста микроорганизмов. При этом следует отметить более медленное снижение концентрации представителей Enterobacteriales в сравнении с другими тест-штаммами.
Далее было проведено изучение используемых растворов модификаторов в отношении той же линейки возбудителей в аналогичном опыте. Наибольшую активность проявил исследуемый
раствор молочной кислоты (образец № 2 — МК). Отмечалось полное отсутствие роста всех изученных тест-штаммов при высеве уже через 3 ч инкубации. Результаты исследования действия образцов № 3 и № 4 (бетулин и поли-М-винилпирро-лидон) представлены в таблице. Видно, как постепенно снижались концентрации S.aureus АТСС 25923, P.aeruginosa АТСС 27853, K.pneumo-niae 418 при инкубации с обоими образцами через 3 и 6 ч инкубации с полным исчезновением к 24 ч, что сопоставимо с активностью исходного образца немодифицированного углеродного сорбента. Вместе с тем, в смеси E.coli АТСС 25922 изолированно, а также в смеси E.coli + C.аlbicans микроорганизмы сохраняли жизнеспособность после инкубации с образцом № 4 через 24 ч инкубации, хотя и в минимальной концентрации, исчезая лишь через 48 ч. Образец № 3 существенно хуже действует на дрожжеподобные грибы рода C.albicans — отмечается сохранение жизнеспособных микроорганизмов даже через 48 ч.
Образец модификатора № 5 (раствор лизоци-ма в ацетатном буфере) показал ожидаемо высокую активность в отношении S.aureus АТСС 25923 — отсутствие роста наблюдалось уже через 6 ч инкубации. Также отмечалось отсутствие роста обоих микроорганизмов смеси E.coli + C.albi-cans через 3 ч. Остальные тест-штаммы подавлялись в течение 24 ч инкубации.
Результаты изучения модифицированных образцов сорбентов выявили следующее. Наиболее высокая антибактериальная/антимикотическая активность выявлена у образца № 7 — МК-Л-УМ: ни один из изученных штаммов микроорганизмов не был выявлен при высеве из смеси уже через 3 ч инкубации с образцом. Активность образца № 6 — Б-ПВП-УМ практически аналогична результатам испытания модификатора ПВП изолированно (см. таблицу) — отсутствие роста
Динамика изменения концентрации тест-штаммов микроорганизмов при инкубации с растворами модификаторов образцов № 3Б и № 4 ПВП
Тест-культуры 0 ч 3 ч 6 ч 24 ч 48 ч
№3 Б №4 ПВП №3 Б №4 ПВП №3 Б №4 ПВП №3 Б №4 ПВП №3 Б №4 ПВП
S.aureus АТСС 25923 106 106 106 104 104 104 Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет
P.aeruginosa АТСС 27853 106 106 105 105 103 102 Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет
K.pneumoniae 418 106 106 106 105 104 104 Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет
E.coli АТСС 25922 106 106 106 105 103 104 Роста нет 102 Роста нет Роста нет
Смесь C.albicabs/E.coli 106 106 105/105 105/105 103/102 102/103 102 /роста нет 102/102 102 /роста нет Роста нет/ роста нет
большинства тест-штаммов через 24 ч инкубации, E.coli изолированно и смеси E.coli + C.albicans — через 48 ч.
Наибольшая вариабельность при испытании модифицированных образцов выявлена в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida, что демонстрирует рис. 2. Наибольшая антимикотическая актив -ность выявлена у образца МК-Л-УМ — полное подавление роста через 3 ч; далее следует МК-УМ (6 ч). Образец Б-ПВП-УМ приводил к снижению концентрации C.albicans существенно медленнее, тем не менее через 48 ч рост уже не регистрировался.
Рис. 2. Антимикотическая активность модифицированных образцов сорбентов в отношении Candida albicans.
Заключение
Таким образом, проведённые исследования выявили высокую антибактериальную и антими-котическую активность углеродных сорбентов, модифицированных комплексами биологически активных веществ образцов, по отношению к наиболее распространённым условно-патогенным возбудителям гнойно-воспалительных заболеваний бактериальной и грибковой природы в сравнении с исходным немодифицированным образцом сорбента. Наибольшую антибактериальную и антимикотическую активностью проявил углеродный сорбент, модифицированный олигоме-рами молочной кислоты с иммобилизованным лизоцимом. Механизм биоспецифической активности в данном случае, вероятно, связан с комбинацией сорбционного действия исходного сорбента и создания кислой среды молочной кислотой, неблагоприятной для большинства тестируе-
мых возбудителей, в комплексе со специфической антимикробной активностью лизоцима.
Применение углеродных сорбентов, модифицированных олигомерами молочной кислоты с иммобилизованным лизоцимом и поливинилпир-ролидоном совместно с бетулином, представляется наиболее перспективным для аппликационной терапии гнойно-воспалительных инфекций женской половой сферы ввиду высокой эффективности in vitro в стендовых испытаниях, а также физиологичного для вагинального биотопа механизма действия, сходного с механизмами защитного действия нормальной микрофлоры и местных факторов естественной неспецифической защиты.
Работа выполнена в рамках государственного задания Института катализа СО РАН (проект АААА-А19-119050790074-9).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Долгих В.Т., Пьянова Л.Г, Лихолобов В.А., Долгих Т.И., Таран НИ, Хвостунцев С.М. Использование углеродных сорбентов при критических состояниях организма. Омский научный вестник. — 2015. — № 2. — С. 19-22. / Dolgikh V.T., Pyanova L.G., Likholobov V.A., Dolgikh T.I., Taran N.I., Khvostuntsev S.M. Use of carbon sorbents in critical states of organism. Omsky Nauchniy Vestnik 2015; 2: 19-22 [in Russian]
2. Ославский А.И. Сорбционные средства и методы в комплексном лечении гнойных ран (обзор литературы). Журнал Гродненского государственного медицинского университета. — 2016. — № 3. — С. 30-33. / Oslavsky A.I. Sorption Agents and Methods in Complex Treatment of Purulent Wounds (Literature Review). Zhurnal Grodnenskogo Gosudarstvennogo Meditsinskogo Universiteta 2016; 3: 30-33. [in Russian]
3. Баринов С.В., Долгих В.Т., Долгих Т.И., Баракина О.В, Пьянова Л.Г. Разработка и применение формованных углеродных сорбентов при лечении хронического эндометрита. Сибирский медицинский журнал (Иркутск). — 2014. — № 4. — С. 55-59. / Barinov S.V., Dolgikh V.T., Dolgikh T.I., Barakina O.V., Pyanova L.G. Development and application of molded carbon sorbents in the treatment of chronic endometritis. Sibirsky Meditsinsky Zhurnal (Irkutsk) 2014; 4: 55-59. [in Russian]
4. LevashovP.A., Afanasieva O.I., Dmitrieva O.A. etal. Preparation of affinity sorbents with immobilized synthetic ligands for therapeutic apheresis. Biochemistry 2010; 4: 3: 303-307.
5. Дибиров М.Д., Костюченко М.В., Елинсон В.М., Лямин А.Н.Энтеро-сорбционная и экстракорпоральная коррекция гомеостатических нарушений в лечении острой абдоминальной хирургической патологии, осложнённой эндотоксикозом. Фундаментальные исследования. — 2012. — № 1 — С. 39-42. / DibirovM.D., KostyuchenkoM.V., Elinson V.M., Lyamin A.N. Enterosorbational and extracorporeal correction of homeostatic disorders in the treatment of acute abdominal surgical pathology complicated by endotoxicosis. Fundamentalnie Issledovania 2012; 1: 39-42. [in Russian]
6. Долгих В.Т., Долгих Т.И., Пьянова Л.Г., Лихолобов В.А., Баринов С.В., Баракина О.В., Гриценко Н.С., Толкач А.Б. Антимикробная активность гранулированных углеродных сорбентов. Российский иммунологический журнал. — 2014. — Т. 8. — № 3. — С. 788-791. / Dolgikh V.T., Dolgikh T.I., Pyanova L.G., Likholobov V.A., Barinov S.V., Barakina O.V., Gritzenko N.S., Push A.B. Antimicrobial activity of granular carbon sorbents. Russiysky Immunologichesky Zhurnal 2014; 8: 788-791. [in Russian]
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Долгих Владимир Терентьевич — д. м. н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, главный научный сотрудник, Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В. А. Неговского, Москва
Пьянова Лидия Георгиевна — д. б. н., заведующая лабораторией синтеза функциональных углеродных материалов ЦНХТ ИК СО РАН, Омск. Author ID: 417502 Наумкина Елена Витальевна — д. м. н., заведующая бактериологической лабораторией, Городской клинический перинатальный центр, Омск; профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, Омский государственный медицинский университет, Омск. Author ID: 753166
7. Пьянова Л.Г, Бакланова О.Н., Лихолобов В.А. Исследование эффекта модифицирования поверхности углеродных сорбентов поли-N-винилпирролидоном комплексом физико-химических и микробиологических методов. Физикохимия поверхности и защита материалов. — 2013. — Т. 49, № 4. — С. 408-417. / Pyanova L.G., Baklanova O.N., Likholobov V.A. et al. Investigation of the effect of surface modification of carbon sorbents with poly-N-vinylpyrrolidone by a complex of physiochemical and microbiological methods. Physikokhimia Poverkhnosti i Zashchita Materialov 2013; 49: 4: 408-417. [in Russian]
8. Пьянова Л.Г, Лихолобов В.А., Дроздов В.А. и др. Синтез и физико-химические свойства биоспецифического углеродного сорбента, модифицированного олигомерами молочной кислоты. Физикохимия поверхности и защита материалов. — 2017. — Т.53. — № 4. — С. 368-374. / Pyanova L.G., Likholobov V.A., Drozdov V.A. et. dl. Synthesis and physicochemical properties of a biospecific carbon sorbent modified with lactic-acid oligomers. Physikokhimia Poverkhnosti I Zashchita Materialov 2017; 53: 4: 639-644. [in Russian]
9. Пьянова Л.Г., Дроздов В.А., Седанова А. В. и др. Синтез модифицированных углеродных сорбентов и исследование их антиоксидант-ных свойств. Физикохимия поверхности и защита материалов. — 2018. — Т. 54. — № 6. — С. 544-548. / Pyanova L.G, Drozdov V.A., SedanovaA.V. et. а1 Synthesis of Modified Carbon Sorbents and a Study of Their Antioxidant Properties. Physikokhimia Poverkhnosti i Zashchita Materialov 2018; 54: 6: 1010-1014. [in Russian]
Лавренов Александр Валентинович — д. х. н., директор ЦНХТ ИК СО РАН, Омск. Author ID: 363779
Матущенко Елена Валериевна — к. м. н., доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, Омский государственный медицинский университет, Омск. Author ID: 654129
Корниенко Наталья Викторовна — младший научный сотрудник лаборатории синтеза функциональных углеродных материалов ЦНХТ ИК СО РАН, Омск. Author ID: 741459
