CC BY
13УДК 632.937.14:577.121
ОСОБЕННОСТИ БИОКОНВЕРСИИ КОМПОНЕНТОВ РАСТИТЕЛЬНЫХ СУБСТРАТОВ ШТАММАМИ-ПРОДУЦЕНТАМИ БИОПРЕПАРАТОВ
Ю.А. Титова, В.В. Долгих, А.И. Богданов
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Проведена оценка содержания лигнина, целлюлозы и белков на всех этапах стерилизации автоклавиро-ванием при 132°С мультиконвертированных съедобными макромицетами Lentinula edodes (Berk.) Pegler (шии-таке), Pleurotus ostreatus (Jacq:Fr.) Kumm НК-35 (вешенка), Agaricus bisporus (Lange) Imbach Х-22 (шампиньон) и далее коллекционными штаммами Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf. et Nirenberg Т-32 и Т-36 субстратах.
Наиболее активная трансформация происходила в репродуктивную стадию каждого из конвертантов: биоконверсия L. edodes - небольшое количество низкомолекулярных белков, снижение содержания лигнина и достоверное - целлюлозы в 1.1 и 1.5 раза, соответственно, вторичная биоконверсия P. ostreatus HK-35 - самое малое количество низкомолекулярных белков, достоверное снижение содержания лигнина и целлюлозы в 1.5 и 2.2 раза относительно содержания в исходном интактном субстрате.
Исследования проведены в цикле работ по разработке биопрепаратов для защиты растений.
Ключевые слова: биоконверсия белков, биоконверсия полисахаридов, мажорные компоненты субстрата, штаммы Trichoderma asperellum, мультиконверсионные биопрепараты.
Биоконверсия - процесс превращения веществ с участием живых организмов (ВП-П8-2322, 2012) и поскольку при биоконверсии происходит, в частности, превращение органических отходов в полезные для использования в народном хозяйстве продукты - это одно из важнейших направлений безотходных ресурсосберегающих биотехнологий. Биоконверсия решает одновременно производственные и природоохранные задачи, а также включается в цикл исследований по разработке биопрепаратов для защите растений (Титова, 1998,2013; Тишенков, 2005).
На основе паспортизованных высокоактивных штаммов Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf. et Nirenberg Т-32 и Т-36, хранящихся в коллекции микроорганизмов ВИЗР, разработаны с использованием мультиконвертированных отходов сельского хозяйства и деревоперерабатыва-ющей промышленности новые полифункциональ-
Методика
Работу проводили на базе лаборатории микробиологической защиты растений ВИЗР. В качестве объектов исследования использовали стерилизованные автоклавиро-ванием при 132°С образцы интактных отходов техногенной сферы: опилки дубовые, отруби пшеничные - 10% для Lentinula edodes (Berk.) Pegler (шии-таке), лузга гречихи и подсолнечника (1:1), опилки смешанные - 7% для Pleurotus ostreatus (Jacq:Fr.) Kumm НК-35 (вешенки), CaCO3 -0.1%, CaSO4x7H2O - 1% по весу 70% влажности субстрата, и мультиконвертированных съедобными макромице-тами L. edodes, P. ostreatus НК-35, Agaricus bisporus (Lange) Imbach Х-22 (шампиньон) и коллекционными штаммами T. asperellum T-32 и Т-36 субстратов. В образцах разных стадий мультибиоконверсии определяли наличие и количественное содержание мажорных компо-
ные биопрепараты для защиты растений (Коршунов и др., 2001; Титова и др., 2002,2013).
В литературе практически отсутствуют сведения о механизмах и путях трансформации мажорных компонентов (полисахаридов и белков) субстратов в процессе многоступенчатой биоконверсии. Цель исследования - охарактеризовать особенности биоконверсии мажорных компонентов субстратов штаммами T. asperellum Т-32 и Т-36 - продуцентами мультиконверсионных биопрепаратов. Для достижения поставленной цели решали задачи получения образцов муль-тиконвертированных субстратов, выявления количественных показателей их мажорных компонентов, характеристики особенностей и сравнения путей трансформации полисахаридов и белков различных субстратов в процессе многоступенчатой биоконверсии различными конвертан-тами.
исследований
нентов - лигнина, целлюлозы и белков методами Комарова с 72% серной кислотой, Кюрщнера и Ганека с азотной кислотой, электрофореза в полиакриламидном геле с до-децилсульфатом натрия и 12% Трис-глицин буфером (12% Tris-glycine SDS-PAGE analysis), соответственно (Комаров, 1934; Laemmly, 1970; Кюршнер и др., 1974). При определении содержания целлюлозы и лигнина в процентах от веса исходного субстрата принимали, что содержание золы в образцах остается постоянным. Расчет содержания мажорного компонента производили по формуле: С= 100mi/(mо-mо)p, где р- влажность образца субстрата, mi- масса искомого биополимера (целлюлоза, лигнин), m,,- общая масса образца субстрата (Оболенская и др., 1955). Контролем служили неконвертированные субстраты после стерилизации. Пробы белков для проведе-
Вестник защиты растений, 3, 2014 ния электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГЭ) смешивали с равным объемом 125 мМ Трис-HCl буфера, содержащего 4% ДСН, 10% 2-меркаптоэтанол (2-МЭ), 20% глицерин и инкубировали в течение 10 мин при 95°C. Белки разделяли с помощью стандартного метода (Laemmly, 1970) в 12% ПААГ с использованием камеры Mini-PROTEAN® (BioRad, США) и окрашивали с помощью красителя Кумасси R-250. В качестве стандартов молекулярного веса белков использовали набор маркеров от 13 до 116 кДа (Fermentas, Литва).
Для решения задач получения образцов мультикон-
Результаты
Наблюдали эффективную первичную конверсию интактных субстратов съедобными мак-ромицетами L. edodes и P. ostreatus НК-35 - про-низывание мицелием и формирование уплотненных началом переходной стадии мицелиальных блоков, далее морфогенез и рост базидиом. Последовательная мультибиоконверсия P. ostrea-tus НК-35, A. bisporus Х-22 и далее штаммами-продуцентами T. asperellum T-32 и Т-36, отработанных шии-таке (L. edodes) субстратов, также была эффективной и сопровождалась наполнением последних мицелием и примордиями макро-мицетов, мицелием и спороношением микро-мицетов.
В образцах конвертируемых субстратов на разных этапах биоконверсии определяли количественные характеристики трансформации мажорных компонентов -лигнина, целлюлозы и общего белка.
Можно отметить, что утилизация лигнина и целлюлозы на первом и втором этапах биоконверсии шии-таке и вешенкой субстрата проходила весьма активно: количество лигнина достоверно уменьшилось в 1.3 раза, целлюлозы -1.5 раза по сравнению с их количеством в интактном субстрате для L. edodes (рис.). Причем утилизация вешенкой оставшегося после биоконверсии шии-таке лигнина сопряжена с метаболизмом большего количества целлюлозы. Соотношение лигнина и целлюлозы в субстратах при мульти-биоконверсии штаммами T. asperellum T-32 и T-36 сохранялось. Кроме того, относительные количества этих полисахаридных компонентов в процессе развития на конверсионных субстратах микромицетов не уменьшились и остались, практически, на уровне исходных значений. Это свидетельствует о том, что, по крайней мере, лигнин мультиконверсионных субстратов не был вовлечен в метаболические процессы вегетативной и репродуктивной стадий развития
вертированных субстратов, выявления количественных показателей их мажорных компонентов, характеристики особенностей и сравнения путей их трансформации в процессе многоступенчатой биоконверсии различными кон-вертантами применяли методы Комарова, Кюрщнера и Ганека, электрофореза белков в денатурирующих условиях (SDS-PAGE analysis). Характеристика особенностей биоконверсии мажорных компонентов субстратов штаммами T. asperellum Т-32 и Т-36 выявила их активную трансформацию не только последними, но и предыдущими конвертантами.
исследований
T. asperellum T-32 и T-36, а целлюлоза - лишь на 2%.
Рост и развитие штаммов-продуцентов биопрепаратов для защиты растений T. asperellum T-32 и T-36 на мультиконверсионных субстратах происходили за счет утилизации грибного белка макромицетов и легкоусваиваемых растворимых продуктов метаболизма последних.
Как следует из данных фореграммы, во всех образцах различных этапов биоконверсии присутствуют небольшие количества низкомолекулярных белков и пептидов с массами порядка 1418 kDa, хотя наличие высокомолекулярных белков прослеживается на макроуровне при развитии на субстратах различных организмов -L. edodes, P. ostreatus HK-35, A. bisporus Х-22, T. asperellum T-32, T. asperellum Т-36 (рис.).
Полученные данные свидетельствуют о биоконверсии и трансформации высокомолекулярных белков предыдущего конвертанта последующим, строящим свой порядок и структуру на каждом этапе колонизации субстрата. Особенности технологии промышленного культивирования съедобных грибов включают высокотемпературную обработку субстратов для их стерилизации и денатурации трудноусваиваемых биополимеров, для перевода их олигомеров в растворимую легко утилизируемую мицелием форму, в связи с осмотрофным питанием макро- и микро-мицетов (Бисько и др., 1983, 1987; Дудка и др., 1992). Поэтому даже в пробах интактных субстратов невозможно обнаружить высокомолекулярные белки, а только их низкомолекулярные олигомеры. Высокотемпературная обработка на каждом этапе мультибиоконверсии приводила и к денатурации полипептидов, и к образованию последними комплексов с высокомолекулярными полисахаридами субстрата, обусловливающими значительные их остаточные количества на последних изученных стадиях биоконверсии (рис.).
Рис.. Изменение (%) относительных количеств лигнина и целлюлозы при последовательном развитии макро- и мик-ромицетов на мультиконверсионных субстратах: а- мультибиоконверсия субстрата, дважды конвертированного Ь. есЫЬев и Р. ояХтваХик НК-35 с помощью Т. а$рвгв11ит Т-32; б- мультибиоконверсия субстрата, дважды конвертированного Ь. edodes и Р. о$1тваШ$ НК-35 с помощью Т. asperellum Т-36.
"ИС Le" - интактный субстрат для Ь. edodes, "10-е Ье" - 10-е сутки роста Ь. edodes, "30-е Ье" - 30-е сутки роста Ь. edodes, "ПС Ье" - переходная стадия Ь. edodes, "РС Ье" - репродуктивная стадия Ь. edodes, "КС Ье" - исходный (конверсионный после Ь. edodes) субстрат, "10-е Ро" - 10-е сутки роста Р. ostreatus НК-35, "30-е Ро" - 30-е сутки роста Р. ostreatus НК-35, "ПС Ро" - переходная стадия Р. ostreatus НК-35, "РС Ро" - репродуктивная стадия Р. ostreatus НК-35, "МКС Ье Ро" - мультиконверсионный субстрат после Ь. edodes и Р. ostreatus НК-35, "ВС Т-32" - вегетативная стадия Т. asperellum Т-32, "ВС Т-36" -вегетативная стадия Т. asperellum Т-36, "РС Т-32" - репродуктивная стадия Т. asperellum Т-32, "РС Т-36" -репродуктивная стадия Т. asperellum Т-36.
Свободные высокомолекулярные белки утилизировались сменяющими друг друга конвер-тантами (на 100 г мицелия + базидиомы/споры приходится 3 г белков), а мультиконверсионные субстраты обогащались аминокислотами, витаминами, биологически активными веществами, и содержали незначительные количества низкомолекулярных пептидов (Билай и др., 1991; Кушнир и др., 1991; Тишенков, 2005).
Таким образом, мажорные компоненты - полисахариды (лигнин и целлюлоза) и белки - активно метаболизируются на всех этапах биоконверсии субстратов от исходных отходов техногенной сферы, технологически подготовленных для культивирования съедобных макромицетов Ь. edodes и Р. ostтeatus НК-35, до образцов муль-тиконверсионных биопрепаратов на основе штаммов Т. aspeтellum Т-32 и Т-36.
Характеристика особенностей биокон-
версии мажорных компонентов субстратов штаммами Т. aspeтellum Т-32 и Т-36 - продуцентами мультиконверсионных биопрепаратов выявила их активную трансформацию не только последними, но и предыдущими конвертантами, метаболизировавшими сложные полимеры отходов техногенной сферы до легко усваиваемых штаммами-продуцентами веществ. Наиболее активная трансформация происходила в репродуктивной стадии каждого из конвертантов: биоконверсия Ь. edodes - небольшое количество низкомолекулярных белков, снижение содержания лигнина и достоверное целлюлозы в 1.1 и 1.5 раза, соответственно, вторичная биоконверсия Р. ostтeatus НК-35 - самое малое количество низкомолекулярных белков, достоверное снижение содержания лигнина и целлюлозы в 1.5 и 2.2 раза, относительно содержания в исходном интактном субстрате.
Литература
Билай В.Т., Бисько Н.А., Володина Е.П., Дудка И.А. Разработка научных основ поверхностного культивирования грибов рода вешенка // Пробл. культивирования съедобных грибов в СССР, Пущино, 1991, с. 3 35.
Бисько Н.А., Бухало А.С., Вассер С.П. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре. Киев, Наук. думка, 1983, 312 с.
Бисько Н.А., Дудка И.А. Биология и культивирование съедобных грибов рода вешенка. Киев, Наукдутмка, 1987, 148 с.
Дудка И.А., Бисько Н.А., Билай В.Т. Культивирование съедобных грибов. Киев, Урожай, 1992, 160 с.
Комаров Ф.П. Руководство к лабораторным работам по химии древесины и целлюлозы. М., Гослестехиздат, 1934, 56 с.
Коршунов Д.В., Бурень В.М., Титова Ю.А. Двуста-дийная биоконверсия отходов сельского хозяйства и про-
мышленности с получением урожая съедобных грибов вешенка и биопрепарата Триходермин для защиты растений // Тез. Всерос. конф. молодых ученых (8-12 апреля 2001 г.). СПб, 2001, с. 36.
Кушнир С.Н., Дворнина А.А., Кимовецкий Н.Н. Новая технология интенсивной культуры вешенки обыкновенной // Пробл. культивирования съедобных грибов в СССР, Пущино, 1991, с. 35-36.
Кюршнер М., Ганек Н. Определение содержания клетчатки в растительных остатках // Методы биохимических анализов. М., Наука, 1974, с. -17.
Оболенская А.В., Щеголев В.П., Аким Г.А. Практические работы по химии древесины и целлюлозы. М., Лесн. пром-ть, 1955, 246 с.
Титова Ю.А. Утилизация отходов сельскохозяйственного производства и пищевой промышленности съедоб-
Вестник защиты растений, 3, 2014 ными грибами - путь к ресурсосберегающей технологии // Тез. докл. междунар. науч.-техн. конф. «Ресурсосберегающие технологии пищевых производств» (12-14 апреля 1998 г.). СПб, 1998, с. 146.
Титова Ю.А., Новикова И.И., Хлопунова Л.Б., Коршунов Д.В. Триходермин на основе вторичной биоконверсии отходов и его эффективность против болезней огурца // Микол. и фитопатол., 2002, 36, 4, с. 76-80.
Титова Ю.А., Хлопунова Л.Б., Коршунов Д.В. Двух-этапная биоконверсия отходов с помощью Р1еигоШ оя-1гваХш и Trichoderma Напгапыш // Микол. и фитопатол., 2002, 36, 5, с. 64-70.
Титова Ю.А. Методология получения мультиконвер-сионных биопрепаратов для защиты растений // Сб. науч. тр. III Всероссийского съезда по защите растений «Фито-санитарная оптимизация агроэкосистем». ВИЗР, СПб,
2013, 2, с. 396-400.
Титова Ю.А., Богданов А.И. Эффективность мульти-конверсионных биопрепаратов на основе штаммов Trichoderma harzianum // Сб. науч. тр. III Всероссийского съезда по защите растений «Фитосанитарная оптимизация агроэкосистем». ВИЗР, СПб, 2013, 2, с. 400-404.
Тишенков А.Д. Теория и практика ферментации субстрата для культивирования вешенки // Школа грибоводства, 2005, 2, 32, с. 23-26.
ВП-П8-2322. Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года" (утв. Правительством РФ 24.04.2012 № 1853п-П8) http://www.consultant.ru/law/ref/ju_dict/word/biokonversiya/ Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 // Nature, 1970, 227, p. 680 -685.
BIO-RECYCLING OF PLANT SUBSTRATE COMPONENTS BY STRAIN-PRODUCERS
OF BIOFORMULATIONS J.A.Titova, V.V.Dolgikh, A.I.Bogdanov The quantitative assessment of lignin, cellulose and proteins was carried out at all stages of sterilization of Lentinula edodes (Berk.) Pegler, Pleurotus ostreatus (Jacq:Fr.) Kumm NK-35, Agaricus bisporus (Lange) Imbach X-22 and collection strains of Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf. et Nirenberg T-32 and T-36. The most active transformation happened in reproductive stage: L. edodes bioconversion - a small amount of low-molecular proteins, decrease of lignin and cellulose by 1.1 and 1.5 times, respectively; secondary bioconversion of P. ostreatus HK-35 - the smallest amount of low-molecular proteins, reliable decrease of lignin and cellulose by 1.5 and 2.2 times against their contents in an initial intact substratum.
Keywords: bioconversion. protein, polysaccharide, major component of substratum, Trichoderma asperellum strain, multi-conversion, biological preparation.
Ю.А.Титова, к.б.н., [email protected] В.В.Долгих, к.б.н. [email protected] А.И.Богданов, аспирант, [email protected]
