CC BY
62
химия
Вестн. Ом. ун-та. 2010. №4. С. 115-119.
УДК 543.422
А.С. Шелпакова, И.В. Власова,
Омский государственный университет им. Ф. М. Достоевского
Е.Н. Масякова
ГНУ Сибирский НИИ птицеводства Росселъхозакадемии (г. Омск)
АНАЛИЗ ВИТАМИННЫХ СМБСБЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАЗНЫХ ВАРИАНТОВ МЕТОДА МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛИНЕЙНОЙ РЕГРЕССИИ*
Метод множественной линейной регрессии (МНР) пригоден для спектрофотометрического определения 4-6 водорастворимых витаминов в их смесях. Точность результатов анализа одних и тех же смесей выше при использовании варианта непрямой градуировки. В этом варианте метод МЛР может быть применен и к анализу неаддитивных смесей, в том числе поливитаминных материалов (премиксов) без разделения индивидуальных витаминов.
Ключевые слова: спектрофотометрический анализ, множественная линейная регрессия, анализ витаминных смесей, премиксы.
Аналитический контроль содержания витаминов в пищевых продуктах, кормах и поливитаминных добавках к кормам (премиксах) -весьма сложная задача. Содержание отдельных витаминов в таких объектах, как правило, определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Однако даже лучшие методики такого типа пока не позволяют определять все витамины, присутствующие в пробе. Так, анализ премиксов, содержащих одновременно до 14 витаминов, ведут по ГОСТ 50929-96 [1], который позволяет определять только три витамина - Е>1, ЕЬ и В5. Актуальной проблемой является определение гораздо большего числа (желательно всех) витаминов. Разрабатываемые методики должны быть экспресны, экономичны и при этом обеспечивать приемлемую точность результатов анализа.
Хорошей альтернативой методу ВЭЖХ является спектрофотометрический анализ неразделенных смесей. В этом случае используют такие хемометрические алгоритмы, метод множественной линейной регрессии (МЛР) и метод проекции на латентные структуры (РЬБ). В ходе исследований, проводимых на кафедре аналитической химии ОмГУ им. Ф.М. Достоевского, показано, что применение УФ спектро-фотометрии в сочетании с МЛР или РЬЭ позволяет одновременно и раздельно определять до 6 органических соединений [2,3]. Более мощным является метод РЬЭ, однако препятствием к его широкому применению в контрольно-аналитических лабораториях является необхо-
* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования РФ, в рамках госконтрак-таП 1103 от 26.08.2009
©А.С. Шелпакова, И.В.Власова, Е.Н. Масякова, 2010
димость приобретения специальных лицензионных программ (например, Unscrambler), стоимость которых весьма высока, а сами программы не русифицированы. Однако метод PLS может быть заменен более простым методом MAP, а реализовать соответствующие алгоритмы можно с помощью доступных пакетов типа Microsoft Excel или Matlab.
Цель данной работы - изучение возможности применения разных вариантов метода МАР к спектрофотометрическому анализу премиксов. Вариант с использованием коэффициентов поглощения, вычисленных по спектрам индивидуальных соединений (прямая градуировка), далее будем именовать MAPI. Вариант с вычислением коэффициентов по спектрам модельных смесей точно известного состава (непрямая градуировка) обозначим как МЛР2.
Реальными объектами анализа были премиксы для сельскохозяйственной птицы, образцы которых, а также данные по их составу были предоставлены Сибирским НИИ птицеводства. Модельные объекты представляли собой растворы смесей витаминов с соотношением компонентов, приблизительно отвечавшим составу премиксов. В качестве объектов определения были выбраны витамины В1, В2, ВЗ, В5, Вб, КЗ. Методики приготовления растворов индивидуальных соединений и модельных смесей изложены в статье [2], методика извлечения витаминов из премиксов - в статье [3]. Было приготовлено несколько десятков модельных смесей витаминов (водных растворов), состав которых либо отвечал номинальному составу премиксов (табл. 1), либо по одному или нескольким компонентам отличался от него, но не более чем на 20 % отн. Спектры поглощения таких смесей регистрировали с постоянным шагом (обычно 0,2 нм) на спектрофотометре СФ-2000 в кварцевых кюветах (1 см), в диапазоне 200-500 нм. В качестве раствора сравнения использовали 0,01 М НС1. Прецизионность измерений в диапазоне значений оптической плотности 0,1-0,8 характеризуется коэффициентом вариации (W) порядка 0,5 %.
Проверка на аддитивность по методике [4] показала, что при всех изученных концентрационных соотношениях 4-компонентные смеси витаминов являются аддитивными. Важно отметить, что вкла-
ды разных витаминов в суммарную оптическую плотность любой 4-компонентной смеси близки, в отличие от смесей более сложного состава. Для 5-6-компонентных модельных смесей отклонения от аддитивности (АА), наблюдавшиеся в некоторых участках спектра, были статистически достоверны. Установить закономерную связь между величиной ДА и составом модельных смесей пока не удалось, но можно предположить, что статистически значимые отклонения от аддитивности вызваны невыполнением основного закона светопоглощения для тех витаминов, относительные содержания которых были очень малы.
Таблица 1 Составы некоторых модельных смесей
Число витаминов в смеси Кони ентрации витаминов, мкг/мл
В1 В2 ВЗ В5 В6 КЗ
4 1,0 1,2 - 7,0 1,7 -
5 1,3 3,2 - 16 2,2 1,1
6 1,1 2,6 4,4 14 1,8 0,9
В работах [2,6] было показано, что с применением МЛР1 витамины в аддитивных 4-компонентных смесях определяют с погрешностями порядка 3-5% отн. Гораздо сложнее этим методом добиться хороших результатов при анализе 5-компонентных смесей. В 6-компонентных смесях точно определить содержание всех витаминов методом МЛР1 удается лишь в редких случаях. Особенно плохо определяются те компоненты, вклад которых в суммарное поглощение смеси невелик -это витамины В1 и ВЗ. Погрешности их определения в модельных смесях составляют 10-20 % отн. При этом методика анализа требует не только предварительной оптимизации спектральных диапазонов для вычисления концентрации каждого витамина, но и применения разностных спектров (для определения В1 и ВЗ), что увеличивает время анализа, однако не всегда приводит к желаемым результатам.
Применение МЛР2 является более перспективным вариантом, так как позволяет лучше учесть неаддитивность светопоглощения, а также мультиколлинеарность данных. Основная проблема, возникающая при реализации МЛР2 - это формирование набора модельных смесей для вычисления коэффициентов (градуировочного набора). В статье [5] подробно
описан предложенный нами способ формирования градуировочных наборов, содержащих заданное число стандартных смесей, который приводит к минимальным погрешностям анализа. Предложенный способ ранее был проверен на 2-3компонентных смесях. Следовало выяснить его пригодность к анализу более сложных смесей витаминов, в том числе неаддитивных.
Обработку спектральных данных вели с помощью небольшой по объему программы «Optic-MLR», специально написанной в пакете MATLAB и предназначенной для анализа смесей с использованием МЛР2 [5]. Эта программа позволяет вести все расчеты в доступной практически каждому пользователю среде Microsoft Excel. Если процедура вычисления коэффициентов поглощения анали-тов по всему спектральному диапазону при ее проведении традиционным методом занимает несколько часов, то с программой «Optic-MLR» соответствующие расчеты выполняются всего за 1-2 мин. Ещё меньше времени занимает расчет концентраций витаминов в исследуемых пробах, который выполняется с учетом ранее вычисленных коэффициентов поглощения.
С помощью программы «Optic-MLR» для каждого типа смесей витаминов были сформированы свои градуировочные наборы. Для 4-компонентных смесей витаминов набор состоял из 8 смесей, для 5компонентных - из 10-ти, б-компонент-ных - из 13-ти смесей. Сравнение результатов анализа 16 модельных смесей с применением MAPI и МЛР2 (табл. 2) убедительно доказывает преимущества предложенного способа формирования градуировочных наборов с применением указанной программы. При использовании МЛР2 погрешности определения индивидуальных витаминов оказались достоверно ниже даже в случае аддитивных смесей. При этом МЛР2 позволяет анализировать неаддитивные смеси, одновременно содержащие до 6-ти аналитов. Применение непрямой градуировки позволило снизить погрешности определения некоторых витаминов в 2-5 раз. Значения относительных погрешностей по модулю для всех витаминов не превышали 6 % отн. При этом погрешности определения витамина В1 составляли 4-5%, В2 и Вб - порядка 1%, В5 и КЗ - порядка 2% и витамина ВЗ - не более 6% отн.
Таблица 2
Относительные погрешности определения витаминов в двух модельных смесях с применением двух вариантов метода МПР
Число витаминов Витамин С, мкг/мл МЛР 1 МЛР 2
5 % отн. 1 % Sr 5 % отн. £ % Sr
4 В1 1,0 6,8 11,8 0,020 -2,8 6,2 0,018
В2 1,2 -7,0 0,015 -0,5 0,005
В5 7,0 6,3 0,005 4,8 0,030
В6 1,7 -2,2 0,005 2,6 0,025
6 В1 0,9 10,4 24,8 0,017 -4,6 6,6 0,030
ВЗ 3,5 21,8 0,028 -3,8 0,035
В5 10,6 4,0 0,002 1,8 0,070
В6 1,4 -1,3 0,005 0,2 0,009
В2 0,7 2,6 0,005 -0,7 0,012
КЗ 2,1 2,3 0,006 2,0 0,030
Дополнительным преимуществом МАР2 оказалась возможность брать исходные данные для расчета концентраций в одном и том же спектральном диапазоне, что существенно сокращает время анализа. Так, анализ 4-компонентных смесей вели с использованием данных по поглощению в области 240-280 нм.
Результаты анализа модельных смесей позволили обосновать методику анализа
реальных поливитаминных препаратов -премиксов. Методика включает экстракцию суммы витаминов соляной кислотой, регистрацию спектров экстрактов и расчет концентраций витаминов методами МАР. При разработке этой методики осложняющим обстоятельством было то, что все изученные премиксы содержали, помимо витаминов, минеральные и другие добавки, которые также могут экстраги-
роваться в водную фазу и поглощать свет в УФ области. Для учета их влияния были сняты спектры экстрактов минеральных премиксов (рис.ІА), в состав которых витамины не входили, а по остальным компонентам составы минеральных и витаминно-минеральных премиксов совпадали. Затем из спектров витаминно-минеральных премиксов (рис. 1Б, кривая 1) вычитали спектры минеральных премиксов, получая таким образом «исправленный» спектр премикса (рис. 1Б, кривая 2),
сч сч сч сч сч сч
длина ВОЛНЫН1.1
А
который затем и обрабатывали методом МАР.
Для проверки правильности полученных результатов те же витаминно-минеральные премиксы были проанализированы и по другим методикам (спектрофо-тометрия с применением РЬЭ [3], ВЭЖХ [7]). Методика [7] ранее прошла межлабо-раторный контроль и серийно используется в Сибирском НИИ птицеводства, то есть может считаться стандартной.
о
о
5Г
Ф
—
т— т— СЧ <ГЧ СЧ СЧ
СО -Э- ІГ,- иС- !--- СО
СЧ СЧ сч СЧ СЧ С ■'
ДЛІІНЛ волны.ни
Б
Рис. 1. Спектры экстрактов премиксов: минерального (А) и витаминно-минерального (Б) - первоначальный (кривая 1) и «исправленный» (кривая 2)
В табл. 3 сопоставлены результаты анализа одного из витаминно-минеральных премиксов по трем разным методикам. Приведены данные, полученные по разработанной нами методике (СФ-МЛР2), по альтернативной методике (СФ-РЬЭ), требующей для обработки спектральных данных труднодоступного программного обеспечения, а также по стандартной методике [7] (ВЭЖХ). Как видно, результаты анализа, полученные с применением обоих хемометрических алгоритмов без разделе-
ния смеси витаминов, практически совпадают с результатами ВЭЖХ. Для всех витаминов сравнение средних значений, выполненное по критерию Стьюдента, указывает на статистическую незначи-мость различий (Р=0,95). Методика МЛР2 позволяет правильно определять все витамины, включая «трудноопределяемый» ВЗ. Правда, сходимость результатов по некоторым витаминам оказывается несколько хуже, чем в случае использования алгоритма РЬЭ или метода ВЭЖХ.
Результаты анализа премикса методами спектрофотометри и и ВЭЖХ
Таблица 3
Витамин Содержание по рецептуре, мг/г Найдено, мг/г
СФ - МПР 2 СФ - РІБ ВЭЖХ
В1 1,2 1,4±0,6 1,2 ± 0,1 0,9 ± 0,3
В2 4,0 3,8± 1,3 4,1 ± 0,4 3,4 ± 0,7
ВЗ 6,0 5,5±1,7 6,2 ± 0,6 6,1 ± 0,2
В5 24,0 22,9±3,6 21,4 ± 3,6 22,1 ± 2,9
В6 2,0 2,0±0,4 2,1 ± 0,2 1,9 ± 0,9
КЗ 2,0 1,7±0,1 2,0 ± 0,2 -
Отметим, что методом МЛР1 не удает- премиксах, ни в неаддитивных модель-
ся правильно определить витамин Вз ни в ных смесях. Как видно из данных, приве-
денных в табл. 4, этот метод для витамина ВЗ дает сильно заниженные результаты (по сравнению с СФ-РЬБ или ВЭЖХ, а также с рецептурой премикса). По остальным витаминам результаты, полученные с применением прямой градуировки, хорошо согласуются между собой и с рецептурой премикса.
Таблица 4 Результаты спектрофотометрического определения витаминов в премиксе (п = З, Р = 0,95)
Витамин Содержание по рецептуре, мг/г С найд ., мг/г
МЛР1 PLS
в2 0,8 0,83 ± 0,20 0,83 ± 0,1
в5 3,0 2,98 ± 0,52 3,05 ± 0,13
в6 0,3 0,31 ± 0,02 0,28 ± 0,01
Ві 0,15 0,17 ± 0,13 0,14 ± 0,09
Вз 1,0 0,33± 0,20 0,55 ± 0,08
Таким образом, оба варианта метода множественной линейной регрессии применимы к анализу даже таких сложных объектов, как витаминно-минеральные премиксы. Однако вариант непрямой градуировки имеет явные преимущества - он точнее и менее чувствителен к отклонениям от аддитивности, а поэтому с его помощью можно определять более широкий круг витаминов. Этот вариант является более перспективным и для
спектрофотометрического анализа других
объектов сложного состава.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Премиксы. Методы определения витаминов группы В: ГОСТ Р 50929-96. Введ. 1996-07-26. М. : Изд-во стандартов, 1996. 35 с.
[2] Власова И. В., Шелпакова А. С., Масяко-ва Е. Н. Спектрофотометрический анализ смесей витаминов с применением метода множественной линейной регрессии // Аналитика и контроль. 2009. № 2. Т. 13. С. 86-91.
[3] Масякова Е. Н., Власова И. В., Корягина А.Ю. Спектрофотометрическое определение витаминов в неразделенных смесях с применением метода проекции на латентные структуры (РЦЗ) // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2010. № 2. Т. 76. С. 18-20.
[4] Власова И. В., Шилова А. В. Новые подходы к спектрофотометрическому анализу многокомпонентных смесей // Вісник Харківского Національного Університету. 2007. № 770. Хімія. Вип. 15 (38). С. 141-146.
[5] Власова И. В., Шелпакова А. С., Нагаев А. А. Формирование градуировочных наборов для спектрофотометрического анализа многокомпонентных смесей с применением метода множественной линейной регрессии // Вестник Омского университета. 2010. № 2. С. 99-105.
[6] Масякова Е. Н. Спектрофотометрический анализ смесей водорастворимых витаминов с применением хемометрических алгоритмов : автореф. дис. ... канд. хим. наук. Томск, 2009. 22 с.
[7] Власова И. В., Масякова Е. Н, Богданова Л. А., Пермякова Н. Ю. Определение водорастворимых витаминов в премиксах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Заводск. лаборатория. 2007. № 9. Т. 73. С. 2527.
