CC BY
82
УДК 579.61
Гладышева И.В.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделенения Российской академии наук, Оренбург E-mail: GladishevaIV@yandex.ru
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ КОРИНЕБАКТЕРИЙ
Исследована антагонистическая активность микроорганизмов рода СогупеЬа&егшт spp., выделенных из репродуктивного тракта здоровых женщин и женщин с микроэкологическими нарушениями. Выявлено наличие антагонистической активности у всех штаммов, участвующих в исследовании. Установлена выраженность антагонистической активности и лизоцимной активности у штаммов коринебактерий в зависимости от микроэкологического состояния.
Ключевые слова: коринебактерии, антагонизм, лизоцимная активность, вагинальный микробиоценоз.
Микроорганизмы рода СотупвЬао1вт1ит зрр. - разнообразная группа грамположитель-ных бактерий, занимающих различные биотопы тела человека. Являясь частью единой микроэкологической системы человека, коринебактерии находятся в тесном взаимоотношении как с представителями резидентной микрофлоры, так и с условно-патогенными микроорганизмами, населяющими различные биотопы тела человека, и играют неотъемлемую роль в формировании микробиоценозов. Результирующей этих взаимодействий может явиться формирование нормо- или патоцено-зов. В вагинальном биотопе коринебактерии занимают второе место по частоте встречаемости после лактобактерий [4]. По мнению ряда исследователей, данные микроорганизмы играют важную роль в поддержании колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин [1]. Так, коринебактерии, благодаря наличию ингибиторов каталазы, подавляют антиоксидантную систему защиты ал-лохтонных микроорганизмов, увеличивая повреждающий эффект активных форм кислорода, тем самым влияя на их выживание и численность в микробиоценозе [2]. Этот эффект является одним из механизмов межбактериальных взаимодействий, определяющих формирование микробиоценозов.
Важным свойством для представителей резидентной микрофлоры, участвующих в реализации колонизационной резистентности, является собственная антагонистическая активность.
Антагонистическая активность коринебак-терий помимо ингибиторов каталазы обусловлена продукцией бактериоцинов и бактерио-цинподобных веществ, органических кислот, лизоцима [9], [11].
В литературе данные о собственной антагонистической активности коринебактерий весьма противоречивы и ограничены [6], [8].
Таким образом, изучение антагонистической активности коринебактерий и механизмов, лежащих в ее основе, позволит расширить представление о роли данных микроорганизмов в формировании вагинального микробиоценоза.
Цель исследования: изучение антагонистической активности коринебактерий.
Материалы и методы
В исследовании были использованы 136 культур СотупвЬаоЬвпит зрр., выделенные из нижнего отдела репродуктивного тракта женщин (58 штаммов выделены у здоровых женщин (первая группа), 78 штаммов - у женщин с микроэкологическими нарушениями (вторая группа)) и 1 тест - штамм Б.аитвт из коллекции ИКВС УрО РАН. Идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинк-ториальных, культуральных и биохимических свойств [10], [11].
Для изучения антагонистической активности коринебактерий исследуемые микроорганизмы культивировали в микроаэрофильных условиях в 2% мясо-пептонном бульоне (НПО «Питательные среды», Махачкала) при 37°С 24 часа. Супернатанты коринебактерий отделяли от бактериальных клеток центрифугированием при 3000g в течение 15 мин, и стерилизовали добавлением 0,2 мл хлороформа. В качестве контроля использовали 2% мясо-пеп-тонный бульон, обработанный хлороформом. Для изучения влияния супернатантов корине-бактерий на антагонизм к Б.аитвт готовили взвесь 106 КОЕ/мл тест штамм Б.аитвт, из су-
точной агаровой культуры бактерий на 0,9% растворе №С1. К 0,1мл микробной взвеси добавляли 0,9 мл супернатантов коринебактерий (в контрольных пробах использовали, соответственно, 2% мясо-пептонный бульон и взвесь 109 КОЕ/мл Б.аитвт). Смеси инкубировали при 37°С 60 мин. В завершении к 0,2 мл взвеси добавляли 2 мл 2% мясо-пептонного бульона и культивировали при 37°С в микроаэофильных условиях. Измеряли оптические плотности выросших культур опытных и контрольных проб на фотометре при длине волны 540 нм и по изменению роста индикаторной культуры в опытной пробы по сравнению с контрольной судили о наличии или отсутствии у исследуемого штамма антагонистической активности. Расчет антагонистической активности (АА) производили по формуле:
^ ={ОДК - ОДоп) 100% ОДк
где ОДк - оптическая плотность индикаторной культуры за 24 часа роста в контроле (контроль роста индикаторного штамма);
ОДоп- оптическая плотность индикаторной культуры за 24 часа роста в опыте, при действии культуральной жидкости исследуемого штамма.
Антагонистическую активность исследуемых штаммов выражали через процент угнетения прироста тест-культуры под влиянием культуральной жидкости антагониста.
Способность коринебактерий к продукции лизоцимподобных веществ определяли по скорости лизиса М. ¡иЬвт [1]: для этого в 96-луноч-ной планшете к суспензии клеток в 0,1 М ФСБ (рН=6,2) объемом 180 мкл добавляли 20 мкл супернатантов коринебактерий (в контрольных пробах использовали, соответственно, 2% мясо-пептонный бульон и взвесь клеток М. ¡иЬвт, яичный лизоцим (Е.С. 3.2.1.17, Sigma-Aldrich, М=14,7 кДа) и взвесь клеток М. Ывш) и определяли значение оптической плотности (^=540 нм) в течение 3 минут с интервалом 15 секунд при 25°С и постоянном встряхивании. Активность лизоцима выражали в у.е./мг белка в минуту, за единицу активности фермента принимали уменьшение оптической плотности взвеси М. ¡иЬвт на 0,01. Наличие лизоцимной активности у исследуемых видов определяли по уменьшению оптической плотности взвеси М. ¡иЬвт на 0,01, результат выражали в усл.ед.
Полученные данные обрабатывали статистически: сравнение средних значений показателей проводили по t - критерию Стьюдента. Различия между группами считали значимыми при р<0,05 [5].
Результаты
Видовой спектр микроорганизмов рода Corynebacterium spp., участвующих в исследовании представлен в таблице 1.
В результате исследования было выявлено, что все штаммы микроорганизмов рода Corynebacterium spp. обладали антагонистической активностью по отношению к S. aureus. Антагонистическая активность коринебактерий выражалась в подавлении прироста биомассы S. aureus и зависела от микроэкологического состояния, при котором исследуемые микроорганизмы были выделены (табл. 2).
Так штаммы коринебактерий, выделенные от здоровых женщин подавляли прирост S. aureus в среднем на 13,1±1,1%, штаммы, выделенные при микроэкологических нарушениях на 16,4±2,2% (р<0,05).
Важно, что при микроэкологических нарушениях не только расширялся видовой состав, но и появлялись штаммы с выраженной антагонистической активностью. Наряду с тем, что у доминирующих видов C. minutissimum, C. amycolatum, выделенных при микроэкологи-
Таблица 1. Видовая характеристика коринеформных бактерий выделенных у женщин в норме и при микроэкологических нарушениях
Виды Частота встречаемости (абс, %)
Первая группа (п=58) Вторая группа (п=78)
C. minutissimum 19(32,8%) 27(34,6%)
C. amycolatum 13(22,4%) 19(24,4%)
C. bovis 6(10,3%) 0(0%)
C. pseudodiphtheriticum 6(10,3%) 6(7,7%)
C. group JK 12(20,7%) 14(17,9%)
C. coyleae 1(1,7%) 2(2,6%)
C. afermentans 1(1,7%) 0(0%)
C. matruchotii 0(0%) 4(5,1%)
C. striatum 0(0%) 2(2,7%)
C. urealyticum 0(0%) 1(1,3%)
C. riegelii 0(0%) 1(1,3%)
C. renale 0(0%) 1(1,3%)
C. vitarumen 0(0%) 1(1,3%)
Естественные науки
ческих нарушениях антагонистическая активность возрастала с 11,6±2,9% до 16,9±2,2% и с 12,05±1,6% до 19,5±6,6% (р<0,05) соответственно, отдельные штаммы проявляли высокую антагонистическую активность по сравнению со средними значениями в группе. Выраженной антагонистической активностью обладали штаммы C. amycolatum, C. urealyticum и C. minutissimum. Данные микроорганизмы подавляли прирост биомассы S. aureus на 58,8%, 37,3% и 26,05% соответственно.
Учитывая, что антагонистическая активность коринебактерий может быть обусловлена продукцией лизоцимподобных веществ, на следующем этапе мы оценили наличие данного свойства у исследуемых микроорганизмов. Лизоцим-ная активность была выявлена у 16% всех исследуемых штаммов. Частота встречаемости данного свойства у штаммов, выделенных при микроэкологических нарушениях, составила 17%, тогда как у штаммов, выделенных от здоровых женщин - 13%. Среднее значение лизоцимной активности у штаммов, выделенных от здоровых женщин и женщин с микроэкологическими нарушениями, составило 0,021±0,003 и 0,019 ±0,009, соответственно. У штаммов C. minutissimum, C. amycolatum и C.JK уровень лизоцимной активности зависел от микроэкологического состояния, при котором данные микроорганизмы были выделены. Так у штаммов C. minutissimum и C.JK, выделенных от здоровых женщин, среднее значение лизоцимной активности составило 0,024±1,1 усл.ед и 0,038±1,8 усл.ед, тогда как у штаммов, выделенных при микроэкологпчес-ких нарушениях, значение лизоцимной активности было достоверно ниже (р<0,005) и составило 0,015±2,4 усл. ед. и 0,017 ±3,4, соответственно. Среднее значение лизоцимной активности у штаммов C. amycolatum, выделенных от здоровых женщин, составило 0,013±3,7 усл.ед, тогда как у штаммов, выделенных при микроэкологических нарушениях, данное свойство отсутствовало.
Обсуждение
Центром формирования микробных биоценозов во всех открытых полостях является межмикробный антагонизм [3].
Выраженность антагонистической активности для представителей резидентной микрофлоры является основополагающим фактором
в поддержании колонизационной резистентности. Коринебактерии, как часть резидентной микрофлоры, не только участвуют в формировании вагинального микробиоценоза, но и наряду с лактобактериями способствуют поддержанию колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин.
В результате проведенного исследования установлено, что все исследуемые штаммы ко-ринебактерий обладали антагонистической активностью по отношению к S. aureus, причем антагонистическая активность зависела от микроэкологического состояния, при котором были выделены данные микроорганизмы. Важно, что способность подавлять прирост биомассы S. aureus у доминирующих видов при микроэкологических нарушениях была достоверно выше. Кроме того, штаммы коринебактерий, которые не встречались у здоровых женщин, также обладали выраженной антагонистической активность по отношению к S. aureus. Вероятно, антагонистическая активность коринебактерий может быть обусловлена их способностью продуцировать лизоцим, так как продукция лизо-цима чаще была выявлена у штаммов, выделенных при микроэкологических нарушениях.
Ранее было показано, что антагонистическая активность коринебактерий подвержена регуляции со стороны других условно-патогенных микроорганизмов [8]. Вероятно, при микроэко-
Таблица 2. Антагонистическая активность микроорганизмов рода Corynebacterium spp.
Виды Процент подавления прироста биомассы S. aureus
Первая группа (n=58) Вторая группа (n=78)
C. minutissimum 11,6±2,9 16,9±2,2*
C. amycolatum 12,05± 1,6 19,5± 6,6*
C. bovis 14,1± 1,6* 12,05± 1,6
C. pseudodiphtheriticum 16,1± 0,2 н/о
C. group JK 14,4± 0,5* 7,3±1,4
C. coyleae 14,4±1,1 13,7±2,7
C. matruchotii н/о 10,8 ±4,1
C. striatum н/о 6,7±3,7
C. urealyticum н/о 37,3±0,2
C. riegelii н/о 7,5
C. vitarumen н/о 13,2
Примечание: * р< 0,05- достоверные различия антагонистической активности между двумя группами; н/о - не определялось.
логических нарушениях создаются условия для селекции штаммов коринебактерий с выраженной антагонистической активностью, что позволяет им адаптироваться и конкурировать с другими условно патогенными микроорганизмами,
тем самым способствуя их сохранению в вагинальном микробиоценозе, что важно для формирования стабильного микробного сообщества и поддержания колонизационной резистентности репродуктивного тракта женщин.
1.10.2014
Работа выполнена при поддержке гранта Фундаментальных исследований УрО РАН №12-У-4-1023 «Симбиотические взаимодействия микроорганизмов и хозяина как биологическая основа колонизационной резистентности», гранта Оренбургской области в сфере научной и научно-технической
деятельности (соглашение №38 от 30.06.2014)
Список литературы:
1. Бухарин О.В., Лобакова Е.С., Немцева Н.В., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург: УрО РАН.- 2007. 264 с.
2. Бухарин О.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Иванов Ю.Б Изменение активности каталазы Staphylococcus aureus АТСС 6538Р под влиянием метаболитов микроорганизмов, выделенных из различных экотопов // Микробиология. - 2002.-№71(2).- с. 183-186.
3. Бухарин О.В., Перунова Н.Б. Микросимбиоценоз. Екатеринбург.- 2014. 260 с.
4. Кира Е. Ф. Бактериальный вагиноз. Спб.: ООО «Нева-Люкс».- 2001. 364с.
5. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., Высшая школа.- 1990.
6. Мартикайнен З.М. Коринебактерии женских гениталий (автореферат).- Спб.. - 1996. 23 с.
7. Одинцова О.В. Коринеподобные и нокардиоподобные бактерии как компонент вагинального микробиоценоза (автореферат). Пермь.- 2002. 23с.
8. Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях (автореферат). Оренбург.- 2009. 22с.
9. Abrehem K, Zamiri I. Production of a bacteriocin, ulceracin 378, by Corynebacterium ulcerans //Antimicrob Agents Chemother. -1983.- 24(2).-P. 262-7.
10. Bernard KA, Funke G. Genus Corynebacterium. In Whitman WB Bergey's manual of systematic bacteriology, vol 5. The actinobacteria. 2012. Springer, New York, NY. P. 245-289.
11. Funk G.A. von Graevenitz, J. E. Clarridge III, and K. A. Bernard. Clinical microbiology of coryneform bacteria - a review // Clin. Microbiol. - 1997.- V.10. - P. 125-159.
Сведения об авторе:
Гладышева И.В., заочный аспирант, научный сотрудник лаборатории изучения механизмов формирования микробиоценозов человека Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, е-тай: G1adishevaIV@yandex.ru
