CC BY
18
Б1ОЛОГ1Я
© Воейкова Д. О., Кондро М. М., Савчук О. М., Остапченко Л. I. УДК 577.121.9+576.7+57.023
1Воейкова Д. О., 2Кондро М. М., 1Савчук О. М., 1Остапченко Л. I.
АНАЛ1З ВМ1СТУ Б1ЛКОВИХ ФРАКЦ1Й ГЕПАТОЦИТ1В ЗА УМОВ МОДЕЛЮВАННЯ Д1СТ-1НДУКОВАНОГО СТЕАТОГЕПАТОЗУ У ЩУР1В
1Кш'вський нацiональний ушверситет iMeHi Тараса Шевченка (м. КиГв) 2Львiвський нацiональний медичний ушверситет iMeHi Данила Галицького (м. Львiв)
Робота виконана в рамках науково-дослщно! теми «Механiзми реалiзацiI адаптацмно-компенса-торних реакцiй органiзму за умов розвитку рiзних патологiй» (№ державно! реeстрацiI 0104и009878) ННЦ «1нститут бiологiI», Ки!вського нацiонального унiверситету iменi Тараса Шевченка.
Вступ. Надмiрне споживання багато! на вугле-води та жири ш, низька фiзична активнiсть поряд з порушенням самого режиму харчування та гене-тична схильнють сприяють накопиченню не лише надлишково! ваги, а i розвитку шших патологiй ор-ганiв i систем [5,7,8]. Серед найбтьш поширених е неалкогольна жирова хвороба печiнки (НЖХП) або стеатогепатоз, розвиток якого спричинюе зниження функцюнально! активностi печiнки, як найбтьш ме-таболiчно активного органу [5].
Наразi точний механiзм розвитку цього патоло-гiчного процесу не встановлений. На сьогоды, вису-нуто лише гiпотезу про двоетапнiсть розвитку НЖХП, за якою значне пщвищення рiвня циркулюючих три-глiцеридiв на ранньому етап слугуе фактором запуску розвитку стеатогепатозу. Згодом результатом накопичення лтщв в гепатоцитах стае балонна дис-трофiя, некроз та апоптоз, який стимулюе розвиток запального процесу [3,13,14]. Запальний процес у гепатоцитах призводить до поглиблення патологи, результатом чого стае порушення, а згодом i повна втрата, функцюнально! активной всього органу. Одыею з ознак таких структурно-функцюнальних змiн е ктьюсы та якiснi змiни пулу бтюв, якi з розви-тком захворювання лише зростають. Найбiльш не-безпечним для хворих на НЖХП е останн етапи, якi характеризуются розвитком фiброзу i повною або частковою втратою функцюнально! активностi органу. Саме тому, доогмдження розподту бiлкiв цитозо-лю вiдповiдно до молекулярно! маси та змiни вмюту !х у фракцiях може слугувати бiомаркером ураження печiнки. 1дентифкацп екскреторних бтюв у фрак-цiях та визначення динамки змш рiвня цих бтюв у сироватц кровi дозволить використовувати зазна-ченi показники для кращого розумiння, як мехаыз-мiв розвитку стеатогепатозу, так i може служити дiа-гностичним показником [5,8].
МеТОЮ роботи було ДоСЛЩИТИ ЗМЫМ BMiCTy основних бiлковоI фракцiI гепатоципв щурiв за умов розвитку стетогепатозу пщ впливом висококалорй но! дiети.
Об'ект i методи досл1дження. Дослщи проводили на бiлих нелiнiйних щурах масою 180-200 г Вщ початку експерименту щурiв роздiляли на контроль-ну i дослiдну групи. Контрольну групу тварин утри-мували на стандартному рацюы, а дослщну на ви-сококалорiйнiй дiетi #C11024 (Research Diets, New Brunswick, NJ) упродовж 18 тижнiв. Щоденно прово-дився контроль споживання корму та раз на тиждень проводили зважування тварин обох груп. За контр-ольнi точки для оцiнки динамки були вибран 3, 6, 9, 12, 15 i 18 тижы. Попереднi дослiдження показали, що утримання на данм дiетi призводить до розвитку стеатогепатозу [4].
Морфолопчно та функцюнально Ытакты клiтини печiнки було отримано згщно модифiкованого неферментативного методу видтення гепатоцитарно! фракцiI клггин печiнки за Петренко А. Ю. зi спiвав. [1]. Аналiз складу бтюв гепатоци^в здiйснювали з використанням методу електрофоретичного роз-дтення у полiакриламiдному гелi (ПААГ). Електро-форез проводили за методом Laemmli у 10% ПААГ з додецилсульфатом натрт (ДДС-Na) [10].
Проведення експерименту здмснювалось iз дотриманням принципiв бюетики, що викладенi у Хельсинськiй декларацп ВсесвiтньоI медично! асощ-ацiI про гуманне ставлення до тварин, а також згщно до Закону Укра!ни «Про захист тварин вщ жорстоко-го поводження» вiд 15.12 2009 р. № 1759-VI та «За-гальних етичних принцитв експериментiв на твари-нах» (Ки!в, 2001).
Статистичну обробку результа^в дослiдження проводили загальноприйнятими методами вар^ ацмно! статистики. Для статистично! обробки па-раметричних даних був використаний t-критерм Ст'юдента для незалежних вибiрок [2].
Результати дослщження та Ух обговорення. У контрольнiй групi тварин бiлки гепатоцитiв роздти-лися на 24 фракци, що узгоджуеться з лггературни-ми даними про юльюсний розподiл бiлкiв гепатоци-
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
* * I *
II I, II I, . I. I,
111111
112-26 128-55
166-107 1108-195
1213-289
Контроль
Зтнжш
бтижшв
9 ТНЖШБ
12тижшв
15тижшв
18тнжшв
Рис. BMicT бiлкових фракцiй у гомогенат гепатоцитiв щурiв за умов розвитку AieT-iHAyKOBaHoro стеатогепатозу
(M±m, n=10).
Прим1тки: * — р<0,05 (у nopiBHqHHi з контрольною групою).
TiB щурiв [6]. У нашiй робот фракцií були об'eднанi вiдповiдно до молекулярно! маси (м.м.) на низько-молекулярнi 12-26 кДа, середньомолекулярнi 2855, 66-107 кДа i високомолекулярш 108-195 i 213289 кДа (рис.). Встановлено, що за умов розвитку дieт-iндукованого стеатогепатозу розподiл бтюв ге-патоцитiв змiнювався. Так, на 15 i 18 тижнi з'явились три додатковi фракцií, двi з яких з м.м. 49 i 78 кДа належать до середньомолекулярних i одна з м.м. 249 кДа - до високомолекулярних бiлкiв.
Починаючи з 3 тижня експерименту значно пщ-вищився, а саме на 44% (р<0,05), вмют фракцií низькомолекулярних бiлкiв (м.м. 12-26 кДа). Також, на 32% (р<0,05), пщвищився вмiст бiлкiв у фрак-цií високомолекулярних бiлкiв (м.м. 213-289 кДа). Поряд з цим, вмют фракцп середньомолекулярних бтюв (м.м. 66-107 кДа) знизився на 30% (р<0,05), а у шших фракцiях достовiрних змiн не спостер^а-лось. На 6 тижш розвитку НЖХП пщвищилась на 48% (р<0,05) лише фракщя високомолекулярних бiлкiв. При цьому на 9 тижш експерименту на 31%( р<0,05) пiдвищився вмiст низькомолекулярних бтюв i на 20% (р<0,05) знизився рiвень середньомолекулярних бiлкiв. Вмют ^ших фракцiй бiлкiв достовiрно не змшювався.
Починаючи з 12 тижня розвитку патологи спо-стерiгались зм^и вмiсту у всiх бiлкових фракщях, а саме спостерiгалось значне пад^ня вмiсту у фрак-цiях середньомолекулярних i високомолекулярних бiлкiв, поряд з пщвищенням рiвня низькомолекулярних бтюв. Так, рiвень фракцiй з м.м. 28-55, 66-107, 108-195 i 213-289 кДа знизився на 45% (р<0,05), 54% (р<0,05), 93% (р<0,05) i 182% (р<0,05), вщпо-вiдно. При цьому вмют бтку у фракцп з м.м. 12-26 кДа пщвищився на 96% (р<0,05). Таю зм^и вмюту бiлку у фракцiях цитозольних бтюв можуть вказу-
вати на переб^ деградацiйних процесiв, при яких утворюеться велика кiлькiсть низькомолекулярних фрагмент у вiдповiдь на розвиток стеатогепатозу [9,12,14].
У щурiв, якi знаходились на висококалормшй дiетi протягом 15 тижшв, вiдбувалось аналогiчне зниження рiвня середньомолекулярних i високомолекулярних бтюв, при супутньому пiдвищеннi низькомолекулярних. Так, вмют фракцп з м.м. 66-107 кДа знизився на 66% (р<0,05), фракцп з м.м. 108195 кДа - на 21% (р<0,05), а фракцп з м.м. 213-289 кДа - на 153% (р<0,05). Рiвень бтюв у фракцп з м.м. 12-26 кДа пщвищився на 38% (р<0,05), що також е свщченням пщвищення деградацп бтюв цитозолю у вiдповiдь на посилену акумуляцю триглiцеридiв.
На 18 тижш розвитку стеатогепатозу спостер^а-еться пщвищення вмюту фракцп низькомолекулярних бтюв з м.м. 12-26 кДа на 26% (р<0,05) i фракцií високомолекулярних бтюв з м.м. 213-289 кДа на 119% (р<0,05). При цьому вмют середньомолекулярних бтюв продовжував знижуватись: фракцiя з м.м. 28-55 кДа - на 20% (р<0,05) i у фракцií з м.м. 108-195 кДа на 39% (р<0,05). Встановлеш змiни рiв-нiв гепатоцитарних бтюв корелюють з ранiше вста-новленими даними про розвиток стеатогепатозу за умов утримання щурiв на висококалормшй дiетi [6].
Висновки. Виявлено, що за умов розвитку д^ етчндукованого стеатогепатозу, змiнюеться вмiст бтюв гепатоцитiв, а також спостерiгаеться поява додаткових бткових фракцiй на 15 i 18 тижнях. Встановлено, що вмют фракцм низькомолекулярних бтюв пiдвищуеться поряд зi зниженням вмюту се-редньо- i високомолекулярних бтюв, що корелюе з попередньо встановленим ступенем розвитку стеатогепатозу зi значною акумуляцiею у цитозолi гепа-тоцитiв включень триглiцеридiв.
Перспективи подальших дослiджeнь. Вста-новлен нами данi показують пряму кореляцю мiж змiнами пулу бiлкiв гепатоци^в та ступенем розви-тку жирово! Ыфтьтраци печiнки. Саме тому, наши по-дальшi дослiдження будуть спрямован на щентиф^
кацiю бiлкiв, як належать до цих фракцiй вщповщно до молекулярно! маси. Це дозволить з'ясувати, як деяк внутрiшньоклiтиннi мехаызми розвитку сте-атогепатозу, так i дозволить розробити ефективнi схеми лкування даного захворювання.
Лiтeратура
1. Петренко А.Ю. Выделение гепатоцитов крыс не ферментативным методом: детоксикационная и дыхательная активности / А.Ю. Петренко, А.Н. Сукач, А.Д. Росляков // Биохимия. - 1991. - Т. 56, № 9. - С. 1647-1650.
2. Плохинский Н.А. Методические консультации по биометрии / Н.А. Плохинский // Проблемы современной биометрии. -М.: МГУ, 1981. - С. 30-50.
3. Angulo P. Liver fibrosis, but no other histologic features, is associated with long-term outcomes of patients with nonalcoholic fatty liver disease / P. Angulo, D.E. Kleiner, S. Dam-Larsen [et al.] // Gastroenterology. - 2015. - Vol. 149. - P. 389-397.
4. Bodnar P. Diagnosis of experimental stetohepatosis using ultrasound shearwave elastography / P. Bodnar, O. Dynnyk, G. Myhalchyshyn [et al.] // Current Issues in Pharmacy and Medical Sciences. Editorial Article. - Lublin. - 2013. - Vol. 26 (1). - Р. 109-113.
5. Day C.P. Non-alcoholic steatohepatitis (NASH): where are we now and where are we going? / C.P. Day // Gut. - 2002. - Vol. 50.
- P. 585-588.
6. 6. Fountoulakis M. Proteomic analysis of the rat liver / M. Fountoulakis, L. Suter // Journal of Chromatography B. - 2002. - Vol. 782. - Р. 197-218.
7. Gusdon A.M. Nonalcoholic fatty liver disease: pathogenesis and therapeutics from a mitochondria - centric perspective / A.M. Gusdon, K. Song, S. Qu // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2014. - Vol. 2014. - P. 1-20.
8. James O. Steatohepatitis: a tale of two «hits»? / O. James, C. Day // Gastroenterology. - 1998. - Vol. 114. - Р. 842-845.
9. Kirpich I. Integrated hepatic transcriptome and proteome analysis of mice with high-fat diet-induced nonalcoholic fatty liver disease / I. Kirpich, L. Gobejishvili, M. Homme [et al.] // The Journal of Nutritional Biochemistry. - 2011. - Vol. 22 (1). - Р. 1-19.
10. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage / U.K. Laemmli // Nature. - 1970.
- P. 680-685.
11. Li L. Proteomic analysis of liver mitochondria from rats with nonalcoholic steatohepatitis / L. Li, D.Z. Lu, YM. Li [et al.] // World Journal of Gastroenterology. - 2014. - Vol. 20 (16). - P. 4778-4786.
12. Okediran B.S. Alterations in the lipid profile and liver enzymes of rats treated with monosodium glutamate / B.S. Okediran, A.E. Olurotimi, S.A. Rahman [et al.] // Sokoto Journal of Veterinary Science. - 2014. - Vol. 12, № 3. - P. 42-46.
13. Rolo A.P. Role of oxidative stress in pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis / A.P. Rolo, J.S. Teodoro, C.M. Palmeira // Free Radical Biology and Medicine. - 2012. - Vol 52. - P. 59-69.
14. Singh S. Fibrosis progression in nonalcoholic fatty liver vs nonalcoholic steatohepatitis: a systematic review and meta-analysis of paired-biopsy studies / S. Singh, A.M. Allen, Z. Wang [et al.] // Clinical Gastroenterology and Hepatology. - 2015. - Vol. 13 (4).
- P. 643-654.
УДК 577.121.9+576.7+57.023
АНАЛ1З ВМ1СТУ Б1ЛКОВИХ ФРАКЦ1Й ГЕПАТОЦИТ1В ЗА УМОВ МОДЕЛЮВАННЯ ДЮТ-ШДУКОВА-НОГО СТЕАТОГЕПАТОЗУ У ЩУР1В
Воейкова Д. О., Кондро М. М., Савчук О. М., Остапченко Л. I.
Резюме. Охарактеризовано низько-, середньо- та високомолекулярн гепатоцитарн фракци бтюв за умов розвитку дiет-iндукованого стеатогепатозу у щурiв. Бiлковi фракци були роздтеы за допомогою елек-трофорезу за методом Laemmli у градiентi ПААГ з додецилсульфатом натрю. Спостеркалось значне пщ-вищення вмюту фракци низькомолекулярних бтюв починаючи з 9 тижня утримання на ВКД, що супрово-джувалось значним зниженням фракци високомолекулярних бтюв. Отриман дан свщчать про порушення структурно-функцюнального стану гепатоци^в за умов розвитку дiет-iндукованого стеатогепатозу. Ключовi слова: висококалормна дiета, бiлковi фракци, стеатогепатоз.
УДК 577.121.9+576.7+57.023
АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ ГЕПАТОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ДИЕТ-ИНДУЦИРОВАННОГО СТЕАТОГЕПАТОЗА У КРЫС
Воейкова Д. А., Кондро М. М., Савчук А. Н., Остапченко Л. И.
Резюме. Охарактеризованы низко-, средне- и высокомолекулярные гепатоцитарные фракции белков при развитии диет-индуцированного стеатогепатоза у крыс. Белковые фракции были разделены с помощью электрофореза по методу Laemmli в градиенте ПААГ с использованием додецилсульфата натрия. В условиях диет-индуцированного стеатогепатоза наблюдалось значительное повышение содержания фракции низкомолекулярных белков, начиная с 9 недели содержания на ВКД, что сопровождалось параллельным снижением фракции высокомолекулярных белков. Полученные данные свидетельствуют о нарушении структурно-функционального состояния гепатоцитов в условиях развития диет-индуцированного стеато-гепатоза.
Ключевые слова: высококалорийная диета, белковые фракции, стеатогепатоз.
UDC 577.121.9+576.7+57.023
ANALYSIS OF HEPATOCYTES PROTEIN FRACTIONS UNDER DIET-INDUCED STEATOHEPATOSIS IN RATS
Voieikova D. O., Kondro M. M., Savchuk O. M., Ostapchenko L. I.
Abstract. Excessive intake of carbohydrates and fats, low physical activity, violations of diet and genetic predisposition contribute not only obesity, but also other pathologies of organs and systems. The most common manifestation of basal metabolism disorders is nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) or steatohepatosis which results in the decrease of functional activity in the liver. Today, NAFLD is characterized as a two-step process which begins with a significant increase of serum triglycerides. The result of lipid accumulation in hepatocytes is balloon degeneration, necrosis, and apoptosis which, in turn, causes the development of inflammation. Inflammation in hepatocytes leads to the deepening of pathology, resulting in the development of pathological changes and later a full loss of functional activity of the whole liver. One indication of these structural and functional changes is qualitative and quantitative changes in protein pool, the appearance of which enhances the development of steatohepatosis. Therefore, study of cytosol proteins distribution according to molecular weight and content changes in these fractions can serve as a biomarker of liver damage. Identification of excretory proteins in fractions and determination of dynamic changes of these proteins in serum will allow using these parameters for better understanding the mechanisms of steatohepatosis and can serve as a diagnostic measure.
The aim of this study was to investigate the changes in protein content of the main fractions of rat hepatocytes under conditions of steatohepatosis caused by high-caloric diet.
Experiments were performed on white nonlinear rats weighing 180-200 g. The control group of animals was kept on a standard diet and the experimental group was kept on the high-caloric diet # C11024 (Research Diets, New Brunswick, NJ) for 18 weeks. Morphologically and functionally intact hepatocytes were received by a modified non-enzymatic method (Petrenko A. et al.) of the hepatocytes fractions allocation. Electrophoresis was performed by the method of Laemmli et al. in 10% PAGE of sodium dodecyl sulfate (SDS-Na).
In the control group of animal's hepatocytes proteins were divided into 24 fractions, which is conformed with the literature about quantitative distribution of proteins in rat hepatocytes. Thus, starting 3 weeks of keeping on high-caloric diet, there was increase content of low (12-26 kDa) and high (213-289 kDa) protein, while medium (66-107 kDa) proteins was decrease. Other factions didn't show any significant changes. After 6 weeks of the experiment, 213-289 kDa fraction increased by 48% (p <0.05), with no significant changes in content from other factions. At the same time, low molecular weight proteins increased by 31% (p <0.05) at 9 weeks, and middle molecular weight protein decreased by 20% (p <0.05). The content of other protein fractions did not significantly change.
After 12 weeks of the pathology development, a significant decline of protein content in fractions of middle and high molecular weight proteins was observed, along with the decreased levels of the low molecular weight proteins. Such changes of protein content may indicate the degradation processes development when a large quantities of low molecular weight fragments produce in response to the development of steatohepatosis. At 15 weeks, the experimental group of rats showed a similar decline in middle and high molecular weight proteins but it was accompanied by the increase of low molecular weight proteins. After 18 weeks of keeping high-caloric diet, low and high proteins were increased, along with the decrease of medium molecular proteins.
The changes of hepatocytes protein content were observed under the conditions of the diet-induced steatohepatosis development. It was found out, that the content of low molecular weight proteins fractions increased along with the reduction of medium- and of high protein, which correlates with the level of the development of the preliminary stated steatohepatosis with significant accumulation of triglycerides particles in the cytosol hepatocytes.
Keywords: high caloric diet, protein fraction, steatohepatosis.
Рецензент — проф. Непорада К. С.
Стаття надшшла 10.10.2016 року
