CC BY
46
Є
Aнтибиoтикopeзиcтeнтнocть кopинeфopмныx бaктepий peпpoдуктивнoгo rpakra женщин
С. В. ЧЕРКАСОВ, И. В. ГЛАДЫШЕВА
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург
Antibiotic Resistance of Coryneform Bacteria Isolated from the Reproductive Tract of Women
S. V. CHERKASOV, I. V. GLADYSHEVA
Institute for Cellular and Intracellular Symbiosis, the Urals Branch of the Russian Academy of Sciences, Orenburg
Изучен видовой состав, антилизоцимная активность (АЛА) и антибиотикорезистентность коринеформных бактерий репродуктивного тракта женщин с различныши микроэкологическими состояниями биотопа. Обследовано 66 женщин, не имеющих микроэкологических нарушений мочеполовой системы, и 102 пациентки с микроэкологическими нарушениями репродуктивного тракта. Установлено что у здоровых женщин доминировали СогупеЬасгепит ттийжтит, С.атусо1а-гит, С.р-оир Ж, С.Ьомб и С^ийойрНгНепгкит. У пациенток с микроэкологическими нарушениями репродуктивного тракта, наряду с вышеперечисленными видами, быыи выделены С.мШгитеп, С.таггискоШ, С.ягг\агит, С.гепа1е и С.иге-а1угкит. У коринеформных бактерий, выщеленных от здоровый женщин, среднее значение АЛА составило 1,32+0,47, тогда как у женщин с микроэкологическими нарушениями репродуктивного тракта среднее значение АЛА составило 1,84+0,38. Определение чувствительности коринебактерий к антибиотикам выявило высокую частоту резистентности к беталактамам (оксациллину и пенициллину), макролидам (эритромицину) и ко-тримоксазолу. Таким образом, для коринебактерий репродуктивного тракта характерно увеличение их видового разнообразия у женщин с микроэкологическими нарушениями изучаемого биотопа и повышение антилизоцимной активности. Вне зависимости от микроэкологического состояния репродуктивного тракта женщин, коринебактерии проявляли высокую устойчивость к оксациллину, пенициллину, эритромицину и ко-тримоксазолу.
Ключевые слова: вагинальный микробиоценоз, коринеформные бактерии, видовой состав, антилизоцимная активность, антибиотикорезистентность. —(^-
The species composition, antilysozyme activity and antibiotic resistance of coryneform bacteria, isolated from the reproductive tract of women with microecological disturbances, were studied. Sixty six women without microecological disturbances and 102 female patients with microecological disturbances in the reproductive tract were examined. The study showed that Corynebacterium minutissimum, C.amycolatum, C.groupJK, C.bovisand C.pseudodiphtheriticumprevailed in the healthy women. In the patients with microecological disturbances in the reproductive tract C.vitarumen, C.matruchotii, C.striatum, C.renale and C.urealyticum were detected in addition to the above species. The average antilysozyme activity of the coryneform bacteria isolated from the healthy women was 1.32+0.47. In the patients with microecological disturbances in the reproductive tract it was 1.84+0.38. The in vitro susceptibility of the coryneform bacteria to antimicrobial agents was determined. High prevalence of resistance to beta-lactams (oxacillin and penicillin), erythromycin and co-trimoxazole was detected. Thus, the species variety and the antilysozyme activity of the coryneform bacteria in the reproductive tract of the women with microecological disturbances were found to be higher. The high prevalence of resistance to oxacillin, penicillin, erythromycin and co-trimoxazole in the coryneform bacteria isolated from the patients with the microecological disturbances did not differ from that in the healthy women.
Key words: vaginal microbiocenosis, coryneform bacteria, species composition, antilysozyme activity, antibiotic resistance.
Микрофлора влагалищного биотопа является единой микроэкологической системой, обеспечивающей защитную функцию репродуктивных органов женщины. Доминирующими представителями резидентной микрофлоры влагалища являются Lactobacillus spp., выполняющие основную роль в поддержании колонизационной резистентности данного биотопа [1, 2]. По дан-
© С. В. Черкасов, И. В. Гладышева, 2010
Адрес для корреспонденции: 460000 Оренбург, ул. Пионерская, 11. Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УРО РАН
ным исследователей, чаще всего у здоровых женщин во влагалище, наряду с лактобактериями, обнаруживают непатогенные коринебактерии [1—3]. Данный вид менее изучен и также относится к резидентной микрофлоре влагалища.
Исследования последнего десятилетия, с одной стороны, выявили высокую значимость для вагинального микробиоценоза группы коринеформных бактерий [4, 5], а с другой, ряд исследователей считает, что данные бактерии могут входить в состав бактериальных ассоциаций и не только поддерживать воспалительный
О
е
Таблица 1. Видовая характеристика коринеформных бактерий, выделенных у женщин в норме и при мик-роэкологических нарушениях
Виды Corynebacterium Чacтoтa вcтpeчaeмocти (a6c/%)
перв;ія групта (n=18) втopaя групта (n=33)
C.minutissimum 5 (27,8%) 11 (33,3%)
C.amycolatum 3 (16,6%) 7 (21,21%)
C.bovis 2 (11,1%) 0
C.pseudodiphtheriticum 2 (11,1%) 1 (3,03%)
Corynebacterium group JK 3 (16,6%) 4 (12,12%)
C.coyleae 1 (5,6%) 2 (6,06%)
C.afermentans 1 (5,6%) 0
C.matruchotii 0 2 (6,06%)
C.striatum 0 2 (6,06%)
C.urealyticum 0 1 (3,03%)
C.riegelii 0 1 (3,03%)
C.renale 0 1 (3,03%)
C.vitarumen 0 1 (3,03%)
процесс, но и, в некоторых случаях, являться его причиной [6—9].
В литературе имеются данные о возрастании численности коринеформных бактерий и изменении их биологических свойств при микроэко-логических нарушениях репродуктивного тракта женщин, в частности, при воспалительных заболеваниях женского репродуктивного тракта отмечено возрастание персистентных характеристик коринебактерий: антилизоцимной и ан-тикомплементарной активностей, определяющих их устойчивость к лизоциму и комплементу макроорганизма [10]. Многие авторы обращают внимание на возрастание резистентности коринеформных бактерий к антибиотическим веществам [6, 11— 15].
Высказано предположение о том, что представители данной группы микроорганизмов участвуют в формировании экологического барьера влагалища и обеспечении устойчивости микробиоценоза вагинального биотопа [4].
Наряду с вышеизложенным, видовой состав и биологические характеристики коринеформных бактерий репродуктивного тракта женщин изучены недостаточно.
Цель настоящей работы — изучение видового состава, антилизоцимной активности и чувствительности к антибиотикам коринеформных бактерий, выделенных из репродуктивного тракта женщин в норме и при микроэкологических нарушениях.
Maтepиaл и методы
Обследовано 168 женщин, из них 66 пациенток, не предъявляющих жалобы на момент обследования и не имеющих в течение года воспалительных заболеваний мочеполовой системы (первая группа), и 102 пациентки с микроэкологически-ми нарушениями репродуктивного тракта (вторая группа).
Для определения видового состава и биологических свойств микрофлоры проводили взятие материала из заднего свода влагалища и аспирацию слизи цервикального канала. Посев материала осуществляли на чашки Петри со средой Columbia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, India) с содержа-
нием 5% крови человека. Посевы инкубировали в эксикаторе в атмосфере 5% CO2 при температуре 37°С, в течение 48—72 часов, затем получали чистые культуры коринебактерий.
У выделенных штаммов исследовали следующие биологические характеристики: характер роста на кровяном агаре, морфологические и тинкториальные свойства, наличие ката-лазы и нитратредуктазы, ферментацию углеводов; идентификацию до вида проводили по схемам [6, 16].
Определение чувствительности коринебактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом и интерпретация полученных результатов проводились согласно стандартам [17]. Использовались стандартные диски промышленного производства 17 антибиотиков различной химической природы и механизмов действия на бактериальную клетку.
Для исследования устойчивости коринеформных бактерий к природному антибиотику лизоциму определяли антилизоцим-ную активность (АЛА) по методу О. В. Бухарина и соавт. [18].
Результаты экспериментов, проведённых трижды в независимых сериях, статистически обрабатывались, согласно рекомендациям [19].
Результаты и обсуждение
Установлено, что при микроэкологических нарушениях в репродуктивном тракте женщин коринебактерии обнаруживались с большей частотой. Так, микроорганизмы, отнесённые в роду Corynebacterium, были выделены у 32,35% женщин с микроэкологическими нарушениями, и у 27,27% здоровых пациенток. Анализ показателя микробной обсеменённости выявил увеличение количества коринебактерий во влагалище у женщин с микроэкологическими нарушениями по сравнению с нормой.
У здоровых женщин доминировали следующие виды: C.minutissimum, C.amycolatum, C.group JK, C.bovisи C.pseudodiphtheriticum (табл. 1). Чаще встречались C.minutissimum, составившие 27,8%, C.amycolatum и Corynebacterium group JK — 16,6%, C.pseudodiphtheriticum — 11,1%, остальные виды составили 5,6%.
У пациенток с микроэкологическими нарушениями репродуктивного тракта видовой состав был шире. Наряду с вышеперечисленными видами были выделены: C.vitarumen, C.matruchotii, C.striatum, C.renale и C.urealyticum.
е
Таблица 2. Антилизоцимная активность (АЛА) коринеформных бактерий репродуктивного тракта здоровых женщин и женщин с микроэкологическими нарушениями
Виды Corynebacterium
АЛА, мкг/мд
перв;ія групта (n=18)
втopaя групта (n=33)
C.minutissimum 1,17+0,49 2,4 +0,47
C.amycolatum 1,33+0,69 4,03+1,7
C.bovis 1,05+0,55 —
C.pseudodiphtheriticum 1,4+0,11 0,29+0,11
Corynebacterium group JK 0,27+0,09 2,58+1,06
C.coyleae — 1,09+0,81
C.afermentans 2,7+0,11 —
C.matruchotii — 3,25+0,55
C.striatum — 0,3+0,3
C.urealyticum — 1,5+0,11
C.riegelii — 0,2+0,11
C.renale — 2,5+0,11
C.vitarumen — 2,1+0,11
Таблица 3. Частота выделения антибиотикорезистентных коринебактерий, полученных из урогенитального
тракта женщин
Антибготики Перв;ія групта (n=18) Bтopaя групта (n=33)
a6c % a6c %
Оксациллин 14 77,7+10,1 19 57,6+8,7
Ампициллин 4 22,2+10,1 3 9,09+5,1
Цефтриаксон 0 0 0 0
Имипенем 1 5,5+5,5 0 0
Цефотаксим 0 0 4 12,1+5,8
Пенициллин 11 61,1+11,8 21 63,6+8,5
Ванкомицин 0 0 0 0
Доксициклин 0 0 1 3,03+3,03
Гентамицин 1 5,5+5,5 0 0
Неомицин 1 5,5+5,5 3 9,09+5,1
Амикацин 0 0 3 9,09+5,1
Эритромицин 9 50+12,1 20 60,6+8,6
Норфлоксацин 6 33,3+11,4 10 30,3+8,1
Линкомицин 5 27,8+10,9 8 24,2+7,6
Левомицетин 5 27,8+10,9 12 36,4+8,5
Ко-тримоксазол 15 83,3+9,1 26 78,8+7,2
Рифампицин 2 11,1+7,6 2 6,06+4,2
При оценке АЛА было установлено наличие этого признака у всех исследуемых видов корине-бактерий, выделенных от здоровых женщин, причем среднее значение АЛА составило 1,32+0,47 при абсолютных значениях от 0,27 до 2,7 мкг/мл. Средний уровень выраженности данного признака у штаммов, выделенных у женщин с микроэкологическими нарушениями, составил 1,84+0,38, варьируя от 0,2 до 4,03 мкг/мл (табл. 2).
Особый интерес представляло исследование антибиотикочувствительности выделенных ко-ринебактерий. У 51 штамма, отнесённых к роду Corynebacterium, была определена чувствительность к 17 антибиотикам (табл. 3).
Определение чувствительности выделенных представителей рода Corynebacterium к антибиотикам выявило высокую частоту резистентности к беталактамам (оксациллину и пенициллину), макролидам (эритромицину) и ко-тримоксазолу. При этом высокая резистентность к данным антибиотикам выявлена у коринебактерий, выделенных как у здоровых
женшин, так и у женщин с микроэкологическими нарушениями. Резистентность к оксациллину была высокой у всех доминирующих видов: 81,75% — у C.minutissimum, 60% — у C.amycolatum и 71,4% Corynebacterium group JK. Штаммы C.minutissimum и Corynebacterium group JK проявляли высокую резистентность и к пенициллину — 87,5 и 71,4% соответственно.
Интерес представляют штаммы Corynebacterium group JK. Это единственный доминирующий вид, у которого наблюдалась 100% резистентность к эритромицину независимо от состояния вагинального микробиоценоза женщин. При этом штаммы данного вида, выделенные от здоровых женщин, также обладали 100% устойчивостью к норфлоксацину, левомицетину (хлорамфенико-лу) и ко-тримоксазолу.
Высокую чувствительность коринебактерии продемонстрировали к цефтриаксону, цефо-таксиму, имипенему, доксициклину, гентами-цину, неомицину, амикацину, рифампицину и ванкомицину.
e
Обращает на себя внимание, что для большинства представителей C.amycolatum, в отличие от остальных доминирующих видов, характерна высокая чувствительность к большинству используемых антибиотиков: ампициллину, цефтриаксону, цефотаксиму, неомицину, до-ксициклину, гентамицину, амикацину, рифам-пицину, пенициллину, ванкомицину, норфлок-сацину, имипенему. При этом штаммы данного вида проявляли высокую чувствительность в равной степени при выделении их как у здоровых женщин, так и у женщин с микроэкологи-ческими нарушениями.
Вагинальный микробиоценоз относится к открытой экологической системе, подверженной регулярному воздействию транзиторной микрофлоры. Бактериальные виды, составляющие вагинальный микробиоценоз, максимально адаптированы к среде обитания и в результате этого получили возможность длительно переживать, сохраняться и размножаться в данной экосистеме.
Наряду с лактобактериями, к доминирующим видам резидентной микрофлоры влагалища относят коринеформные бактерии [1—3], определение систематической принадлежности которых до настоящего времени не закончено. Исследователи продолжают выделять все новые виды кори-неформных бактерий, в частности C.riegelii, C.coyleae [20, 21].
До сих пор ведутся споры о роли корнеформных бактерий в микробиоценозе вагинального тракта. Некоторые исследователи считают, что коринеформные бактерии могут входить в состав бактериальных ассоциаций и не только поддерживать воспалительный процесс, но и выступать в роли патогенов. Другие выражают мнение, что коринебактерии участвуют в разложении углеводов до молочной кислоты, тем самым сдвигают pH в кислую сторону [6], и, вероятно, способствуют размножению лактобацилл, что благоприятно для вагинального микробиоценоза (тем самым запуская один из механизмов восстановления микробиоценоза вагинального тракта) [4].
Имеются лишь единичные работы, посвящённые изучению видового состава вагинальных коринеформных бактерий при различных физиологических и патологических состояниях микробиоценоза влагалища.
Нами было выявлено, что видовая структура популяции вагинальных коринебактерий связана с состоянием вагинального микробиоценоза. К доминантным видам в условиях вагинального нормоценоза следует отнести C.minutissimum, C.amycolatum, Corynebacterium group JK, C.bovis и C.pseudodiphtheriticum. При микроэкологических нарушениях происходит увеличение видового разнообразия и частоты встречаемости домини-
рующих видов, отдельные представители которых, по-видимому, могут участвовать в процессах восстановления вагинального микробиоценоза при микроэкологических нарушениях [4].
При воспалительных процессах отмечено возрастание АЛА коринеформных бактерий, что отражает их адаптивные изменения и определяет возможность сохранения во влагалищном микробиоценозе. Повышение АЛА коринеформных бактерий репродуктивного тракта, вероятно, происходит вследствие увеличения лизоцима на фоне микроэкологических изменений в вагинальном и цервикальном биотопах [10].
При определении чувствительности к антибиотикам нами было выявлено, что в большинстве случаев исследуемые штаммы проявляли высокую резистентность к беталактамам (оксацилли-ну и пенициллину), макролидам (эритромицину) и ко-тримоксазолу. При этом высокая резистентность к данным антибиотикам выявлена у коринебактерий, выделенных как у здоровых женщин, так и у женщин с микроэкологическими нарушениями. Резистентность к оксациллину была высокой у всех доминирующих видов: 81,75% — у C.minutissimum, 60% — у C.amycolatum и 71,4% — у Corynebacterium group JK. Штаммы C.minutissimum и Corynebacterium group JK проявляли высокую резистентность и к пенициллину: 87,5 и 71,4% соответственно, что может быть связано с наличием у них плазмид лекарственной устойчивости к беталактамам [22].
Интерес представляют штаммы Corynebacterium group JK. У данного вида выявлена высокая резистентность к широкому спектру антибиотиков, что, вероятно, является генетически обусловленной резистентностью данного вида. Это — единственный доминирующий вид, у которого наблюдалась 100% резистентность к эритромицину, что, скорее всего, является исключительно признаком данного вида [23]. Этот же вид был также наименее чувствителен к пенициллину, ко-тримоксазо-лу, норфлоксацину и левомицетину. Полученные результаты соответствуют данным литературы. Обнаружены плазмиды, отвечающие за устойчивость коринеформных бактерий к гентамицину и эритромицину [6, 7, 22, 24].
При выборе рациональной антибиотикотера-пии для лечения микроэкологических нарушений, вызванных патогенными микроорганизмами, помимо определения антибиотикочувствительности выделенного возбудителя, необходимо учитывать и чувствительность к выбранным препаратам обнаруженной сопутствующей нормальной микрофлоры, в частности, коринебактерий.
Выводы
1. Для коринебактерий репродуктивного тракта характерно увеличение видового разно-
е
образия у женщин с микроэкологическими нарушениями и повышение антилизоцимной активности, характеризующей устойчивость данных микроорганизмов к одному из факторов местного иммунитета.
2. Вне зависимости от микроэкологическо-го состояния репродуктивного тракта женщин, коринебактерии проявляли высокую устойчивость к оксациллину, пенициллину, эритромицину и ко-тримоксазолу, что воз-
ЛИТЕРАТУРА
1. Kupa Е. Ф. Бактериальный вагиноз. Спб., 2001; 364.
2. Aнкupcкaя A. C. Микроэкология влагалища и профилактика акушерской патологии. Инф и антимикроб химиотер 1999; 3.
3. Ha3apoea Е. К., Гuммeлъфapб Е. И., Co3aeea Л. Г. Микробиоценоз влагалища и его нарушения. Этиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика. Антибиотики и химиотер 2002; 47: 4: 34—42
4. MapmuKarnen З. M. Коринебактерии женских гениталий (автореферат). Спб., 1996; 23.
5. Odun^ea О. В. Коринеподобные и нокардиоподобные бактерии как компонент вагинального ми кр о биоценоза (автореферат). Пермь. 2002; 23.
6. Funke G., von Graevenitz A., Clarridge IIIJ. E., Bernard K. A. Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 125-159.
7. Coyle M. B., Lipsky B. A. Coryneform bacteria in infectious diseases: clinical and laboratory aspects. Clin Microbiol Rev 1990; 3: 227—246.
8. Bernard K. A., Munro C., Wiebe D. Characteristics of rare or recently described Corynebacterium species recovered from human clinical material in Canada. J. Clin. Microbiol 2002; 40: 11: 4375—4381.
9. Nebreda-Mayoral T., Munoz-Bellido J. L., Garcia-Rodriguez J. A. Incidence and characteristics of urinary tract infections caused by Corynebacterium urealyticum (Corynebacterium group D2). Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: 600—604.
10. 4epKacoe И. В. Характеристика микробиоценоза репродуктивного тракта женщин при трихомонадной инфекции (автореферат). Оренбург. 2009; 23.
11. Ferreira Camello T. C., Mattos-Guaraldi A. L., Formiga L. C. D. Nondiphtherial Corynebacterium species isolated from clinical specimens of patients in a university hospital, Rio De Janeiro, Brazil. Brazilian J. Microbiol 2003; 34: 39—44.
12. Aguado J. M., Ponte C., Soriano F. Bacteriuria with a multiple resistant species of Corynebacterium (Corynebacterium group D2): an unnoticed cause of urinary tract infection. J Infect Dis 1987; 156: 144—150.
можно является видовой характеристикой данных микроорганизмов.
3. Наличие у коринебактерий репродуктивного тракта женщин антилизоцимной активности и антибиотикорезистентности определяет возможность персистенции данных микроорганизмов в занимаемом биотопе в связи с устойчивостью к действию эндогенных (лизоцим) и экзогенных (антибиотики) антибактериальных факторов.
13. Garcia-Rodriguez J. A., Garcia-Sanchez J. E., Munoz-Bellido J. L. In vitro activity of 79 antimicrobial agents against Corynebacterium group D2. Antimicrob. Agents Chemother 1991; 35: 2140—2143.
14. Philippon A., Bimet F. In vitro susceptibility of Corynebacterium group D2 and Corynebacterium jeikeium to twelve antibiotics. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1990; 9: 892—895.
15. Soriano F., Zapardiel J., Nieto E. Antimicrobial susceptibilities of Corynebacterium species and other non-spore-forming gram-positive bacilli to 18 antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother 1995; 39: 208F. 214.
16. Определитель бактерий Берджи в 2 томах / Под ред.Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др.: Справочное издание. М.: 1997; 780.
17. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам МУК 4.2.189004.2004. Клин микробиол антимикроб химиотер 2004; 6: 4.
18. Eyxapuu О. В. Персистенция патогенных бактерий. М.: 1999; 366.
19. J^aKun Г. Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990.
20. Funke G., Lawson P. A., Collins M. D. Corynebacterium riegelii sp. nov., an unusual species isolated from female patients with urinary tract infections. J Clin Microbiol 1998; 36: 624—627.
21. Funke G., Pascual Ramos C., Collins M. D. Corynebacterium coyleae sp. nov., isolated from human clinical specimens. Int J Syst Bacteriol 1997; 47: 92—96.
22. Schiller J., Strom M., Groman N. Relationship between pNG2, an Emr plasmid in Corynebacterium diphtheriae, and plasmids in aerobic skin coryneforms. Antimicrob Agents Chemother 1983; 892—901.
23. Rosato A. E., Lee B. S., Nash K. A. Inducible macrolide resistance in Corynebacterium jeikeium. Antimicrob. Agents Chemother 2001; 45: 1982—1989.
24. Yague G., Mora B., Martinez-Toldos M. C., Rodriguez T. Implicacion de los genes erm X en la resistencia a los macrolidos y la telitromicina de Corynebacteriun jeiketum y Corynebacterium amycolatum. Rev Esp Quimioterap 2005; 18: 236—242.
