CC BY
69
Аномальный липопротеин-Х при сахарном диабете 2-го типа
К.б.н. М.Р. ОВСЕПЯН1, м.н.с. М.Г. ЭБРАГИМЗАДЕ1, м.н.с. А.Б. ГАБРИЕЛЯН1, м.н.с. М.Г. ОГАНЕСЯН12, асс. А.А. ГЕВОРКЯН3, к.м.н. А.А. МАМИКОНЯН3, проф. А.С. БОЯДЖЯН12*
Anomalous lipoprotein-X in type 2 diabetes mellitus
M.R. OVSEPYAN, M.G. EBRAGIMZADE, A.B. GABRIELYAN, M.G. OGANESYAN, A.A. GEVORKYAN, A.A. MAMIKONYAN, A.S. BOYADZHYAN
'Институт молекулярной биологии Национальной академии наук Республики Армения (НАН РА), Ереван; 2Российско-Армянский (Славянский) государственный университет, Ереван; 3Медицинский центр «Армения» МЗ Республики Армения, Ереван
Сахарный диабет 2-го типа (СД2) является наиболее распространенной формой диабета и характеризуется нарушением углеводного, белкового и липидного обмена вешеств, включая дислипидемию и увеличение уровней липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Липопротеин-Х (ЛП-Х) представляет собой аномальный подкласс ЛПНП, характеризующийся высоким содержанием фосфолипидов и неэтерифицированного холестерина и низким содержанием эфиров холестерина, триглицеридов и белка. Наличие ЛП-Х в крови наблюдалось при многих заболеваниях печени и желчных протоков, ассоциирующих с холестазом. Наши исследования выявили наличие ЛП-Х в крови больных семейной средиземноморской лихорадкой и ишемическим инсультом, в том числе отягощенным СД. Цель работы — анализ крови больных СД2 на наличие ЛП-Х. Методом полианионной преципитации ЛПНП, предварительно разделенных электрофорезом в агаровом геле, впервые показано присутствие ЛП-Х в крови больных СД2. Обсуждается возможная патогенетическая роль и механизмы генерации ЛП-Х при СД2.
Ключевые слова: липопротеин-Х, липопротеины низкой плотности, сахарный диабет 2-го типа.
Type 2 diabetes mellitus (DM2) is the most common form of diabetes characterized by the disturbances of carbohydrate, protein, and lipid metabolism including dyslipidemia and elevation of the low-density lipoprotein (LDLP) levels. Lipoprotein-X (LP-X) represents an anomalous subclass of LDLP a distinctive feature of which is the high content of phospholipids and non-esterified cholesterol coupled with the low level of cholesterol ethers, triglycerides, and proteins. LP-X was detected in the blood of the patients with various diseases of the liver and biliary ducts associated with cholestasis. The results of our previous investigations suggest the presence of LP-X in the blood of the patients with familial Mediterranean fever and ischemic stroke complicated by concomitant diabetes mellitus. The objective of the present work was to elucidate whether LP-X actually occurs in the blood of the patients presenting with type 2 diabetes mellitus. We used the method of polyanionic precipitation of LDLP preliminarily separated by agar gel electrophoresis. The study has demonstrated for the first time the presence of LP-X in the blood of the patients with type 2 diabetes mellitus. Its possible pathogenetic role and mechanisms of LP-X generation in DM2 are discussed.
Key words: lipoprotein-X, low-density lipoproteins, type 2 diabetes mellitus.
Сахарный диабет 2-го типа (СД2) является наиболее распространенной формой диабета и характеризуется нарушением углеводного, белкового и липидного обмена, включая дислипидемию и увеличение уровней липопротеинов низкой плотности (ЛПНП ) [1, 2].
Липопротеин-Х (ЛП-Х) представляет собой аномальный подкласс ЛПНП, характеризующийся высоким содержанием фосфолипидов и неэтерифицированного холестерина и низким содержанием эфиров холестерина, триглицеридов и белка [3, 4]. Среди белков, входящих в состав ЛП-Х, преобладают альбумин и аполипопротеин-С. ЛП-Х был впервые обнаружен в крови больных механической желтухой [3]. Высокие уровни ЛП-Х в крови отмечены также при семейном дефиците фермента лецитин-холестеринацилтрансферазы (ЛХАТ) [3]. Дальнейшие исследования показали наличие ЛП-Х в крови при широком ряде заболеваний печени и желчных протоков, ассоциирующих с холестазом [5]. Кроме
того, наши исследования ЛП-Х в крови больных семейной средиземноморской лихорадкой (ССЛ) и ишемическим инсультом, отягощенным СД2 [6].
Цель настоящей работы — анализ крови больных СД2 на наличие ЛП-Х во фракции ЛПНП.
Материал и методы
Исследованы образцы сывороток 40 больных СД2 (21 женщина, 19 мужчин), находящихся на лечении в Республиканском медицинском центре «Армения» МЗ РА. Диагноз установлен в соответствии с Международной классификацией болезней (10-е издание). Средний возраст больных СД2 составлял 55±10 лет (М±а), средняя давность заболевания — 11±7 лет (М±а). У 96% больных СД2 наблюдалось тяжелое течение заболевания, сопровождающееся характерными для его поздних этапов осложнениями — диабетической макроангио-патией сосудов нижних конечностей, нефропатией,
© Коллектив авторов, 2012 18
*e-mail: aboyajyan@sci.am
ретинопатей, нейропатией. Часть пациентов (30%) получали комбинированную антилипидемическую терапию, включая ее медикаментозную (статины) и немедикаментозную (гиполипидемическая диета, регулярные физические упражнения) составляющие. Контрольная группа включала 40 здоровых лиц (20 женщин и 20 мужчин) без наследственной отягощенности по инсультам, инфаркту миокарда, ССЛ, дефициту ЛХАТ или СД. Здоровые лица (ЗЛ) не принимали каких-либо лекарственных препаратов как минимум за 12 мес до начала исследования. Никто из включенных в исследование лиц не страдал заболеваниями печени и желчных протоков, ассоциирующихся с холестазом, ССЛ, семейным дефицитом ЛХАТ, онкологическими или аутоиммунными заболеваниями, не переносил инсульт или инфаркт миокарда, острых инфекционных заболеваний, не подвергался хирургическим операциям и не принимал препараты противовоспалительного или иммуномодуляторного действия как минимум за 12 мес до начала исследования. Пробы крови брали с согласия пациентов и разрешения Комитета по этике Института молекулярной биологии НАН РА.
Обобщенная характеристика вовлеченных в настоящее исследование больных и здоровых лиц приведена в табл. 1.
Забор крови проводили в 9:00 ч натощак пункцией локтевой вены, пробы сразу помещали на лед. В части пробы (цельная кровь) сразу же определяли содержание HbA1c. Другую часть пробы после свертывания крови центрифугировали при 3000g в течение 10 мин и отбирали сыворотку, которую использовали для определения HbA1c, холестерина, триглицеридов, ЛПНП. Образцы сыворотки хранили при —30 °C.
Определение процентного содержания (%) HbA1c в образцах цельной крови проводили колориметрическим методом, используя коммерческий набор реагентов («Biosystems», Коста Брава, Испания), согласно инструкции производителя.
Содержание общего холестерина и триглице-ридов в сыворотке определяли колориметрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе Hycel Lisa («Chema Dignostica», Италия) с использованием коммерческих наборов реагентов («Human», Германия), согласно инструкциям производителя и выражали в ммоль/л.
Качественный и количественный анализ ЛПНП, включая ЛП-Х и бета-липопротеин (бета-
ЛП), в сыворотке проводили электрофорезом (ЭФ) в бактоагаре («Difco», США), с последующей полианионной преципитацией in situ [7]. ЭФ проводили на стеклянных пластинах (7,7x2,6 см) в 1% бакто-агаровом геле толщиной 1,5 мм, содержащем 0,1% гепарин при комнатной температуре. В каждую лунку наносили по 40 мкл сыворотки. Использовали аппаратуру Wide Mini-Sub Cell GT («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) в течение 1,5 ч при напряжении на электродах 120 V в 50 мМ барбитало-вом буфере, рН 8,6. По окончании электрофореза гели инкубировали 30 мин при комнатной температуре в 0,1 М растворе MgCl2, содержащем 0,25% гепарин и 0,9% NaCl. ЛПНП взаимодействуют с гепарином (так называемая полианионная преципитация) и выявляются в виде белых полос на геле. Комплексы ЛПНП с гепарином фиксировали инкубацией в течение 15 мин в 2% водном растворе формальдегида.
Все реактивы, кроме отмеченных, произведены «Sigma-Aldrich Co.» (США).
Относительное содержание ЛП-Х и бета-ЛП определяли полуколичественным методом — измерением интегральных интенсивностей окрашенных полос на геле и выражали в условных единицах (УЕ) интегральной интенсивности (ЕИН). Для этого гели сканировали, а их изображения обрабатывали на компьютере. Соотношение ЛП-Х/бета-ЛП оценивали сравнением интегральных интенсивностей соответствующих полос в геле и выражали в процентах (%), принимая за 100% сумму интегральных интенсивностей обеих полос (ЛП-Х + бета-ЛП).
Обработку полученных данных проводили с помощью программного пакета GraphPadPrizm 3.03 («GraphPad Softwaer Inc.», США).
Результаты и обсуждение
У всех 40 больных СД2 в сыворотке обнаруживался аномальный ЛП-Х, чего не наблюдалось у ЗЛ. Отсутствие ЛП-Х в норме было ранее показано как нами, так и другими авторами [5, 6]. Следует отметить, что в сыворотке как больных СД2, так и ЗЛ присутствовали также бета-ЛП. При этом их содержание у больных значительно превышало таковое у ЗЛ, что характерно для СД2 [1, 2]. В процентном соотношении у больных СД2 преобладали бета-ЛП (ЛП-Х/бета-ЛП=25,3%±1,9%/74,7±5,7%). Полученные данные показаны на рисунке и в табл. 2. В табл. 2
Таблица 1. Клинико-демографические показатели у больных СД2 и здоровых лиц
Группа n Пол (м/ж) „ Давность забо-Возраст левания HbA1c, % Холестерин Триглицериды
годы (М±а) ммоль/л (М±а)
СД2 40 21/19 55+10 11±7 6,8+1,5 6,1 + 1,5 4,0+3,6
ЗЛ 40 20/20 53±9 — 3,9±0,9 4,0+0,9 1,5± 0,6
Таблица 2. Среднестатистические показатели липидного обмена исследуемых групп больных СД2 и ЗЛ
Холестерин Триглицериды бета-ЛП ЛП-Х
РУДПа_ммоль/л (М±д)_УЕ (М±д)_
СД2 6,1 + 1,5 4,0+3,6 69 528+31 990 9615+4733
ЗЛ 4,0+0,9 1,5+0,6 26 415+14 802 —
Типичный образец электрофореграммы, полученной при определении ЛПНП в сыворотке крови больных СД2 (а) и ЗЛ (б).
представлены также и другие показатели липидного обмена больных и ЗЛ.
Таким образом, результаты настоящего исследования впервые демонстрируют присутствие ЛП-Х в крови больных СД2.
Как отмечено выше, ЛП-Х обнаруживается в крови при заболеваниях печени и желчных протоков, ассоциирующихся с холестазом, ССЛ, семейном дефиците ЛХАТ и инсультах [5, 6]. Патогенетическая роль и механизмы генерации ЛП-Х при отмеченных заболеваниях до настоящего времени не установлены.
Ряд экспериментальных и клинических данных [8—10] свидетельствует о том, что воспалительные процессы играют важную патогенетическую роль как в возникновении диабета, так и в развитии его поздних осложнений. Интересно, что, как показывают результаты исследований in vitro, ЛП-Х сти-
мулирует экспрессию моноцитарного хемотакси-ческого белка-1 (МСР-1) [11], а наши имеющиеся данные свидетельствуют о повышенной экспрессии этого провоспалительного хемокина у больных СД2 [12] и его высоких уровнях в крови при данном заболевании [13, 14]. МСР-1 относится к хемокинам — подклассу цитокинов, одна из функций которых состоит в хемотаксисе и активации различных популяций лейкоцитов [15]. МСР-1 продуцируется многими типами клеток, включая мононуклеарные клетки, тучные клетки, Т-клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки костного мозга, эпителиальные клетки и астроциты. Он выступает в роли мощного аттрактанта для моноцитов/макрофагов и активированных Т-лимфоцитов [15]. Так, индуцируемая МСР-1 миграция моноцитов в очаг инсульта, где они трансформируются в макрофаги и далее фагоцитируют поврежденные клетки, вносит существенный вклад в развитие постишемического воспалительного ответа [16]. Таким образом, можно предположить, что ЛП-Х стимулирует развитие воспалительных реакций при СД2, индуцируя экспрессию МСР-1.
С другой стороны, недавно показано, что наличие ЛП-Х в общей популяции ЛПНП препятствует окислению ЛПНП [17]; тем самым ЛП-Х проявляет антиатерогенный эффект [18]. Следовательно, наличие ЛП-Х в популяции ЛПНП при СД2 может быть также обусловлено компенсаторными реакциями организма в ответ на характерное для этой патологии высокое содержание атерогенных ЛПНП [19]. Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — АС. Бояд-жян, М.Р. Овсепян
Сбор и обработка материала — М.Г. Оганесян, А.Б. Габриелян, А.А. Геворкян, А.А. Мамиконян
Статистическая обработка данных — М.Г. Эбра-гимзаде, А.Б. Габриелян
Написание текста — М.Р. Овсепян Редактирование — АС. Бояджян
ЛИТЕРАТУРА
1. van Dieren S., Beulens J.W., van der Schouw Y.T., Grobbee D.E., Neal B. The global burden of diabetes and its complications: an emerging pandemic. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil 2010; 17: Suppl 1: S3—S8.
2. Zimmet P. The burden of type 2 diabetes: are we doing enough? Diabetes Metab 2003; 29: 6: S9—S18.
3. Switzer S. Plasma lipoproteins in liver disease. I. Immunologically distinct low-density lipoproteins in patients with biliary obstruction. J Clin Invest 1967; 46: 1855—1866.
4. SeidelD. Lipoproteins in liver disease. J Clin Chem Clin Biochem 1987; 25: 541—551.
5. Boyajyan A.S., Arakelyan A.A., Ayvazyan V.A. Lipoprotein-X in diseases. In Handbook oflipoprotein research. Ed. J.E. Rathbond. New York: Nova Science Publishers Inc. 2011.
6. Manukyan L., Boyajyan A., Arakelyan A., Ayvazyan V., Arakelova E, Sim R, Grigoryan G. Immunochemical composition of cryoglobulins generated in stroke. J Clin Immunol 2009; 29: 274— 281.
7. Seidel D., Wieland H, Ruppert C. Improved techniques for assessment of plasma lipoprotein patterns. I. Precipitation in gels after electrophoresis with polyanionic compounds. Clin Chem 1973; 19: 737—739.
8. Donath M.Y., Shoelson S.E. Type 2 diabetes as an inflammatory disease. Nat Rev Immunol 2011; 11: 98—107.
9. Duncan B.B., SchmidtM.I., Pankow J.S., Ballantyne C.M., Couper D., Vigo A., Hoogeveen R., Folsom A.R., Heiss G. Low-grade systemic inflammation and the development of type 2 diabetes: the atherosclerosis risk in communities study. Diabetes 2003; 52: 1799—1805.
10. Huysman E., Mathieu C. Diabetes and peripheral vascular disease. Acta Chir Belg 2009; 109: 587—594.
11. Lynn E.G., Siow Y.L., Frohlich J., Cheung G.T., O K. Lipoprotein-X stimulates monocyte chemoattractant protein-1 expression in mesangial cells via nuclear factor-kappa B. Kidney Int 2001; 60: 520—532.
12. Mine S., Okada Y., Tanikawa T., Kawahara C., Tabata T., Tanaka Y. Increased expression levels of monocyte CCR2 and monocyte chemoattractant protein-1 in patients with diabetes mellitus. Biochem Biophys Res Commun 2006; 344: 780—785.
13. Blaha V., Andrys C., Smahelova A., Kni'zek J., HysplerR., Solichova D., Blaha M., Zadak Z. Effect of atorvastatin on soluble CD14, CD40 Ligand, sE- and sP-selectins and MCP-1 in patients with type 2 diabetes mellitus: Relationship to cholesterol turnover. Pharmacol Res 2006; 54: 421—428.
14. Boyajyan A.S., Arakelova E.A., Ayvazyan V.A., Manukyan L.A. Interleukins and chemokines in acute ischemic stoke complicated and non-complicated with diabetes. Cytokin Inflamm 2008; 7: 41—45.
15. Mackay C.R. Chemokines: immunology's high impact factors. Nat Immunol 2001; 2: 95—101.
16. Di Napoli M., Arakelyan A., Boyajyan A., Godoy A., Papa F. The acute phase inflammatory response in stroke: systemic inflammation and neuroinflammation. In: Progress in Inflammation Research. New York: Nova Science Publishers Inc 2006.
17. Chang P.Y., Lu S.C., Su T.C., Chou S.F., Huang W.H., Morrisett J.D., Chen C.H., Liau C.S., Lee Y.T. Lipoprotein-X reduces LDL atherogenicity in primary biliary cirrhosis by preventing LDL oxidation. J Lipid Res 2004; 45: 2116—2122.
18. SteinbergD., Witztum J.L. Is the oxidative modification hypothesis relevant to human atherosclerosis? Do the antioxidant trials conducted to date refute the hypothesis? Circulation 2002; 105: 2107—2111.
19. Betteridge D.J., Illingworth D.R., Shepherd J. Lipoproteins in health and disease. UK Hodder Arnold 1999.
