CC BY
15УДК 632.937.14
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ TRICHODERMA ASPERELLUM -ПРОДУЦЕНТОВ МУЛЬТИКОНВЕРСИОННЫХ БИОПРЕПАРАТОВ
А.И. Богданов, Ю.А. Титова
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Приведены данные антагонистической активности штаммов Trichoderma asperellum - продуцентов мультиконверсионных биопрепаратов. Показана высокая антагонистическая активность штаммов-продуцентов T. asperellum T-32 и Т-36, выражающаяся в их полном паразитизме на таких возбудителях болезней растений, как Fusarium culmorum, F. oxysporum, Alternaria solani в лабораторных условиях, а также более высокая агрессивность по сравнению с коллекционными штаммами по отношению ко всем исследованным фитопатогенам. Длительное (более 18 месяцев) хранение мультиконверсионных биопрепаратов не снизило ни антагонистической активности, ни агрессивности жизнеспособных штаммов-продуцентов T. asperellum T-32 и Т-36 в отношении фитопатогенных микромицетов - возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.
Ключевые слова: антагонистическая активность, штаммы Trichoderma asperellum, мультиконверси-онные биопрепараты, штаммы-продуценты биопрепаратов.
Антагонистическая активность (АА) как одно из проявлений жизнедеятельности микроорганизмов выражается в способности одного вида за счет высоких ростовых и адаптационных возможностей, продукции антибиотических веществ подавлять или задерживать развитие других видов микробиоты (Егоров, 2004). Это свойство, обеспечиваемое различными молекулярными механизмами, обусловливает выживание микроорганизмов и особенности их взаимодействий в консорциях, когда АА доминант микробиоты регулируется ассо-циантами (Бухарин и др., 2006; Вахитов, 2007; Dubuis et а1., 2007; Иркитова и др., 2011). Антагонистические взаимодействия широко используют в практике защиты растений при разработке биопрепаратов (Новикова, 2005; Коломбет, 2006).
Особое положение в получении полифункциональных биофунгицидов занимают штаммы-продуценты (ШП) р. Trichoderma. Они обладают высокой АА (за счет выработки глио-токсина, виридина, триходермина, сацукацил-лина, аламетицина, дермадина и др.) и гиперпаразитической активностью в отношении болезней, возбудители которых локализуются в почве, повышают болезнеустойчивость растений, обладают ростстимулирующей активностью, влияя на эффективность утилизации азота, стимулируя рост бактерий р. Azotobacter и клубеньковых бактерий (Александрова и др., 2000; Винникова и др., 2004; Лихачев и др.,
2007; Войтка и др., 2011).
В последние 25 лет промышленные формы биопрепаратов на основе штаммов р. Trichoderma имеют весьма широкий спектр применения для контроля заболеваний растений в условиях открытого и защищенного грунтов (Новикова, 2005, 2007, 2010; Коломбет, 2006; КиЫсек et а1., 2008; Прищепа и др., 2011; Нагтап, 2011). Современные биопрепараты получают глубинно-поверхностной ферментацией и на основе мультибиоконверсии отходов техногенной сферы и сельского хозяйства (Коршунов и др., 2001; Титова и др., 2002 а,б,в, 2005; Заика, 2006). Имеются сведения о потере эффективности биопрепаратов на основе штаммов р. Trichoderma при длительном хранении за счет снижения титра и антагонистической активности продуцентов (Заика, 2006; Коломбет, 2006; Лихачев и др., 2007). В литературе не имеется сведений об изменении АА штаммов-продуцентов при длительном хранении мультиконверсионных биопрепаратов. Цель настоящего исследования - охарактеризовать АА штаммов T. asperellum - продуцентов мультиконверсионных биопрепаратов. Для достиженния поставленной цели решались задачи сравнительной оценки АА коллекционных и ШП мультиконверсионных биопрепаратов T. asperellum Т-32 и Т-36 после длительного хранения последних.
Методика
Работа проводилась на базе лаборатории микробиологической защиты растений ГНУ ВИЗР. В качестве объектов исследования использовали депонированные в коллекции ВИЗР, паспортизованные промышленные и коллекционные ШП
микробиологических мультиконверсионных препаратов T. asperellum T-32 и Т-36 и штаммы фитопатогенных и почвообитающих микромицетов комплекса ризосферы сельскохозяйственных растений Fusarium culmorum var. culmorum 538, F. oxysporum 923 и Alternaria solani 602-1. Промышленные ШП T. asperellum T-32 и Т-36 выделены из мультиконверсионных биопрепаратов после 18 месяцев хранения на основе отдельно и последовательно переработанных Lentinus edodes (Berk.) Sing. и Pleurotus ostreatus (Jacq:Fr.) Kumm НК-35 отходов техногенной сферы: опилки дубовые, отруби пшеничные - 10 %, или лузга гречихи и подсолнечника (1:1), опилки смешанные -7%, СаСОз - 0.1%, CaSO4x7H2Ü - 1% по весу 70% влажности субстрата.
Для лабораторных опытов in vitro использовали стандартную агаризованную синтетическую среду Чапека с
исследований
режимом стерилизации 30 мин. при 0.5-0.8 атм вследствие содержания в ней сахара в низкомолекулярной форме. Для подавления роста бактерий применяли стрептомицин-сульфат - 0.2 г/л (Методы..., 1982).
Методы определения антагонистической активности условно делят на две группы: in vitro и in situ (Comporota, 1985; Howell et al., 1993; Алимова, 2005, 2006). В данной работе использовали методы in vitro: встречных культур и отсроченного антагонизма (Егоров, 1976; Титова, 2000; Блинкова, 2003; Постникова и др., 2004). Повторность опытов десятикратная. Регистрацию данных опытов производили в динамике в течение 3-10 суток после образования зоны контакта. Характеристика типов взаимоотношений изучаемых микромицетов приведена в соответствии с классификацией взаимодействий мицелиев, разработанной на основе качественных параметров: наличия границы между колониями; переплетения гиф с образованием и без такового мицелиального валика различной структуры, текстуры, размера и плотности; пигментации зоны контакта; наличия зоны отталкивания или барража; ускорения, замедления или остановки роста колонии (Титова, 2000).
Результаты исследований
Особенности АА T. asperellum Т-32 и Т-36 в от- F. oxysporum 923 и A. solani 602-1 представлены на
ношении фитоштогенов F. culmorum
рисунках 1.2.
\ ** '
и к л м
Рис. 1. Полный паразитизм штаммов T. asperellum Т-32, выделенных из мультиконверсионных биопрепаратов шиитачного (а, д, и); вешеночного (б, е, к); шиитачно-вешеночного (в,ж,л), и коллекционного (г,з,м) по отношению к F. си1тогит 538 (а-г), F. охургит 923 (д-з) (5-е сутки совместного культивирования), Л solani 602-1 (и-м)
(10-е сутки совместного культивирования)
б
е
и
л
м
Рис. 2. Полный паразитизм штаммов T. asperellum Т-36, выделенных из мультиконверсионных биопрепаратов шии-тачного (а, д, и); вешеночного (б, е, к); шиитачно-вешеночного (в, ж, л), и коллекционного (г, з, м) по отношению к F. cuhnorшn 538 (а-г), F. вхуярагит 923 (д-з) (5-е сутки совместного культивирования), Л. solani 602-1 (и-м) (10-е сутки совместного культивирования)
Срастание колоний микромицетов в первом взаимодействии происходило с образованием высокого, узкого и рыхлого мицелиального валика. Наблюдали изменение окраски колоний F. сшЫвгит 538 в зоне нарастания на последние ШП Т. а&регвПит Т-32 и Т-36 с розового на оранжево-желтый. Мицелиальные валики в динамике резорбировались под мицелием ШП, активно распространяющимся поверх и вглубь колоний F. сшЫвгит 538. К 10-м суткам совместного культивирования развитие тест-объекта прекратилось, наблюдали массовое спороношение штаммов Т. а"реге11ит Т-32 и Т-36 на всей площади чашки Петри, в том числе на гифах мицелия F. сшЫвгит 538.
Срастание колоний Т. а"реге11ит Т-32 и Т-36 и фитопатогена F. вху"рвгит 923 происходило без образования мицелиального валика, а в некоторых случаях на 7-10 сутки контакта
колоний - с узкой зоной неполного барража со стороны F. вхуьрвгит 923. С 3-х суток совместного роста наблюдали проявление сначала неполного, а затем и полного паразитизма ШП по отношению к F. вху"рвгит 923: Т. а"реге11ит Т-32 и Т-36 в зоне контакта сразу нарастали на побуревшие колонии тест-объекта. Мицелий ШП активно распространялся поверх и вглубь колоний F. вху"рвгит 923. К 10-м суткам роста развитие тест-объекта полностью прекратилось, наблюдали массовое спороношение штаммов Т. а"реге11ит Т-32 и Т-36 на всей площади чашки Петри, в том числе на гифах мицелия F. вху"рвгит 923.
Аналогично шло срастание Т. а&реге1-1ит Т-32 и Т-36 и Л. "в1ап1 602-1. Причем при оценке АА с этим тест-объектом применяли метод отсроченного антагонизма. Срастание колоний микромицетов происходило без обра-
к
Вестник защиты растений, 1, 2014 зования мицелиального валика и зоны барража. Изменений цвета колоний тест-объекта в данном случае не фиксировали, по-видимому, из-за первоначальной практически черной окраски субстратного мицелия и реверса, а также темно-бурой окраски воздушного мицелия Л. &'в1ап1 602-1. Даже преимущества в развитии штамма Л. &'о1ат 602-1 не обеспечили ему конкурентоспособности: на 3-и сутки совместного культивирования наблюдали остановку роста тест-объекта, на 5-е сутки - нарастание колоний Т а8регеШт Т-32 и Т-36 на колонии Л. &'о1ап1 602-1, на 10-е сутки - гибель тест-объекта и обильное спороношение Т.
а&регеИит Т-32 и Т-36 на колонии последнего.
То есть с 3-х суток совместного роста (5-е сутки развития тест-объекта) наблюдали проявление сначала неполного, а затем и полного паразитизма штаммов-продуцентов по отношению к штамму Л. &'о1апг 602-1. Обращает на себя внимание более высокая агрессивность штаммов-продуцентов мультиконверсионных биопрепаратов по сравнению с коллекционными штаммами, уже с 3-х суток совместного роста наблюдали проявление сначала неполного, а затем и полного паразитизма ШП по отношению ко всем включенным в работу тест-объектам (рис. 1, 2).
Заключение
В результате проведенных исследований показана высокая АА Т. а8регеШт Т-32 и Т-36, выражающаяся в их полном паразитизме (Титова, 2000) на тест-объектах в лабораторных условиях: гибели F. си1тогит, F. оху&рогит, Л. &'о1апг как одного из участников взаимодействия и развитии ШП на площади субстрата и на мицелии подавленного организма. ШП мультиконверсионных биопрепаратов Т. а&регвПит Т-32 и Т-36 выявили большую агрессивность по сравнению с коллекционными штаммами по отношению ко всем исследованным фитопатогенам сельскохозяйст-
венных культур: полный паразитизм на тест-объектах выявили на 3-и сутки ШП мульти-конверсионных биопрепаратов, коллекционные штаммы Т. а8регеШт Т-32 и Т-36 - лишь на 5-е сутки после срастания колоний. Длительное (более 18 месяцев) хранение мульти-конверсионных биопрепаратов не снизило ни антагонистической активности, ни агрессивности жизнеспособных штаммов -продуцентов Т. а&регеИит Т-32 и Т-36 в отношении фитопатогенных микромицетов -возбудителей болезней сельскохозяйственных культур.
Литература
Александрова А.В., Великанов Л.Л. Влияние гриба Trichoderma harzianum на почвенные микромицеты // Ми-кол. и фитопатол., 2000, 34, 3, с. 68-77.
Алимова Ф.К. Trichoderma/Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales): таксономия и распространение. Казань, Издательский центр КГУ им. В.И.Ульянова-Ленина, 2005, 264 с.
Алимова Ф.К. Некоторые вопросы применения препаратов на основе грибов рода Trichoderma в сельском хозяйстве // «АГРО ХХ1». Научно-практический журнал, 2006, 4-6, с. 18-21.
Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журн. микробиол.,
2003, 3, с. 109-113.
Бухарин О.В., Валышев А.В., Гильмутдинова Ф.Г., Черкасов С.В. Экология микроорганизмов человека. Екатеринбург, УрО РАН, 2006, 546 с.
Вахитов Т.Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях. Автореф. докт. дисс., СПб, 2007, 42 с.
Винникова О.И., Жалнина Е.В. Антибиотическая активность грибов рода Trichoderma // Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем. Белгород,
2004, с. 32-33.
Войтка Д.В., Прищепа Л.И., Микульская Н.И. Основные итоги исследований в области микробиологической защиты растений от вредителей и болезней в Беларуси (1976-2010) // Земляробства \ ахова раслш, 2011, 76, 3, с. 45-47.
Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. М., МГУ, 1976, 307 с.
Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М., Наука, 2004, 503 с. Библ. с. 503-528.
Заика Н.А. Эколого-биологическое обоснование скрининга грибов рода Тпско^гта для получения и использования биопрепаратов на растительных субстратах. Авто-реф. канд. дисс. Красноярск, 2006, 17 с.
Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Сергеева И.Я. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. 3. Антагонистическая активность. // Сб. науч. тр. СибНИИС СО РАСХН, «Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока», Барнаул, 2011, 8, с. 216-222.
Коломбет Л.В. Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней. Автореф. докт. дисс., М., МГУ, 2006, 40 с.
Коршунов Д.В., Бурень В.М., Титова Ю.А. Двуста-дийная биоконверсия отходов сельского хозяйства и про-
мышленности с получением урожая съедобных грибов вешенка и биопрепарата Триходермин для защиты растений // Тез. Всеросс. конф. молодых ученых. Санкт-Петербург, 8-12 апреля. СПб, 2001, с. 36.
Лихачев А.Н., Садыкова В.С. Установление комплекса признаков-тестов по отбору антагонистов для биоконтроля фитопатогенов (на примере грибов рода Trichoderma) // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты, 2007, 16, с. 33-47, 228 с.
Методы экспериментальной микологии: Справочник. Под ред. В.Н.Билай. Киев, Наук. думка, 1982, 550 с.
Новикова И.И. Биологическое обоснование создания и применения полифункциональных биопрепаратов на основе микробов-антагонистов для фитосанитарной оптимизации агроэкосистем. Автореф. докт. дисс., СПб, 2005, 40 с.
Новикова И.И. Полифункциональные биопрепараты на основе микробов-антагонистов-основа экологически безопасной системы защиты растений от болезней // Ин-формац. бюлл. ВПРС МОББ, 2007, 38, с. 173-175.
Новикова И.И. Полифункциональные биопрепараты в современных системах фитосанитарной стабилизации аг-роценозов // Современ. средства и технол. защиты основных с.-х. культур от вредителей, болезней и сорной растительности. С-Петербург, хим. форум: Программа (19-21 мая 2010 г. ВК ЛЕНЭКСПО). СПб, 2010, с. 49-50.
Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафар-ская Л.И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // Журн. микробиол., 2004, 2, с. 64-69.
Прищепа И.А., Колядко Н.Н., Попов Ф.А., Долматов Д.А., Волчкевич И.Г., Вабищевич В.В. О приоритетных направлениях в защите овощных культур от вредных организмов // Земляробства i ахова раслш, 2011, 76, 3, с. 51-56.
Титова Ю.А. Биологические основы борьбы с грибными болезнями шампиньонов. Автореф. канд. дисс., СПб,
2000, 20 с.
Титова Ю.А., Гасич Е.Л., Новикова И.И., Хлопунова Л.Б., Коршунов Д.В., Губарева А.В., Полетаева М.С., Семенович А.С. Биоконверсия отходов съедобными грибами с получением биопрепаратов // Научно-практич. конф. "Грибоводство и смежные биотехнологии. Инновации для инвестиций". М., 2005, с. 19-21.
Титова Ю.А., Новикова И.И., Хлопунова Л.Б., Коршунов Д.В. Триходермин на основе вторичной биоконверсии отходов и его эффективность против болезней огурца // Микол. и фитопатол., 2002а, 36, 4, с. 76-80.
Титова Ю.А., Хлопунова Л.Б., Коршунов Д.В. Вешен-ка и триходермин на одном субстрате // Современная микология в России. Первый съезд микологов России. Тез. докладов. М., 2002б, с. 288.
Титова Ю.А., Хлопунова Л.Б., Коршунов Д.В. Двух-этапная биоконверсия отходов с помощью Pleurotus ostreatus и Trichoderma harzianum // Микол. и фитопатол., 2002в, 36, 5, с. 64-70.
Comporota A. Antagonisme in vitro de Trichoderma spp. vis-a-vis de Rhizoctonia solani Kuhn. // Agronomie, 1985, 5, p. 613-620.
Dubuis C., Haas D. Cross-speties GacA-controlled indu^ tion of antibiosis in Pseudomonads // Appl. Environ. Mia-obiol., 2007, 73, 21, p. 650-654.
Harman G E. Trichoderma - not just for b^onted anymore // Springer Science + Business Media B.V., 2011, p. 103-108.
Howell C.R., Stipanovk R D., Lumsden R.D. Antibiotk produrtion by strains of Gliocladium virens and its relation to the b^on^ol of TOtton seedling diseases // B^onted Sri. Te^nol., 1993, 3, p. 435-440.
Kubkek C.P., Komon-Zelazowska M., Druzhinina I.S. Fungal genus Hypocrea/Trichoderma: from barcodes to biodiversity // J. Zhejiang Univ. Sri. B., 2008, p. 753-763.
ANTAGONISTIC ACTIVITY OF TRICHODERMA ASPERELLUM STRAINS -MULTIREC YCLING BIOFORMULATION PRODUCERS A.I.Bogdanov, Yu.A.Titova Data on antagonistic activity of Trichoderma asperellum strains - multirecycling bioformulations' producers are provided in research. High antagonistic activity in vitro of T. asperellum T-32 and T-36 strain-producers is shown expressing their comprehensive parasitism on such causing agents of plants diseases as Fusarium culmorum, F. oxysporum and Alternaria solani, performing higher aggressiveness to all studied crop phytopathogens in comparison with collection strains. Long term (more than 18 months) storage of multirecycling bioformulations lowered neither antagonistic activity, nor aggressiveness of viable T. asperellum T-32 and T-36 strain-producers to phytopathogenic micromycetes - causing agents of crop diseases.
Keywords: antagonistic activity, Trichoderma asperellum strains, multirecycling bioformulations, bioformulations' strains-producers.
А.И.Богданов, аспирант, [email protected] Ю.А.Титова, к.б.н., [email protected]
