CC BY
137
стеночной и просветной микрофлоры ЖКТ биологической модели.
2. Изменения микробного пейзажа кишечного микробиоценоза зависят от исходного состава модифицируемого микробного сообщества.
3. Предложенная биологическая модель пригодна для изучения влияния пробиотических препаратов на микробиоту ЖКТ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липниц-кий Е.М. и др. Микробное сообщество пристеночного муцина различных отделов желудочно-кишечного тракта человека // Вестник РАМН. - 2004. - № 4. - С. 23-28.
2. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Липниц-кий Е.М. и др. Исследование пристеночной
микрофлоры кишечника человека // ЖМЭИ. -2003. - № 1. - С. 60-63.
3. Корнеев М.Л., Воробьев А.А., Миронов А.Ю., Лыкина Е.В. Штаммовая общность пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта на биологической модели // Курский науч.-практ. вестн. "Человек и его здоровье". -2006.- № 2.- С. 18-24.
4. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. - М., 1975. - 295 с.
5. Эпштейн-Литвак Р.В., Вильшанская Ф.Л. Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника. / Методические рекомендации. - М., 1987. - 10 с.
6. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональнее питание, Грант. -1998. - 656 с.
УДК 502.3(478.9)
АНАЛИЗ ВСТРЕЧАЕМОСТИ КЛЕТОК С МИКРОЯДРАМИ В БУККАЛЬНОМ ЭПИТЕЛИИ И УРОВЕНЬ СЫВОРОТОЧНЫХ АНТИТЕЛ СРЕДИ ДЕТСКОГО И ВЗРОСЛОГО НАСЕЛЕНИЯ, ПРОЖИВАЮЩЕГО В РАЗЛИЧНЫХ РАЙОНАХ
ГОРОДА КИШИНЕВА
©Левински М.В., Калаев В.Н., Буторина А.К.
Центр превентивной медицины, Кишинев, Молдова;
*
кафедра генетики, цитологии и биоинженерии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета, Воронеж
E-mail: [email protected]
В связи с развитием промышленного и сельскохозяйственного производства, а также транспортных средств оценка генотоксичности среды крайне необходима для принятия экологически грамотных решений по охране среды и здоровья населения. Подобные исследования в Республике Молдова ранее не проводились, поэтому целью нашей работы явилось проведение таких исследований с использованием адекватных для ее реализации методов: микроядерного теста в буккальном эпителии у детей и определения иммунитета у лиц разных возрастных категорий к таким инфекционным заболеваниям, как дифтерия, корь, столбняк.
Проведены исследования генотоксичности окружающей среды в столице республики Молдова г. Кишиневе с использованием микроядерного теста в буккальном эпителии человека и выявлен уровень иммунного ответа людей к введению антител к кори, дифтерии и столбняку. Показано влияние антропогенного загрязнения на исследованные показатели. Выявлена связь между результатами микроядерного теста и состоянием иммунной системы у людей, проживающих в сходных экологических условиях.
Ключевые слова: микроядерный тест, буккальный эпителий, загрязнение среды, генотоксичность, иммунитет.
THE ANALYSIS OF THE CONTENTS OF CELLS WITH MICRONUCLEAR IN BUKKAL EPITELIUM AND THE LEVEL OF SERUM ANTIBODIES AMONG CHILDREN AND ADULT POPULATION LIVING IN VARIOUS AREAS OF CITY OF KISHINEV Levinsky M.V., Kalaev V.N., Butorina A.K.
The Center of Preventive Medicine of City, Kishinev, Moldova;
Genetics, Cytology & Bioengineery Department of the Biology-Ground Faculty of the Voronezh State University, Voronezh Due to the development of industry and agriculture, as well as transport the estimation of genotoxicity of the environment is extremely necessary for making ecologically competent decisions on the environment protection and population health. The similar researches in Moldova Republic haven't been carried out yet; therefore the purpose of our work was carrying out researches like these with the use of adequate methods for their realization: the micronuclear test in the bukkal epitelium of children and determining the immunity in persons of different age categories to some infectious diseases like diphtheria, measles, and tetanus.
We investigated the genotoxicity of environment in the capital of Moldova republic - city of Kishinev with the use of the micronuclear test in bukkal epitelium and the level of the immune answer was revealed in introducing antibodies to measles, diphtherias and to tetanus. The influence of anthropogenous pollution on the parameters investigated was shown. The connection between the results of the micronuclear test and the condition of immune system of people living in the similar ecological conditions was revealed.
Key words: the micronuclear test, bukkal epitelium, pollution of environment, genotoxicity, immunity.
С распадом СССР вопросы охраны здоровья населения и окружающей среды перешли в ведение властей вновь образованных независимых государств. Однако отсутствие значительных географических барьеров и интенсивные миграционные процессы привели к
тому, что данные проблемы уже не являются только внутренними для каждой отдельно взятой страны. Развитие промышленного и сельскохозяйственного производства, увеличение количества автотранспортных средств негативно сказываются на состоянии среды
обитания человека. Оценка генотоксичности среды крайне необходима для принятия грамотных решений по вопросам охраны природы и здоровья населения [3]. По мнению В.М. Захарова и А.Т. Чубинишвили [5]: "При всей важности оценки качества среды на всех уровнях, с применением различных подходов (включая физические, химические, социальные и другие аспекты), приоритетной представляется биологическая оценка", поскольку главным ключевым моментом для такой оценки является самочувствие, состояние различных видов живых существ и самого человека.
В такой ситуации получение интегральной оценки качества среды обитания, формирующегося при взаимодействии огромного числа разнообразных факторов, представляется наиболее важным.
В связи с вышеизложенным целью нашей работы явилось проведение комплексных исследований качества среды обитания с использованием микроядерного теста в бук-кальном эпителии у детей и определения некоторых параметров устойчивости иммунной системы у лиц разных возрастных категорий к дифтерии, кори, столбняку в крупном промышленном центре - столице Республики Молдова городе Кишиневе.
Выбор методов обусловлен тем, что мик-роядерный тест (в том числе в буккальном эпителии) в настоящее время широко используется для различных целей: оценки геноток-сичности химических веществ (в том числе лекарственных препаратов), степени стабильности генома, отражающей состояние организма, мутабельности факторов окружающей среды [1, 10, 11, 13, 20]. Микроядра -это дополнительные к ядру мелкие округлые хроматиновые структуры, которые появляются вследствие нарушений хромосомного аппарата делящейся клетки, основой которого являются молекулы ДНК. Такие нарушения могут быть спровоцированы как внешними, так и внутренними причинами, например различного рода заболеваниями. Образование микроядер служит показателем нестабильности генома, отражением протекающих в клетках мутаций [7].
Обзору результатов исследований популяции человека с использованием цитогенетических биомаркеров, к которым относятся
и микроядра, посвящена публикация Bonassi и соавт. [15]. Из числа стран, бывших республиками Советского Союза, такие исследования проводились и проводятся в России [7, 2], Армении [1, 12], на Украине [13, 14], в Казахстане [18].
Уже к концу XX века был разработан "Микроядерный проект" для международного сотрудничества по использованию микро-ядерного теста для оценки повреждений ДНК человека [17]. Поскольку в Молдове работы по использованию микроядерного теста проводятся впервые, их можно рассматривать как определенный вклад в такое сотрудничество.
Эффективность работы иммунной системы является одним из важнейших параметров, определяющих состояние всего организма. По некоторым данным [8], состояние иммунной системы напрямую оказывает влияние на частоту аберрантных клеток, в том числе и клеток с микроядрами. Поэтому установление уровня иммунной реакции на некоторые инфекционные агенты на исследуемых территориях позволит выявить не только прямые эффекты генотоксикантов на генетический аппарат, приводящие к формированию микроядер, но и эффекты загрязнения, вызывающие подавление иммунной системы организма и приводящие к неспособности иммунокомпетентных клеток распознавать и элиминировать генетически поврежденные клетки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Оценка генотоксичности среды проводилась нами в 6 районах г. Кишинева, различающихся по степени антропогенного загрязнения. Наиболее загрязненными районами, по данным [16, 19], в г. Кишиневе являются Центр и Чокана. Здесь сконцентрировано наибольшее количество промышленных предприятий города (винные заводы, фармацевтическая и мебельная фабрики, фабрика строительных материалов, стекольный завод и другие). В выбросах промышленных предприятий зарегистрировано свыше 36 химических соединений, из которых 5 относятся к 1 и 2 классам опасности. Основные загрязнители: неорганическая пыль (превышение ПДК в
4-5 раз), формальдегид (превышение ПДК в 4,5-6 раз), оксид (NO) и диоксид (Ы02) азота (превышение ПДК в 8 раз) и озон (превышение ПДК в 1,5-2 раза). Районы Ботаника и Телецентр - среднезагрязненные с примерно тем же составом загрязнителей, среди которых неорганическая пыль (превышение ПДК в 2-3 раза), формальдегид (превышение ПДК в 2-4 раза), оксид (N0) и диоксид (Ы02) азота (превышение ПДК в 4,5-6 раз) и озон (превышение ПДК в 1,5 раза). Районы Малая Малина и Буюкань выбраны в качестве контроля как относительно чистые территории, находящиеся вдали от крупных автодорог и промышленных предприятий. Превышение ПДК не отмечалось, за исключением неорганической пыли, содержание которой в атмосферном воздухе превышает допустимую норму в 1,5 раза.
Микроядерный тест в буккальном эпителии детей в возрасте 4-6 лет проводили в 5 дошкольных учреждениях. Группы мальчиков и девочек формировали из здоровых, не принимающих лекарственные препараты детей. Выбор детей данной возрастной группы обусловлен тем, что дети наиболее чувствительны к различного рода средовым воздействиям, и тем, что с возрастом частота спонтанно возникающих в клетках микроядер возрастает. Всего пробы буккального эпителия были взяты у 86 детей. От каждого обследованного ребенка анализировали по 1000 клеток. Изготовление микропрепаратов осуществляли по методике Нерсесяна с соавт. [12], на препаратах учитывали отношение количества микроядер к общему числу ядросодержащих клеток (в %о).
Поскольку эффективность работы иммунной системы является одним из важнейших параметров, определяющих состояние всего организма, мы проводили ее оценку у людей разных возрастных категорий (от 5 до 60 лет), проживающих в тех же районах, что и обследованные дети.
Исследования состояния иммунитета по таким параметрам, как продукция антител к инфекционным заболеваниям (дифтерии, столбняку, кори) после вакцинации и устойчивость к этим заболеваниям, осуществляли по стандартной методике. Всего было обследовано 310 человек и на базе поликлиник сделано 930 анализов показателей крови.
Нами были выделены группы лиц с максимальным уровнем антител к кори (титр антител 1:80), к дифтерии (8,0 МЕ/мл), к столбняку (25,6 МЕ/мл), средним титром антител к кори (от 1:10 до 1:40), к дифтерии (от 0,5 МЕ/мл до 4,0 МЕ/мл), к столбняку (от 0,1 МЕ/мл до 6,4 МЕ/мл) и низким титром антител к дифтерии (от 0,03 МЕ/мл и ниже), к столбняку (от 0,005 МЕ/мл и ниже) и с отсутствием антител к кори.
Статистическую обработку данных проводили на ПЭВМ с помощью пакета статистических программ "Stadia". Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе Кулаичева [7]. Так как частота встречаемости микроядер - признак, для которого характерно отличное от нормального распределение, то проводили сравнение выборок не по средним арифметическим, а по медианам (Ме), которые в данном случае являются более точным показателем. Поэтому мы использовали непараметрическую статистику. Сравнение выборок по частоте встречаемости микроядер в эпителиоцитах ротовой полости детей осуществляли по X-критерию рангов Ван-дер-Вардена. Влияние района исследований на встречаемость клеток с микроядрами в буккальном эпителии определяли с использованием однофакторного непараметрического дисперсионного анализа Крускалла-Уоллиса. Связь между загрязнением района и уровнем титра антител в крови людей выявляли с использованием таблиц сопряженности при помощи критерия хи-квадрат.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Данные по частоте встречаемости клеток с микроядрами у детей, проживающих в районах г. Кишинева с разной степенью антропогенного загрязнения, представлены в табл. 1.
Дисперсионный анализ позволил выявить влияние района проживания на встречаемость микроядер как у мальчиков (p<0,001), так и у девочек (p<0,01), а также при анализе данных без разделения по половому признаку (p<0,001). Максимальное число клеток с микроядрами отмечается у детей, проживающих в наиболее загрязненном районе (Центр + Чокана) - 3,11±0,24%о; наименьшее - в "чис-
Таблица 1
Встречаемость клеток с микроядрами (в %) у детей, проживающих в различных районах
г. Кишинев
Район исследований
Центр + Чокана Ботаника + Телецентр Малая Малина
Число обследованных детей мальчики 14 21 б
девочки 12 27 б
%о клеток с микроядрами мальчики 3,00±0,40 Me = 3,00 2,7±0,19 Me = 3,00* 0,б0±0,1б Me = 1,00**
девочки 3,25±0,25 Me = 3,00 2,8±0,19 Me = 3,00* 1,5±0,31 Me = 1,00**
мальчики + девочки 3,11±0,24 Me = 3,00 2,8±0,13 Me = 3,00* 1,05±0,20 Me = 1,00**
Обозначения:
* - различия с районом Центр и Чокана достоверны (р<0,001);
** - различия со всеми обследованными районами достоверны (р<0,001).
том" (Малая Малина) - 1,05±0,20%; промежуточное положение занимает среднезагряз-ненный район - Ботаника (уровень клеток с микроядрами у детей, проживающих в нем, составил 2,80±0,13%о). Различия по частоте встречаемости клеток с микроядрами в бук-кальном эпителии детей между районами достоверны (p<0,001), причем отмечаются они при сравнении районов по встречаемости эпителиоцитов с микроядрами как у мальчиков, так и у девочек.
Различий во встречаемости клеток с микроядрами в буккальном эпителии у детей разного пола не выявлено. Частота клеток с микроядрами у мальчиков составила -2,3±0,19%о (Me=2,00%o), у девочек -2,55±0,15%% (Me=3,OO%0).
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о высокой генетической нестабильности, отмечаемой в соматических клетках детей, проживающих в районе Чокана, и меньшей нестабильности - в районе Малая Малина города Кишинева.
Согласно нашим данным, генотоксич-ность среды в районах Ботаника - Телецентр более чем вдвое превышает таковую в экологически благополучном районе Малая Малина, а в районах Центр - Чокана - более чем втрое.
Таким образом, результаты микроядерно-го теста позволяют судить о степени нарушения генетического гомеостаза организмов, а
следовательно, и о степени генотоксичности окружающей среды.
Дети дошкольного возраста - наиболее чувствительная группа населения, у которых иммунитет как защитная система организма сформирован еще недостаточно. Наличие у них в клетках генетических нарушений (свидетельством чему является присутствие микроядер) служит индикатором стресса и недостаточной способности иммунной системы элиминировать подобные нарушения. Для подтверждения предположения о нарушениях функционирования иммунной системы у лиц, проживающих на загрязненных территориях, и их влиянии на количество клеток с микроядрами в буккальном эпителии детей, мы провели исследования некоторых иммунологических показателей у людей, проживающих в районах г. Кишинева.
Данные о числе людей с разными значениями титра антител к кори, столбняку и дифтерии представлены в табл. 2. Результаты статистического анализа свидетельствуют, что имеет место связь между уровнем загрязненности района и частотой встречаемости людей с высоким, средним и низким титром антител к дифтерии (p<0,05) и кори (p<0,01). Связь между уровнем загрязнения района и встречаемостью людей с разным титром антител к столбняку не выявлена. В сильно- и среднезагрязненном районах по сравнению с экологически " чистым" районом отмечается увеличение числа лиц с минимальным титром
Таблица 2
Встречаемость людей (в % (абс. число)) с разным уровнем титра антител к дифтерии (МЕ/мл), к столбняку (МЕ/мл) и к кори (титр антител) в районах г. Кишинева с разным уровнем
антропогенного загрязнения
Дифтерия Столбняк Корь
Высо- кий титр Сред- ний титр Мини- Мини- Отсут- ствие антител
маль- ный титр Высокий титр Средний титр маль- ный титр Высокий титр Средний титр
Чокана 55% 27% 18% 78% 20% 2% 11% 47% 42%
(55) (27) (18) (78) (20) (2) (11) (47) (42)
Ботани- б0% 27,78% 12,22% 77,78% 20% 2,22% б,бб7% 38,89% 54,44%
ка (54) (25) (11) (70) (18) (2) (2) (35) (49)
Буюка- 4б,б% 42,5% 10,83% 70,83% 27,5% 1,бб7% 20% 48,33% 31,б7%
ны (5б) (51) (13) (85) (33) (2) (24) (58) (38)
антител. В экологически "чистом" районе чаще встречаются люди со средними значениями титра антител. Эта тенденция прослеживается по всем трем инфекционным заболеваниям. В сильно- и среднезагрязненном районах по сравнению с " чистым" отмечается также рост числа людей с высоким титром антител к дифтерии и столбняку и снижение их числа при анализе иммунитета к кори. Таким образом, можно говорить, что в условиях значительного антропогенного загрязнения наблюдается рост числа лиц с минимальным
и, по отдельным инфекциям, с максимальным титром антител к вышеперечисленным инфекциям. На экологически "чистых" территориях больше людей со средними значениями титра антител в крови.
Полученные результаты можно объяснить тем, что в условиях антропогенного загрязнения иммунная система организма людей находится в "напряженном" состоянии. У некоторых лиц она подавлена (у них отмечается минимальный титр антител), у других иммунная система реагирует на возрастание антропогенного загрязнения выраженным иммунным ответом (высокий титр антител). Значительное "напряжение" иммунной системы может привести к "срыву" нормального иммунного статуса организма, возникновению аллергических реакций и повышенной восприимчивости к инфекционным заболеваниям.
Таким образом, связь между результатами микроядерного теста и состоянием иммунной системы у людей, проживающих в сходных
условиях, отмеченная ранее [6], подтвердилась и нашими исследованиями.
Использованный нами комплексный подход к оценке генотоксичности среды в районах г. Кишинева, реализованный путем проведения микроядерного теста в буккальном эпителии и определения состояния иммунной системы, показал совпадение результатов и возможность получения более корректной оценки состояния среды, что следует учитывать при планировании мероприятий по охране природы и здоровья человека. Принимая во внимание совпадение оценок состояния среды, полученных с помощью 2-х вышеуказанных методов, и то, что микроядра образуются в результате не всех типов цитологических аномалий, а, по крайней мере, половины из них, руководствуясь предлагаемой В.М. Захаровым [4] шкалой балльной оценки цитогенетического гомеостаза, мы характеризуем генотоксичность окружающей среды в наиболее загрязненных районах г. Кишинева как среднюю. Это соответствует средней степени генетического риска для людей, обусловленного качеством среды проживания.
ЛИТЕРАТУРЫ
1. Арутюнян Р.М., Туманян Э.Р., Ширинян Г.С. Анализ микроядер в слизистой ротовой полости для оценки цитогенетического эффекта загрязнителей среды // Цитология и генетика. - 1990. - Т. 24, № 2. - С. 57-60.
2. Буторина А.К., Калаев В.Н., Карпова С.С. Цитогенетические эффекты антропогенного загрязнения у детей, проживающих в различных районах г. Воронежа // Вестник Воро-
