CC BY
12
онкология
ONCOLOGY
анализ цитокинового профиля сыворотки крови и супернатантов опухоли при раке молочной железы
резюме
Гергенретер ю.С. Захарова Н.Б. 2, Барулина М.А. 3, Масляков В.В. 4, Федоров В.Э. 2
1 ГБУЗ МО «Московский областной онкологический диспансер» (143900,
г. о. Балашиха, ул. Карбышева, 6, Россия)
2 ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России (410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, 112, Россия)
3 Институт проблем точной механики и управления РАН (410028, г. Саратов, ул. Рабочая, 24, Россия)
4 Саратовский медицинский университет «Реавиз» (410076, г. Саратов, ул. Дегтярная площадь, 1А, Россия)
Автор, ответственный за переписку: Гергенретер Юлия Сергеевна,
e-mail: yuliya-gergenreter@mail.ru
Актуальность. Решающую роль в развитии рака выполняет микроокружение опухоли (МкО) - микросреда, которая формируется в результате взаимодействия между опухолевой тканью и клетками макроорганизма. Концентрация цитокинов МкО в крови изменяется в зависимости от активности опухоли и наличия метастатического процесса. Существующий медиаторный дисбаланс МкО, его характерные особенности в процессе развития опухоли целесообразно изучать для диагностики и прогнозирования опухолевого процесса.
Цель: выявить маркеры прогрессирования опухолевого процесса при изучении тканевых и сывороточных цитокинов у женщин с диагнозом «рак молочной железы» (РМЖ).
Материалы и методы. Объект исследования - цитокины сыворотки крови и супернатантов опухоли (MCP-1, VEGF, TNF-a, IFN-y, TGF-ß1, G-CSF, GM-CSF). В исследовании участвовало 80 пациенток с РМЖ в возрасте 50-69 лет и 26 практически здоровых женщин в возрасте от 41 до 62 лет. Проведено стандартное обследование женщин; исследование цитокинового профиля проводилось до назначения терапии. Для изучения цитокинового профиля на тканевом уровне выполнялась инкубация биоптатов опухоли (n = 30) и биоптатов неизменённой ткани молочной железы (n = 6) с определением продукции MCP-1, VEGF, TNF-a, IFN-y, TGF-ß1, G-CSF, GM-CSF. Результаты. Выявлена умеренная положительная корреляционная связь между стадией заболевания и уровнем TGF-ß1, МСР-1 сыворотки крови, слабая - с G-CSF. В инкубируемой опухолевой ткани высокая положительная корреляционная зависимость цитокинов от стадии заболевания отмечается у факторов роста: VEGF (R = 0,79; p > 0,05) и TGF-ß1 (R = 0,61; p > 0,05). Заключение. Проведённое исследование выявило характерные особенности цитокинового профиля сыворотки крови и опухолевой ткани при РМЖ на локальных и распространённых стадиях. Выявленные различия в уровне цитокинов целесообразно использовать в качестве дополнительных диагностических показателей степени активности и распространённости опухолевого процесса.
Ключевые слова: микроокружение опухоли, цитокины, корреляционный анализ, рак молочной железы, сыворотка крови, инкубация культуры ткани
Статья получена: 29.11.2021 Статья принята: 30.03.2022 Статья опубликована: 20.05.2022
для цитирования: Гергенретер Ю.С., Захарова Н.Б., Барулина М.А., Масляков В.В., Фёдоров В.Э. Анализ цитокинового профиля сыворотки крови и супернатантов опухоли при раке молочной железы. Acta biomedica scientifica. 2022; 7(2): 134-146. doi: 10.29413/ABS.2022-7.2.15
АNALYSIS oF THE CYToKINE PRoFILE of BLooD SERuM AND tumor supernatants in BREAST cancer
ABSTRACT
Gergenreter Yu.S. Zakharova N.B. 2, Barulina M.A. 3, Maslyakov V.V. 4, Fedorov V.E. 2
1 Moscow Regional Oncologic Dispensary (Karbysheva str. 6, Balashikha 143900, Russian Federation)
2 Saratov State Medical University named after V.I. Razumovskiy (Bolshaya Kazachia str. 112, Saratov 410012, Russia)
3 Institute of Precision Mechanics and Control, Russian Academy
of Sciences (Rabochaya str. 24, Saratov 410028, Russian Federation)
4 Samara Medical University Reaviz (Degtyarnaya ploshchad str. 1A, Saratov 410076, Russian Federation)
Corresponding author: Yulia S. Gergenreter,
e-mail: yuliya-gergenreter@mail.ru
Background. A crucial role in the development of cancer is played by the tumor microenvironment (TM) - a microenvironment that is formed as a result of the interaction between the tumor tissue and macroorganism cells. The concentration of TM cytokines in the blood varies depending on the activity of the tumor and the presence of a metastatic process. It is advisable to study the existing mediator imbalance of TM, its characteristic features in the process of tumor development for the diagnosis and prognosis of the tumor process.
The aim. To identify markers of tumor progression in the study of tissue and serum cytokines in women diagnosed with breast cancer.
Materials and methods. The object of the study is blood serum cytokines and tumor supernatants (MCP-1, VEGF, TNF-a, IFN-y, TGF-&1, G-CSF, GM-CSF). The study involved 80 patients with breast cancer aged 50-69years and 26 practically healthy women aged 41 to 62 years. A standard examination of women was conducted; a cytokine profile study was conducted before the appointment of therapy. To study the cytokine profile at the tissue level, tumor biopsies (n = 30) and biopsies of unchanged breast tissue (n = 6) were incubated to determine the production of MCP-1, VEGF, TNF-a, IFN-y, TGF-&1, G-CSF, GM-CSF.
Results. There was a moderate positive correlation between the stage of the disease and the level of TGF-fi1, MCP-1 blood serum, a weak one - with G-CSF. In the incubated tumor tissue, a high positive correlation of cytokines on the stage of the disease is observed in growth factors: VEGF (R = 0.79;p > 0.05) and TGF-fi 1 (R = 0.61;p > 0.05). Conclusion. The study revealed the characteristic features of the cytokine profile of blood serum and tumor tissue in breast cancer at local and widespread stages. The revealed differences in the level of cytokines should be used as additional diagnostic indicators of the degree of activity and prevalence of the tumor process.
Key words: tumor microenvironment, cytokines, correlation analysis, breast cancer, blood serum, tissue culture incubation
Received: 29.11.2021 Accepted: 30.03.2022 Published: 20.05.2022
For citation: Gergenreter Yu.S., Zakharova N.B., Barulina M.A., Maslyakov V.V., Fedorov V.E. Аnalysis of the cytokine profile of blood serum and tumor supernatants in breast cancer. Acta biomedica scientifica. 2022; 7(2): 134-146. doi: 10.29413/ABS.2022-7.2.15
ВВЕДЕНИЕ
Решающую роль в развитии рака выполняет микроокружение опухоли (МкО) - микросреда, формирующаяся в результате взаимодействия между опухолевой тканью и клетками макроорганизма. МкО - сложная экосистема, состоящая из стромальных, иммунных клеток, макромолекул внеклеточного матрикса и ферментов [1, 2]. Основой для развития рака молочной железы (РМЖ) служат фенотипы клеток, способные к эпителиально-мезенхимальному переходу. К числу медиаторов, влияющих на развитие эпителиально-мезенхимального перехода, опухолевый рост и метастазирование, относят более 30 эндогенных молекул (цитокинов): «интерлей-кины (IL), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), трансформирующие факторы роста альфа и бета (TGF-a, TGF-ß1), фактор некроза опухоли альфа (TNF-a), тромбоцитарный фактор роста эндотелия (PDGF), плацентарный фактор роста (PLGF), моноцитарный хемоаттрактантный протеин (МСР-1) и другие медиаторы» [3, 4]. Общими свойствами цитокинов являются: синтез в процессе иммунного ответа, активность в низких концентрациях, плейотроп-ность; возможность как синергизма, так и антагонизма действия. Цитокины могут участвовать в туморогене-зе как факторы опухолевой прогрессии и в то же время тормозить развитие опухоли. Концентрация цитокинов МкО в крови изменяется в зависимости от активности опухоли и наличия метастатического процесса, поэтому они были рекомендованы в качестве иммуноон-кологических маркеров [5, 6]. Трудность изучения этой темы связана не только с многообразием клеток системы иммунитета и продуктов их синтеза, но и способностью каждой из клеток оказывать противоположное действие, изменяя функции и фенотип иммунных клеток [5, 7]. До настоящего времени не полностью ясна роль иммунитета в агрессии МкО и в динамике опухолевого процесса. В мире проводятся многочисленные исследования МкО, однако данная тема находится в фазе накопления и анализа информации, и только лишь часть изученного материала вошла в практическую медицину. Благодаря исследованию МкО становится возможной иммунотерапия при различных злокачественных образованиях, в том числе и при триплекс-негативном раке молочной железы; ингибиторы ангиогенеза стали частью схем лечения при колоректальном раке, а коло-ниестимулирующие факторы - компонентом сопроводительной терапии. Дальнейшее изучение МкО опухоли должно открыть новые возможности для диагностики и лечения злокачественных новообразований. Для РМЖ пока не существует предиктивных биомаркеров иммунотерапии. Изучение МкО и системного иммунного ответа может облегчить поиск биомаркеров [5]. Важно изучить компоненты МкО, чтобы переориентировать последние в пользу макроорганизма для усиления противоопухолевой защиты. Активное изучение и разработка новых биомаркеров дают возможность прогнозировать поведение опухоли [8]. Мы мало знаем об изменении МкО во время прогрессирования рака [9]. Разработка
стандартных наборов молекулярных маркеров важна для ранней диагностики, мониторинга и определения тактики лечения. Исследование МкО позволит открыть новые маркеры, контролирующие развитие метастатического процесса при РМЖ, и определять важные молекулярные мишени противоопухолевых препаратов [10].
цель исследования
Выявить маркеры прогрессирования опухолевого процесса при изучении тканевых и сывороточных ци-токинов у женщин с диагнозом «рак молочной железы».
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В условиях ГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» г. Саратова проведено научное исследование, объектом которого стали 80 пациенток с РМЖ, в возрасте 50-69 лет, проходивших лечение в 2017-2018 гг.
Критерии включения; возраст 50-69 лет, РМЖ I-IV стадий, подписанное информированное согласие на участие в исследовании.
Критерии исключения: злокачественные образования других локализаций, острые инфекционные заболевания, хронические заболевания в стадии обострения, суб- и декомпенсации.
Критерии включения в группу сравнения (группу здоровых женщин): подписанное информированное согласие на участие в исследовании, отсутствие клинических и инструментальных признаков обострения хронических, острых инфекционных и онкологических заболеваний.
Группу сравнения составили 26 практически здоровых женщин от 41 до 62 лет. Исследование было одобрено локальным комитетом по этике в Филиале частного учреждения образовательной организации высшего образования «Медицинский университет «Реавиз» в городе Саратов (протокол № 7 от 21.07.2017).
Было проведено стандартное обследование пациенток и здоровых женщин группы сравнения. Разделение на стадии опухолевого процесса проведено согласно классификации TNM 7-го пересмотра (2012 г.). В первую исследуемую группу (локальный рак) вошли пациентки с I и II стадиями РМЖ, во вторую (распространённый рак) - с III и IV стадиями. Первую группу составили 37 (46 %) пациенток, вторую - 43 (54 %) пациентки.
До начала лечения в сыворотке крови пациенток (n = 80) и у женщин группы сравнения (n = 26) проведено исследование семи цитокинов - MCP-1 (моноцитар-ного хемоаттрактантного протеина-1), VEGF (фактора роста эндотелия сосудов), TNF-a (фактора некроза опухоли альфа), IFN-y (интерферона гамма), TGF-ß1 (трансформирующего фактора роста бета 1), G-CSF (гранулоцитарного колониестимулирующего фактора), GM-CSF (гранулоци-тарно-макрофагального колониестимулирующего фактора). Концентрацию MCP-1, VEGF, TNF-a, IFN-y определяли методом твердофазного ИФА с помощью наборов
реагентов (АО «Вектор Бест», Новосибирск). Для исследования TGF-pi, G-CSF, GM-CSF применяли трёхстадийный «сэндвич»-вариант ИФА с использованием моно- и поли-клональных антител к цитокинам (R&D Systems, Великобритания). Для активации латентной формы TGF-pi сыворотку крови перед проведением ИФА активировали (выдерживали в течение 60 мин в среде с pH 1-2,0, а затем проводили нейтрализацию до pH 7,2-7,6) (рис. 1).
Следующим этапом проводили инкубацию биопта-тов опухоли и биоптатов неизменённой ткани молочной железы с определением спонтанной продукции цито-кинов: MCP-1, VEGF, TNF-a, IFN-y, TGF-pi, G-CSF, GM-CSF. Для данного этапа исследования выделено 30 пациенток с РМЖ. Выделено две группы: первая - 15 пациенток с локальным РМЖ (I-II стадия), вторая - 15 пациенток с распространённым РМЖ (III-IV стадия). В контрольную группу вошли 6 практически здоровых женщин, у которых была получена здоровая ткань молочной железы во время проведения эстетической операции. Объём биоптата, как опухоли, так и здоровой ткани составлял 8 мм3. Биоптаты опухолей помещали в питательную среду DMEM-F12 для инкубирования при 37 °С в течение 72 часов. В супернатантах после осаждения клеток крови и опухоли (центрифугирование при 2000 об./мин, 15 мин) методом ИФА определяли концентрацию TNF-a, IFN-Y, G-CSF, GM-CSF, VEGF, MCP-1, TGF-P1.
Для определения степени выраженности связи между вариационными рядами использовался метод корреляции, расчёт парных коэффициентов корреляций проводился по стандартной формуле. Нулевая гипотеза об отсутствии корреляции между исследуемыми значениями в различных группах отклонялась с уровнем статистической значимости 0,05 и доверительным интервалом 95 %. Оценка независимости выборок проводилась с помощью критерия Манна - Уитни, преимуществом которого яв-
ляется отсутствие необходимости в проверке нормальности распределения наборов данных и одинаковости их дисперсий. Корреляционная связь между параметрами признавалась умеренной при коэффициенте корреляции большем или равным 0,5 и при p < 0,05; слабой - при коэффициенте корреляции меньшим 0,5 и при p < 0,05. При p > 0,05 корреляционная связь признавалась несущественной при любом значении коэффициента корреляции.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Концентрация уровня цитокинов сыворотки крови (за исключением ^Ы-у) на всех стадиях РМЖ была выше, чем у здоровых женщин группы сравнения. С-СБЕ, Т^-а статистически значимо повышались в группе с локальным ростом по сравнению с распространённым. МСР-1 повышался на распространённых стадиях по сравнению с локальными стадиями (р < 0,05). Содержание ТСР-Р1 в сыворотке крови у пациенток с распространённым ростом был повышен по сравнению с группой сравнения и женщинами с локальным ростом (р < 0,05) (табл. 1).
Проведён корреляционный анализ полученных результатов. Построены матрица и диаграммы корреляций с использованием коэффициентов корреляции Пирсона (рис. 2, 3), наглядно показывающие наличие или отсутствие зависимости показателей при парном сравнении цитокинов, а также уровня цитокинов со стадией РМЖ.
Из рисунка 3 видно, что наблюдается положительная корреляционная связь между стадией заболевания и уровнем цитокинов сыворотки крови: ТСР-^1 (Щ=0,58; p < 0,05), МСР-1 (Щ = 0,5; р < 0,05), слабая с С-СБЕ (Щ = 0,43; р < 0,05). Следовательно, умеренное повышение уровня ТСР-Р1, в меньшей степени - МСР-1 характерно при прогрессии
РИС. 1.
Дизайн исследования
4. Статистическая обработка
FIG. 1.
Study design
ТАБЛИЦА 1
концентрация цитокинов сыворотки крови ПРИ !-!У стадиях рака молочной железы
TABLE 1
CONCENTRATION OF SERUM CYTOKINES IN STAGES I-IV OF BREAST CANCER
Концентрации цитокинов (пг/мл), Me (25-75-й перцентили) [min-max значение]
Цитокины Стадии РМЖ
сыв°рогки крови Группа сравнения
(n = 26) Стадия 1 (n = 11) Стадия 2 (n = 26) Стадия 3 (n = 26) Стадия 4 (n = 17)
G-CSF 7,1 (5,3-10,9) [4,7-14,5] 172,6 а (132,2-194,9) [110,4-529,0] 146,7 а (121,3-201,3) [68,5-372,0] 161,9 а (106,5-204,7) [80,2-345,0] 128,0 а, b (80,6-182,2) [4,7-529,0]
GM-CSF 1,0 (0,8-1,2) [0,7-1,2] 8,3 а (7,3-9,7) [5,9-11,5] 8,5 а (6,8-11,2) [5,6-33,0] 7,9 а (6,2-11,7) [5,9-35,2] 7,8 а (5,9-9,7) [0,7-35,2]
IFN-Y 20,9 (17,5-23,3) [13,3-25,6] 15,9 (14,8-2,6) [13,2-27,7] 15,7 (4,8-23,8) [3,7-28,1] 19,7 (16,2-24,7) [10,1-29,3] 18,7 (15,1-23,7) [3,7-30,6]
TNF-a 2,3 (1,9-2,7) [1,1-6,5] 8,9 а (5,0-11,3) [4,0-18,7] 6,4 а (3,4-9,6) [1,0-19,4] 7,5 а (4,6-8,8) [2,7-11,7] 5,7 а, b (3,3-8,7) [1,0-19,4]
МСР-1 136,8 (119,9-294,6) [66,9-331,2] 326,0 а (222,0-446,3) [172,0-684,0] 313,9 а (228,7-421,8) [92,8 - 864,2] 394,8 а, b (305,5-453,3) [126,9-678,0] 323,2 а (193,0-428,0) [66,9-1490,2]
VEGF 349,5 (249,6-432,4) [106,4-613,0] 545,0 а (419,2-616,3) [287,4-613,0] 493,7 а (380,6-628,3) [234,7-832,6] 570,5 а (457,3-627,1) [342,3-745,5] 495,0 а (374,8-518,1) [106,4-832,6]
TGF-ß1 26675 (21300-29500) [16500-96000] 30800 а (26730-32950) [22200-38200] 35750 а (25617-40356) [24450-63500] 41800 а, b (33250-54675) [26850-77750] 36400 а, b (26735-49200) [16500-96000]
Примечание. а - p < 0,05 при сравнении с группой сравнения; b - p < 0,05 при сравнении групп локального роста (I и II стадии) с распространённым ростом (III и IV стадии); жирным шрифтом отмечено максимальное увеличение показателя.
Стадии G-CSF GM-CSF VEGF МСР-1 TNF-а IFN-y TGF-P1
1 043 0.41 024 0.5 0.32 0 0 50
043 1 0.39 0 0 26 0.58 0 0.19
041 о.зв 1 0 0.26 0.39 0 0
0.24 0 • 1 0 1о -0.34 0
0.5 0.26 0.28 0 1 0,22 0 0.28
0.32 0.5В 0.39 0 0.22 111 о.з 0
0 0 0 -0.34 0 0 3 1 0
0.58 0.19 0 0 0.28 0 0 1
|
-02
а:
пз I-
о
с/) О
т
О
О
О
LU >
О. О
CD
РИС. 2.
Матрица корреляций цитокинов сыворотки крови и стадии
заболевания
FIG. 2.
Matrix of correlations of blood serum cytokines and disease stage
0,6 I 0,5
I 0,4
ш
S 0,3
jo 0,2
i 0,1 о
£ 0 "0,1
Ш
I -0.2
to. Li.
СЭ
CL
o 5
M
о
от о
сэ
СЭ
ш >
Особенности соотношения цитокинов соответственно распространенности процесса
РИС. 3.
Диаграмма корреляции уровня цитокинов сыворотки крови в динамике опухолевого процесса: ось х- особенности соотношения цитокинов соответственно распространённости процесса; ось y - уровень корреляции FIG. 3.
Correlation diagram of serum cytokine levels in the dynamics of the tumor process: x-axis - features of the ratio of cytokines according to the prevalence of the process; y-axis - the level of correlation
заболевания на распространённых стадиях. Для СМ-СБР (К = 0,41; р > 0,05), ТЫР-а (К = 0,32; р > 0,05), УБСР (К = 0,24; р > 0,05) корреляционная связь со стадией заболевания носит нелинейный характер. Диаграмма корреляции показала положительную связь между этими цитокинами и стадией заболевания, но дальнейший расчёт с помощью критерия Манна - Уитни показал недостаточный уровень статистической значимости такой корреляции.
Колониестимулирующие факторы сыворотки крови имеют максимальные значения на локальных стадиях РМЖ, на распространённых стадиях отмечается их снижение. Фактор некроза опухоли ТЫР-а, обладающий своей двойственной природой, обеспечивающей как защитную роль, так и проонкогенный эффект, не показывает выраженной корреляционной зависимости от стадии в сыворотке. УБСР не коррелирует со стадией заболевания при исследовании цитокинов сыворотки крови. !РЫ-у показал слабую отрицательную корреляционную зависимость со стадией заболевания с недостаточным уровнем статистической значимости (К = -0,08; р = 0,3).
Проведён корреляционный анализ при парном сравнении отдельных цитокинов сыворотки крови. Положительная корреляционная связь выявлена для С-СБР и ТЫР-а (К = 0,58; р < 0,05), приведённые цитокины могут проявлять синергетический эффект. Они осуществляют функцию иммунологической защиты на ранних стадиях РМЖ. Снижение уровня и нарушение соотношения данных провоспалительных цитокинов на распространённых стадиях может нарушать их взаимодействие и механизмы защиты. Незначительное отрицательное корреляционное взаимодействие демонстрируют !РЫ-у и УБСР (К = -0,34; р > 0,05).
Диаграммы рассеивания при корреляционном анализе показывают распределение цитокинов в норме и при злокачественном процессе (рис. 4).
При уровне колониестимулирующего фактора С-СБР от 0 до 15 пг/мл и ТЫР-а от 0 до 2,6 пг/мл ни одного случая рака молочной железы не встречается, более высокие показатели цитокинов характерны для локальной
и распространённой стадий РМЖ. Корреляционный анализ позволил определить пороговый уровень цитокинов сыворотки крови, при котором отсутствовал опухолевый рост (табл. 2).
таблица 2
пороговый уровень цитокинов сыворотки крови, ПГ/мл TABLE 2
threshold level of cytokine indices, pg/ml
цитокины сыворотки крови Пороговый уровень, пг/мл
INF-Y 24
МСР-1 180
GM-CSF 2
G-CSF 15
VEGF 100
TGF-P1 20000
TNF-a 2,5
На основании корреляционного анализа цитоки-нов сыворотки крови получены следующие результаты:
1) положительная корреляционная связь выявлена между стадией заболевания и уровнями цитокинов сыворотки крови: ТСР-Р1 (К = 0,58; р < 0,05), МСР-1 (К = 0,5; р < 0,05), слабая - с С-СБР (К = 0,43; р < 0,05);
2) !РЫ-у показал отрицательную корреляционную зависимость со стадией заболевания (К = -0,08; р > 0,05);
3) положительная корреляционная связь выявлена для С-СБР и ТЫР-а (К = 0,58; р < 0,05) - синергетиче-ский эффект.
ТСР-Р1 и МСР-1 повышаются на распространённых стадиях (имеют положительную корреляцию со стадией
35 30 25
М 20
о
Стадии • 0
• 1 • 2
15 10 5 0
ve'**
500
400
u.300 С/5
о ¿200
100
0
10 TNF-a
15
20
... •v.
10 TNF-a
Стадии • 0
• 1 • 2
1000
800
600
О
ш
>
400
200
15
20
10 TNF-a
РИС. 4.
Диаграммы зависимости ТЫГ-а с вМ-СБГ (а), в-СБГ (б), УЕвГ (в): 0 - группа здоровых женщин; 1 - группа локального роста; 2 - группа с распространённым ростом
15
• • • Стадии • 0 • 1
• • • • • • •• s • • • • • • • • CM •
/ •• ' •• • • • •
• • • • •
•
20
6 B
FIG. 4.
Dependence diagrams of TNF-a with GM-CSF (a), G-CSF (6), VEGF (b): 0 - a group of healthy women; 1 - a group of local growth; 2 - a group with widespread growth
а
процесса) и свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе; колониестимулирующие факторы и факторы некроза опухоли имеют более высокий уровень на ранних стадиях РМЖ и, соответственно, слабую корреляцию со стадией заболевания.
Следующим этапом проведён анализ цитокиново-го профиля супернатантов опухоли при спонтанной инкубации. Уровень сывороточных цитокинов и их корреляция отличались от показателей цитокинов супернатантов опухолевой ткани. Спонтанная продукция цитокинов биоптатами опухоли в обеих группах характеризовалась высокой активностью по сравнению с группой здоровых женщин. IFN-y при спонтанной инкубации статистически значимо увеличивался при локальном росте по сравнению со здоровыми женщинами и между группами в отличие от сыворотки крови. В образцах опухоли из группы с локальным ростом отмечено статистически значимое (р < 0,05) повышение спонтанной продукции следующих цитокинов: TNF-a - в 4,2, IFN-y - в 3,6, MCP-1 - в 6,7 раза, фактора роста TGF-ß1 - в 2,2 раза, VEGF - в 11,9 раза; максимально увеличились колониестимулирующие факторы: GM-CSF - в 15,6 раза, G-CSF -в 96,8 раза по сравнению с группой здоровых женщин [11].
В биоптатах опухолевой ткани в группе с распространённым ростом концентрация следующих цитоки-нов была статистически значимо выше по сравнению с группой здоровых женщин: TNF-a - в 4,8 раза, MCP-1 -в 6,3 раза, TGF-ß1 - в 2,5 раза, VEGF - в 14,6 раза, GM-CSF -в 13,4 раза, G-CSF - в 79,5 раза. При проведении сравнения между группами с локальным и распространённым ростом статистически значимые отличия выявлены для колониестимулирующих факторов (GM-CSF, G-CSF) и IFN-y - выше при локальном росте, VEGF и TGF-ß1 -выше в группе с распространённым ростом (табл. 3) [11].
На диаграмме и матрице корреляций представлена зависимость уровня цитокинов при спонтанной инкуба-
ции от распространённости опухолевого процесса (рис. 5, 6). Как видно из рисунков, высокая положительная корреляционная зависимость со стадией заболевания выявлена у VEGF (К = 0,79; р < 0,05) и ТСР-Р1 (К = 0,61; р < 0,05), что ассоциировано с выраженностью пролиферативных процессов и ангиогенеза на распространённых стадиях.
Особенности соотношения цитокинов соответственно распространенности процесса
РИС. 5.
Диаграмма корреляции цитокинов супернатантов опухоли в динамике опухолевого процесса: ось x- особенности соотношения цитокинов соответственно распространённости процесса; ось y - уровень корреляции FIG. 5.
Correlation diagram of cytokines of tumor supernatants in the dynamics of the tumor process: x-axis - features of the ratio of cytokines according to the prevalence of the process; y-axis - correlation level
Факторы роста максимально увеличиваются на распространённых стадиях в тканях. В сыворотке корреляция TGF-P1 со стадией заболевания менее выражена (R = 0,58, p < 0,05), а статистически значимой корреляционной зависимости VEGF от стадии заболевания выявлено не было. Максимальное повышение VEGF
ТАБЛИЦА 3
продукция цитокинов клетками опухоли (здоровой ткани)при спонтанной инкубации в группах с локальным ростом, распространённым ростом и в группе здоровых женщин
TABLE 3
cytokine production BY tumor CELLS (HEALTHY tissue) during spontaneous incubation in groups with local growth, widespread growth and in a group of healthy women
Цитокин, пкг/мл Содержание цитокинов в биоптате молочной железы (пкг/мл), Me [25-75-й перцентили]
Группа здоровых женщин (n = 6) Локальный рост опухоли (n = 15) Распространённый рост опухоли (n = 15)
TNF-a 3,0 [1,9-4,5] 12,5 [2,95-16,1] а 14,4 [13,75-18,91] а
IFN-Y 2,85 [2,3-3,7] 10,2 [4,6-26,7] а 3,5 [2,3-4,9] а, b
MCP-1 212,3 [147,7-254,5] 1426,25 [1337,3-1730,8] а 1340,0 [1038-1925] а
GM-CSF 1,30 [1,2-1,7] 20,3 [12,5-25,4] а 17,4 [12,2-26,4] а, b
G-CSF 10,2 [4,7-26,7] 987,0 [562,5-1138] а 811,0 [668,1-1162,0] а, b
VEGF 141,4 [64,9-204,5] 1680,0 [1038-2450] а 2060 [1765-3190] а, b
TGF-ß1 25700 [21200-28987,5] 57200 [47900-77712,5] а 65000 [45000-118000] а, b
Примечание. а - р < 0,05 при сравнении с группой здоровых женщин; ь - р < 0,05 при сравнении групп с локальным и распространённым ростом.
и его влияние на ангиогенез проявляется на тканевом уровне [1, 2].
Также положительная корреляция при спонтанной инкубации в зависимости от распространённости процесса выявлена для фактора некроза опухоли ТЫР-а (Я = 0,69; р < 0,05), хемокина МСР-1 (Я = 0,63; р < 0,05). В сыворотке крови сохраняется умеренная корреляция МСР-1 со стадией заболевании (Я = 0,5), для ТЫР-а сыворотки крови корреляция статистически не значимая (Я = 0,32).
РИС. 6.
Матрица корреляции цитокинов супернатантов опухоли и стадии рака молочной железы FIG. 6.
Cytokine correlation matrix of tumor supernatants and the stage of breast cancer
Колониестимулирующие факторы отличаются умеренной корреляционной зависимостью со стадией процесса: GM-CSF (R = 0,55), G-CSF (R = 0,52). В сыворотке крови корреляция GM-CSF (R = 0,41), G-CSF (R = 0,43) выраже-
на слабо. IFN-y отличается отрицательной корреляционной зависимостью со стадией заболевания как в супер-натанте (R = -0,19), так и в сыворотке крови (R = -0,08).
Сравнение цитокинового профиля сыворотки и супернатантов опухоли свидетельствует, что на тканевом уровне отмечается более высокая корреляционная зависимость исследуемых цитокинов со стадией процесса (табл. 4).
Попарная корреляция цитокинов супернатантов опухоли максимально выражена между МСР-1 и G-CSF (R = 0,75; p < 0,05), МСР-1 и VEGF (R = 0,73; p < 0,05), МСР-1 и TNF-a (R = 0,72; p < 0,05), VEGF и TNF-a (R = 0,75; p < 0,05).
Построенные диаграммы рассеивания при попарном сравнении цитокинов наглядно показывают границы нормальных показателей и показателей злокачественного роста. Например, при GM-CSF от 1 до 2,5 и TGF-ß1 от 20 000 до 30 000 пг/мл злокачественного роста не встречается (рис. 6). При корреляции VEGF с другими цитокинами на диаграммах рассеивания чётко определяются показатели группы сравнения и уровни, характерные для злокачественного процесса (рис. 7).
Особое значение приобретают диаграммы рассеивания IFN-y в сочетании с другими цитокинами. Особенности корреляции изучаемых цитокинов с IFN-y при спонтанной инкубации позволяет выделить уровни нормальных показателей, а также соответствующие локальной и распространённой стадиям процесса (рис. 8; табл. 2). Так, при корреляции IFN-y с TGF-ß1 выявлено, что для нормальной ткани характерны уровни TGF-ß1 от 20 000 до 30 000 пг/мл; IFN-y - от 2 до 4,0 пг/мл; для локальной стадии РМЖ - TGF-ß1 от 45 000 до 75 000 пг/мл; IFN-y - от 5 до 16 пг/мл; для распространённой стадии -TGF-ß1 от 40 000 до 120 000 пг/мл; IFN-y - от 2 до 3,8 пг/мл. Снижение уровня IFN-y коррелирует с распространёнными стадиями и неблагоприятным прогнозом, особенно в сочетании с высоким уровнем факторов роста. На рисунке 9 наглядно представлено описанное распределение уровня IFN-y при спонтанной инкубации с TGF-ß1, MCP-1, GM-CSF, G-CSF.
ТАБЛИЦА 4
сравнение корреляции цитокинового профиля и стадии заболевания на сывороточном уровне и в супернатанте при раке молочной железы
TABLE 4
COMPARISON OF THE CORRELATION OF THE CYTOKINE PROFILE AND THE STAGE OF THE DISEASE AT THE SERUM LEVEL AND IN THE SUPERNATANT IN BREAST CANCER
Цитокины Сыворотка крови Коэффициент корреляции P Супернатант опухоли Коэффициент корреляции P
TNF-a 0,32 > 0,05 0,69 < 0,05
МСР-1 0,50 < 0,05 0,63 < 0,05
G-CSF 0,43 > 0,05 0,52 < 0,05
GM-CSF 0,41 > 0,05 0,55 < 0,05
IFN-Y -0,08 > 0,05 -0,19 > 0,05
TGF-ß1 0,58 < 0,05 0,61 < 0,05
VEGF 0,24 < 0,05 0,79 < 0,05
30
25
20
LL
w о
15
О
10
• • • • Стадии • 0
• • • • •* • • • 1 • 2
• • • 9 • • • •
• • • 9 •
Л/
20000 40000 60000 80000 100000 120000 TGF.pi
а
РИС. 7.
Диаграммы корреляционной зависимости цитокинов супер-натантов опухоли при спонтанной инкубации: ТвЕ-^1 с вМ-СБГ (а), с в-СБГ (б): 0 - группа здоровых женщин; 1 - группа локального роста; 2 - группа с распространённым ростом
120000
100000
,_ 80000
еа
О
60000 40000 20000
1600
1400
1200
1000
3 800 I
О
600 400 200 0
• • Стадии • 0 1
• • 2
• • • • • •• • •
• • • • • 9 9
9 \ •
500 1000 1500 2000 2500 3000 VEGF
Стадии • 0
• 1 • 2
500
1000 1500 2000 2500 3000 VEGF
РИС. 8.
Диаграммы корреляционной зависимости цитокинов су-пернатантов опухоли при спонтанной инкубации: УЕвГ с ТвГ-в1, вМ-СБГ, в-СБГ, ТЫГ-а: 0 - группа здоровых женщин; 1 - группа локального роста; 2 - группа с распространённым ростом
1600 1400 1200 1000
LL
О 800
I
О
600 400 200
• Стадии • 0
• • • • • 1 • 2
•
•• • • • • • •
• •
•
• So
20000 40000 60000 80000 100000 120000 TGF-P1 6
FIG. 7. Correlation diagrams of cytokines of tumor supernatants during spontaneous incubation: TGF-^1 with GM-CSF(a), with G-CSF (6): 0 - a group of healthy women; 1 - a group of local growth; 2 - a group with widespread growth
30
25
20
CO
о
15
О
10
20.0 17.5 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5
• • • Стадии • 0
• • • • • • • • • 1 2
•
• • • • •
• • • • • • •
и»
500 1000 1500 2000 2500 3000 VEGF
Стадии • 0 • • • •
• • 1 2 • • I • • • •
9 1 •
•
—• • • • • •
•
• •
• • •
• «
500
1000 1500 2000 2500 3000 VEGF
FIG. 8.
Correlation diagrams of cytokines of tumor supernatants during spontaneous incubation: VEGF with TGF-&1, GM-CSF, G-CSF, TNF-a: 0 - a group of healthy women; 1 - a group of local growth; 2 - a group with widespread growth
ca ■
LL
a
120000 100000 80000 " 60000 40000 20000
30 25 20
LL
И
9 15
s
о
10 5 0
Стадии • 0
• 1 • 2
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 ifn-r
• • • •
• • • • • • • • • •
• • у • •
• •* •
Стадии • 0
• • 1 2
2.5
5.0
7.5 10.0 IFN-y
12.5 15.0
РИС. 9.
Диаграммы корреляционной зависимости уровня при спонтанной инкубации с ТвГ-в1, МСР-1, вМ-СБГ, в-СБГ: 0 - группа здоровых женщин; 1 - группа локального роста; 2 - группа с распространённым ростом
2000 1750 1500 1250
I
CL
у юоо
750 500 250
1600 1400 1200 1000
LL
(Л „„ О 800
сэ
600 400 200 0
Стадии • 0
• 1 • 2
2.5
5.0
7.5 10.0 ifn-y
12.5 15.0
• \ • •
• •
• • • • •
« • • m •
• • ш Стадии • 0
• • 1 2
2.5
5.0
7.5 10.0 IFN-y
12.5 15.0
FIG. 9.
Correlation diagrams of the level of IFN-y during spontaneous incubation with TGF-&1, MCP-1, GM-CSF, G-CSF: 0 - a group of healthy women; 1 - a group of local growth; 2 - a group with widespread growth
ТАБЛИЦА 5
уровень ЦИТокИНов СУПЕРНАТАНТов в ГРУППЕ здоровых женщин, при локальных и распространённых формах рмж
TABLE 5
THE LEVEL of CYToKINES oF THE SuPERNATANTS
in a group of healthy women, with local and common forms of breast cancer
Цитокины Группа контроля (пг/мл), min-мах Группа с локальным ростом (пг/мл), min-мах Группа с распространённым ростом (пг/мл), min-мах
TNF-a 0-2,5 2,6-18 10-20,0
MCP-1 0-250 1000-1750 1000-2000
IFN-Y 0-5,0 5,0-15,0 4,0-6,0
G-CSF 0-60 600-1500 600-1300
GM-CSF 0-2,5 10-27 10-28
VEGF 0-250 500-2500 1500-3000
TGF-ß1 0-30000 40 000-80 000 40 000-120 000
В результате корреляционного анализа цитоки-нового профиля инкубируемой опухолевой ткани выявлено, что самая высокая положительная зависимость цитокинов со стадией заболевания у факторов роста: УЕСР (К = 0,79; р < 0,05) и ТСР-Р1 (К = 0,61; р < 0,05). !РЫ-у супернатантов опухоли отличается незначительной отрицательной корреляционной зависимостью со стадией заболевания. Показатели уровня цитокинов (тт-мах) при спонтанной инкубации отражены в таблице 5.
Можно считать, что опухоль стимулирует воспалительный тип ответа в период локального роста с увеличением продукции ТЫР-а, !РЫ-/, МСР-1, СМ-СБР, С-СБР. Второй тип характеризуется максимальным подъёмом факторов роста, УЕСР и ТСР-Р1, хемокина МСР-1, снижением !РЫ-у и возникает на фоне диссеминации процесса при распространённых стадиях. Выявленная перестройка МкО является характерной особенностью течения рака молочной железы на начальных и распространённых стадиях. Проведённое исследование позволяет дополнить алгоритм диагностики при раке молочной железы исследованием цитокинов сыворотки крови (рис. 10).
Исследование цитокинов при раке молочной железы выявило различия между неизменённой и опухолевой тканью, локальным и распространённым опухоле-
вым ростом. Защитные свойства микроокружения опухоли при локальном опухолевом росте связаны с повышением продукции провоспалительных цитокинов (ТЫР-а, МСР-1, СМ-СБР, С-СБР). Однако длительное воспаление становится фактором иммуносупрессии и способствует прогрессии опухоли. Способность опухолевых клеток к уклонению от иммунного ответа на распространённых стадиях рака сопровождается подъёмом факторов роста (УЕСР и ТСР-Р1), хемокина МСР-1, снижением !РЫ-у. Данные изменения более выражены на тканевом уровне. Медиаторы МкО можно использовать в качестве диагностических показателей степени активности и распространённости опухолевого процесса, а также для построения прогностических моделей характера течения заболевания.
выводы
Для начальных стадий РМЖ характерно преимущественное повышение уровня провоспалительных цитокинов (ТЫР-а, МСР-1), колониестимулирующих факторов (СМ-СБР, С-СБР). Подъём факторов роста (УЕСР и ТСР-Р1), хемокина МСР-1 на фоне низкого !РЫ-у на распространённых стадиях свидетельствует о прогрессиро-вании опухоли. Выявлены положительные корреляци-
Общеклинические методы исследования
• сбор анамнеза и осмотр
• инструментальное исследование
• морфологическое исследование
• иммуногистохимическое исследование
• лабораторное исследование
• медико-генетическое исследование (по показаниям)
Ранний (первично операбельный) РМЖ (1-11 стадии)
Местнораспространенный и метастатический РМЖ (III-IV стадии)
TNF-a более 2,5 пг/мл и выше G-CSF более 15 пг/мл и выше
МСР-1 более 180 пг/мл и выше
РИС. 10.
Алгоритм исследования пациенток при раке молочной железы
FIG. 10.
Algorithm for the study of patients with breast cancer
онные связи со стадией процесса для цитокинов ТСР-01 и МСР-1 в сыворотке крови, для УБСР и ТСР-01 - на уровне микроокружения. Установленные особенности продукции цитокинов в норме и при раке молочной железы представляют дополнительную информацию о про-грессировании заболевания. Медиаторы МкО можно рекомендовать в качестве диагностических показателей степени активности и распространённости опухолевого процесса, а также для построения прогностических моделей течения заболевания.
конфликт интересов
Авторы данной статьи сообщают об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Korkaya H, Orsulic S. Editorial: The tumor microenvironment: recent advances and novel therapeutic approaches. Front CellDevBiol. 2020; 8: 586176. doi: 10.3389/fcell.2020.586176
2. Zumsteg A, Christofori G. Corrupt policemen: Inflammatory cells promote tumor angiogenesis. Curr Opin Oncol. 2009; 21(1): 60-70. doi: 10.1097/CC0.0b013e32831bed7e
3. Семиглазов В.Ф. Иммунология рака молочной железы. М.: СИМК; 2019.
4. Jain KK. Biomarkers personalized medicine. In: The Handbook of Biomarkers. New York: Humana Press; 2017.
5. Brockhoff G, Seitz S, Weber F, Zeman F, KlinkhammerSchalke M, Ortmann O, et al. The presence of PD-1 positive tumor infiltrating lymphocytes in triple negative breast cancers is associated with a favorable outcome of disease. Oncotarget. 2017; 9(5): 6201-6212. doi: 10.18632/oncotarget.23717
6. Талахадзе Н.Т., Стефано З., Воротников И.К., Чхиквадзе Н.В., Нечушкин М.И., Петровский А.В. и др. Классификация злокачественных опухолей молочной железы по системе TNM: необходимость перемен. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2012; 23(1): 69-76.
7. Осинский С.П. Микроокружение опухолевых клеток. Здоров>я Укра1ни. 2012; (12): 34-36.
8. Каприн А.Д., Рожкова Н.И. (ред.). Маммология: национальное руководство.. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2016.
9. Hanahan D, Coussens LM. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 2012; 21(3): 309-322. doi: 10.1016/j.ccr.2012.02.022
10. Немцова М.В., Кушлинский Н.Е. Молекулярно-биоло-гические маркеры в практической онкологии. Лабораторная служба. 2014; 3(1): 14-22.
11. Гергенретер Ю.С. Морозова О.Л., Захарова Н.Б. Маркеры опухолевого микроокружения при спонтанной и индуцированной инкубации биоптатов рака молочной железы. Сеченовский вестник. 2021; 12(1): 71-80. doi: 10.47093/22187332.2021.12.1.50-59
REFERENCES
1. Korkaya H, Orsulic S. Editorial: The tumor microenvironment: recent advances and novel therapeutic approaches. Front Cell Dev Biol. 2020; 8: 586176. doi: 10.3389/fcell.2020.586176
2. Zumsteg A, Christofori G. Corrupt policemen: inflammatory cells promote tumor angiogenesis. Curr Opin Oncol. 2009; 21(1): 60-70. doi: 10.1097/CC0.0b013e32831bed7e
3. Semiglazov VF. Breast cancer immunology. Moscow: SIMK; 2019. (In Russ.).
4. Jain KK. Biomarkers personalized medicine. In: The Handbook of Biomarkers. New York: Humana Press; 2017.
5. Brockhoff G, Seitz S, Weber F, Zeman F, KlinkhammerSchalke M, Ortmann O, et al. The presence of PD-1 positive tumor infiltrating lymphocytes in triple negative breast cancers is associated with a favorable outcome of disease. Oncotarget. 2017; 9(5): 6201-6212. doi: 10.18632/oncotarget.23717
6. Talakhadze NT, Stefano Z, Vorotnikov IK, Chkhikvadze NV, Nechushkin MI, Petrovsky AV, et al. Classification of malignant breast tumors according to the TNM system: The need for change. Journal of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center. 2012; 23(1): 69-76. (In Russ.).
7. Osinsky SP. Microenvironment of tumor cells. Zdorov'ya Ukraini. 2012; (12): 34-36. (In Russ.).
8. Kaprin AD, Rozhkova NI (eds). Mammology: National guidelines. Moscow: GEOTAR-Media; 2016. (In Russ.).
9. Hanahan D, Coussens LM. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 2012; 21(3): 309-322. doi: 10.1016/j.ccr.2012.02.022
10. Nemtsova MV, Kushlinsky NE. Molecular biological markers in practical oncology. Laboratory Service. 2014; 3(1): 14-22. (In Russ.).
11. Gergenreter YuS, Morozova OL, Zakharova NB. Markers of tumor microenvironment during spontaneous and induced incubation of breast cancer biopsies. Sechenov Medical Journal. 2021; 12(1): 71-80. (In Russ.). doi: 10.47093/2218-7332.2021.12.1.50-59
Сведения об авторах
Гергенретер Юлия Сергеевна - врач-онколог, ГБУЗ МО «Московский областной онкологический диспансер», e-mail: yuliya-gergenreter@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-4483-6163 Барулина Марина Александровна - доктор физико-математических наук, заведующая лабораторией анализа и синтеза динамических систем в прецизионной механике, Институт проблем точной механики и управления РАН, e-mail: marina@barulina.ru, https://orcid.org/0000-0003-3867-648X
Масляков Владимир Владимирович - доктор медицинских наук, профессор кафедры хирургических болезней, Саратовский медицинский университет «Реавиз», e-mail: maslyakov@inbox.ru, https://orcid.org/0000-0001-6652-9140
Захарова Наталия Борисовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики, ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России, e-mail: lipidgormon@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9410-2240
Фёдоров Владимир Эдуардович - доктор медицинских наук, профессор кафедры хирургии и онкологии, ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России, e-mail: v.e.fedorov@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-4586 6591
Information about the authors
Yulia S. Gergenreter - oncologist, Moscow Regional Oncologic Dispensary, e-mail: yuliya-gergenreter@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-4483-6163
Marina A. Barulina - Dr. Sc. (Phys. and Math.), Head of Laboratory of the Analysis and Synthesis of Dynamic Systems in Precision Mechanics, Institute of Precision Mechanics and Control, Russian Academy of Sciences, e-mail: marina@barulina.ru, https://orcid.org/0000-0003-3867-648X
Vladimir V. Maslyakov - Dr. Sc. (Med.), Professor at the Department of Surgical Diseases, Samara Medical University Reaviz, e-mail: maslyakov@inbox.ru, https://orcid.org/0000-0001-6652-9140 Natalia B. Zakharova - Dr. Sc. (Med.), Professor at the Department of Clinical Laboratory Diagnostics, Saratov State Medical University named after V.I. Razumovskiy, e-mail: lipidgormon@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9410-2240
Vladimir E. Fedorov - Dr. Sc. (Med.), Professor, Professor at the Department of Surgery and Oncology, Saratov State Medical University named after V.I. Razumovskiy, e-mail: v.e.fedorov@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-4586-6591
