CC BY
16
Медицинская иммунология Medical Immunology (Russia)/
2019, Т. 21, № Z Оригинальные статьи Meditsinskaya Immunologiya
стр. 821-834 ^ , . . . . 2019, Vol. 21, No 5, pp. 821-834
© 2019, спбро рааки Original articles © 2019, spb raaci
АНАЛИЗ ЦИТОАРХИТЕКТОНИКИ TLR2+ И TLR4+ ЛИМФОЦИТОВ И ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ Gp2, Spi-B, Nf-kBI, с-REL, TNFa И TNFr В КАЛТ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ И ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЙ ПЕНТОКСИФИЛЛИНА
Деген А.С.1, Коваль Г.Д.2, Сухомлинова И.Е.1, Морозова О.В.1, Камышный А.М.1
1 Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
2 Буковинский государственный медицинский университет, г.Черновцы, Украина
Резюме. Критически важными в развитии СД 1 типа являются изменения состояния кишечно-ас-социированной лимфоидной ткани (КАЛТ) и состава микробиома кишечника как в условиях экспериментального STZ-индуцированного диабета, так и при развитии СД 1 типа у людей и хронического воспаления за счет стимуляции врожденного звена иммунитета. Одним из наиболее важных посредников во взаимодействии между кишечным микробиомом и КАЛТ являются специализированные М-клетки фолликул-ассоциированного эпителия, обеспечивающие трансцитотическую доставку антигенов подлежащим лимфоидным структурам. Вспомогательную роль в образовании М-клеток играет и TNFa-сигнализация. Поэтому целью нашей работы было изучение особенностей экспрессии TLRs и транскрипционной активности генов Gp2, Spi-B, Nf-kB1, с-Rel, TNFa и TNFr в КАЛТ при экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) и после введения пентоксифиллина. Для идентификации TLR2+ клеток и TLR4+ клеток применяли иммунофлюоресцентный метод с использованием моноклональных антител к соответствующим паттерн-распознающим рецепторам. Для изучения транскрипционной активности генов использовали метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЛР). В ходе развития экспериментальной патологии длительностью 2 и 4 недели наблюдалось снижение суммарной плотности TLR2+ и TLR4+ лимфоцитов в СПСОВ и ИЛФ подвздошной кишки крыс. При этом плотность TLR2 на мембране иммунопо-зитивных клеток увеличивалась у малых, а TLR4 — у средних и малых лимфоцитов. Введение пентоксифиллина диабетическим крысам приводило к снижению суммарной плотности TLR2+ клеток на 2-й неделе развития патологии и к увеличениию данного показателя на 4-й неделе. Суммарная плотность TLR4+ клеток демонстрировала динамику к росту только в СПСОВ на 2-й неделе развития ЭСД на фоне введения пентоксифиллина. Изменения плотности TLR2 иTLR4 на поверхности лимфоцитов носили разнонаправленный характер. Развитие диабета нашло свое отражение и в транскрипционной индукции генов ключевых транскрипционных факторов NF-kB1 и c-Rel в клетках КАЛТ как на 2-й, так и на 4-й неделе развития ЭСД. Тогда как введение пентоксифиллина достоверно снижало уровень нормализованной экспресии мРНК NF-kB1 в течение всего срока наблюдений и увеличивало данный показатель для мРНК c-Rel на 2-й неделе. Отмечен рост нормализованной
Адрес для переписки: Address for correspondence:
Деген Анна Сергеевна Degen Anna S.
Запорожский государственный медицинский университет Zaporozhye State Medical University
69035, Украина, г. Запорожье, пр. Маяковского, 26. 69035, Ukraine, Zaporozhye, Mayakovsky ave., 26.
Тел.: +38(067) 935-45-83, (099) 069-52-28. Phone: +38 (067) 935-45-83, (099) 069-52-28.
E-mail: annadegenjena@gmail.com E-mail: annadegenjena@gmail.com
Образец цитирования:
А.С. Деген, Г.Д. Коваль, И.Е. Сухомлинова, О.В. Морозова, А.М. Камышный «Анализ цитоархитектоники ПЯ2+ и ПЯ4+ лимфоцитов и транскрипционной активности генов Gp2, Spi-B, ф-кВ1, с-Ш, ТШа и ТШг в КАЛТ крыс при экспериментальном сахарном диабете и после введений пентоксифиллина» //Медицинская иммунология, 2019. Т. 21, № 5. С. 821-834. doi: 10.15789/1563-0625-2019-5-821-834
© Деген А.С. и соавт, 2019
For citation:
A.S. Degen, G.D. Koval, I.E. Sukhomlinova, O.V. Morozova, A.M. Kamyshnyi "Analysis of cytoarchitectonics of TLR2+ and TLR4+ lymphocytes and transcriptional activity of the genes Gp2, Spi-B, Nf-kB1, c-Rel, TNFa and TNFr in GALT of rats in experimental diabetes mellitus and after pentoxifylline administration", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2019, Vol. 21, no. 5, pp. 821-834.
doi: 10.15789/1563-0625-2019-5-821-834 DOI: 10.15789/1563-0625-2019-5-821-834
экспресии маркеров М-клеток Gp2 и Spi-B как на 2-й, так и на 4-й неделе развития экспериментальной патологии. Введение пентоксифиллина диабетическим животным в большей степени нашло свое отражение в изменении интенсивности экспрессии мРНК маркера зрелых М-клеток Gp2 — данный показатель увеличивался на 2-й неделе развития патологии, а на 4-й демонстрировал динамику к снижению. Развитие ЭСД приводило к достоверному повышению уровня нормализованной экспрессии провоспалительного цитокина TNFa и его рецептора TNFr и демонстрировало динамику к снижению на фоне введения пентоксифиллина диабетическим животным.
Ключевые слова: экспериментальный сахарный диабет, кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань, TLR2, TLR4, M-клетки, пентоксифиллин
ANALYSIS OF CYTOARCHITECTONICS OF TLR2+ AND TLR4+ LYMPHOCYTES AND TRANSCRIPTIONAL ACTIVITY OF THE GENES Gp2, Spi-B, Nf-kB1, с-REL, TNFa AND TNFr IN GALT OF RATS IN EXPERIMENTAL DIABETES MELLITUS AND AFTER PENTOXIFYLLINE ADMINISTRATION
Degen A.S.a, Koval G.D.b, Sukhomlinova I.E.a, Morozova O.V.a, Kamyshnyi A.M.a
aZaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine b Bukovinian State Medical University, Chernivtsi, Ukraine
Abstract. Changes in the state of gut-associated lymphoid tissue (GALT) and the composition of the intestinal microbiome, both in experimental STZ-induced diabetes and in development of type 1 diabetes in humans as well as chronic inflammation due to stimulation of innate immunity are crucially important in the development of type 1 diabetes mellitus. One of the most important mediators for interactions between the intestinal microbiome and GALT are specialized M cells of the follicle-associated epithelium, providing transcytotic delivery of antigens to the underlying lymphoid structures. TNFa-signaling also plays a supporting role in the formation of M cells. Therefore, the aim of our work was to study some features of TLRs expression and transcriptional activity of the Gp2, Spi-B, Nf-kB1, c-Rel, TNFa and TNFr genes in GALT in experimental diabetes mellitus (EDM), and after pentoxifylline administration. To identify TLR2+ cells and TLR4+ cells, an immunofluorescence method was used with monoclonal antibodies to corresponding pattern-recognizing receptors. To study the transcriptional activity of genes, the method of real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used. In the course of developing experimental pathology, at the terms of 2 and 4 weeks, a decrease in the total density of TLR2+ and TLR4+ lymphocytes was observed in lamina propria of villus (villus) and subepithelial zone isolated lymphoid follicles (ILF) of rat ileum. At the same time, the density of TLR2 on the membrane of immunopositive cells was increased for small lymphocytes, and TLR4 density has became higher in medium and small lymphocytes. The pentoxifylline administration to diabetic rats resulted in a decrease in the total density of TLR2+ cells at the 2nd week of development of the pathology, and an increase in this index at the 4th week. The total density of TLR4+ cells showed changing growth rates only in villus at the 2nd week of EDM development in the presence of pentoxifylline. Changes in the density of TLR2 and TLR4 on the surface of lymphocytes were multidirectional. The development of diabetes is also reflected in the transcriptional induction of genes of the key transcription factors NF-kB1 and c-Rel in GALT cells at both the 2nd and 4th week of the development of EDM. Meanwhile, administration of pentoxifylline resulted in a significantly reduced level of normalized expression of NF-kB1 mRNA during the entire observation period and increased this indicator for c-Rel mRNA at the 2nd week. The growth of normalized expression of markers of M cells Gp2 and Spi-B was observed both on the 2nd and on the 4th week of the development of experimental pathology. Administration of pentoxifylline to diabetic animals was largely reflected in the change in the intensity of mRNA expression of the mature M cell Gp2 marker. This parameter was increased during the 2nd week of developing pathology, and on the 4th week, a downward trend was shown. The development of EDM led to a significantly increased level of near-normalized expression of proinflammatory TNFa cytokine and its receptor TNFr, and demonstrated a trend towards their decrease following pentoxifylline administration in diabetic animals.
Keywords: experimental diabetes mellitus, gut-associated lymphoid tissue, TLR2, TLR4, Mcells, pentoxifilline
Введение
Помимо генетической предрасположенности, триггерами развития СД 1 типа являются изменения состояния кишечно-ассоциирован-ной лимфоидной ткани (КАЛТ) и состава ми-кробиома кишечника как индуктора развития феномена «подтекания» ("leaky gut") слизистой ЖКТ и хронического воспаления за счет стимуляции врожденного звена иммунитета [4]. Ряд исследователей указывает на изменения состава кишечного микроба как в условиях экспериментального STZ-индуцированного диабета, так и при развитии СД 1 типа у людей [20, 22, 27], что приводит к закономерному изменению уровня микроб-ассоциированных молекулярных паттернов (МАМП) для рецепторов врожденного иммунитета (РВИ).
Ранее мы показали изменения экспрессии NOD-подобных рецепторов (NLR), являющихся сенсорами структурных компонентов бактериального пептидогликана — мурамилди-пептидов [1], а также сенсоров вирусной РНК RIG-I-рецепторов в КАЛТ крыс при экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) [5]. Кроме того, еще одним критическим триггером старта и прогрессии СД 1 типа является изменение интенсивности экспрессии мембранных Toll-подобных рецепторов (TLRs). В последние годы описана конститутивная экспрессия TLR-клетками адаптивного звена иммунного ответа, а именно Т-лимфоцитами [9]. При этом TLR2 и TLR4, распознающие лиганды практически всего микробного мира, передают активационный сигнал через адапторные молекулы MyD88, TIRAP, TRIF, TRAM, что приводит к формированию активных димеров ядерного фактора NF-kB — RelA (p65), c-Rel, RelB и белков-предшественников NF-kB1 (p105) и NF-kB2 (p100). Димеры NF-kB далее транспортируются в ядро и индуцируют транскрипцию генов провоспалительных цитокинов и хемокинов (TNFa, IL-1ß, IL-18, IL-12, IL-6, CXCL8), костимулирующих молекул (CD40, CD80 и CD86) [10].
Среди таких NF-кВ-индуцируемых цито-кинов важную роль в старте и прогрессии СД 1 типа играет TNFa, основным источником которого являются макрофаги и активированные Т-лимфоциты КАЛТ [23]. У NOD-мышей, дефицитных по TNFR1, наблюдается устойчивость к старту СД 1 типа, а инсулит протекает в более легкой форме. Вместе с тем у данных животных отмечалось увеличение количества Treg и усиление их супрессорной активности. Возможно, что блокада TNF-сигналинга — это один из механизмов активизации функций Treg и супрессии СД 1 типа [8]. Одним из неселективных блокаторов TNFa является пентоксифиллин.
Критически важным посредником во взаимодействии между кишечным микроби-омом и КАЛТ являются специализированные М-клетки фолликул-ассоциированного эпителия [19], способные фагоцитировать макромолекулы и микроорагнизмы, доставляя их подлежащим лимфоидным структурам для индукции иммунных реакций. На апикальной мембране М-клеток экспрессируется гликопротеин Gp2 [21], а их дифференцировку регулирует транскрипционный фактор Spi-B [25]. Важную вспомогательную роль в образовании М-клеток играет и TNFa-сигнализация [29]. Поэтому целью нашей работы было изучение особенностей экспрессии TLRs и транскрипционной активности генов Gp2, Spi-B, Nf-kB1, с-Rel, TNFa и TNFr в КАЛТ при экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) и после введения пентоксифиллина.
Материалы и методы
Исследования были проведены на 80 самцах крыс линии Wistar. Животные были получены из питомника ООО «Биомодельсервис» (Киев). Экспериментальные животные были разделены на 5 экспериментальных групп: контрольные крысы, которым однократно внутрибрю-шинно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рН = 4,5) (группа 1); крысы с 14-дневным ЭСД (группа 2); крысы с 28-дневным ЭСД (группа 3); крысы с 14-дневным (группа 4) и с 28-дневным ЭСД (группа 5), которым перорально ежедневно в течение, соответственно, 2 и 4 недель вводили пентоксифиллин в дозе 9 мг/кг, начиная с 1 дня индукции диабета. Стрептозотоцин (STZ) (SIGMA Chemical, США) вводили крысам вну-трибрюшинно в дозе 50 мг/кг, разведенным в 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рН 4,5) перед моментом введения. Определение концентрации глюкозы в крови, которую брали из хвостовой вены, проводили глюкозооксидазным методом с использованием прибора BIONIME Rightest GM 110 (Швейцария) через 12 часов и на 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 и 28 сутки после инъекции STZ. Измерение уровня гликемии проводили через 6 часов с момента последнего приема пищи. На 3 сутки после введения стрептозотоцина для дальнейших исследований отбирали животных с уровнем гликемии натощак > 8,0 ммоль/л.
Структуру популяции TLR2- и TLR4-клеток изучали на основе анализа серийных гистологических срезов и данных их морфометрических и денситометрических характеристик. Для проведения данного исследования на ротационном микротоме MICROM HR-360 (Microm, Германия) делали 5-микронные серийные срезы подвздошной кишки, которые потом депарафи-нировали в ксилоле, проводили регидратацию
в нисходящих концентрациях этанола (100%, 96%, 70%), отмывали в 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7,4) и инкубировали с первичными кроличьими моноклональными антителами (МКАТ) к TLR2- и TLR4-рецепторам крысы, конъюги-рованными с FITC (Santa Cruz Biotechnology, США) в течение 18 часов во влажной камере при Т = 4 °С. После инкубации срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером и заключали в смесь глицерина и фосфатного буфера (9:1) для дальнейшего изучения при помощи люминесцентной микроскопии. Обработанные гистологические срезы изучали при помощи компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Изображение, полученное на микроскопе PrimoStar (ZEISS, Германия) в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390 нм (FITC) при помощи высокочувствительной камеры AxioCam 5c (ZEISS, Германия) и пакета программ для получения, архивации и подготовки изображений к публикации AxioVision 4.7.2 (ZEISS Германия), немедленно вводилось в компьютер. При этом в автоматическом режиме определялись зоны со статистически значимой флюоресценцией, характерной для клеток, экспрессирующих TLR2 и TLR4. Определялись морфометрические и денситометрические характеристики иммунопозитивных клеток, абсолютная (количество клеток на 1 мм2 площади среза) и относительная (%) плотность распределения TLR2- и TLR4-лимфоцитов. Плотность TLR2-и TLR4-рецепторов на мембране лимфоцитов определяли, учитывая интенсивность флюоресценции идентифицированных клеток и неспецифическую флюоресценцию препарата (так называемый фон). На основании этих показателей вычислялась корректированная клеточная флюоресценция (в условных единицах интенсивности флюоресценции УЕИФ): Integrated Density (интегрированная плотность) — (площадь выделенных клеток х среднюю флюоресценцию фона). При окрашивании МКАТ определяли TLR2- и TLR4-клетки, расположенные в собственной пластинке слизистой оболочки ворсинок (СПСОВ) и в субэпителиальной зоне изолированных лимфоид-ных фолликулов (ИЛФ), которые являются, соответственно, эффекторными и индуктивными зонами иммунного ответа в КАЛТ.
Для анализа экспрессии генов использовали метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЛР). В ходе этого исследования кусочки ткани, залитые в парафин, нарезали на микротоме (толщина среза 15 мкм) и помещали в пробирки Эппендор-фа (Eppendorf AG, Германия) депарафинировали путем инкубации последовательно, дважды в ксилоле, по 5 минут каждый, затем последовательно, дважды в 100% этаноле, в течение 5 минут каждый.
Выделение тотальной РНК из тканей крыс проводили согласно протоколу с использованием набора Trizol RNA Prep 100 («ИЗОГЕН», РФ), который содержит следующие реагенты: Trizol reagent и ExtraGene Е. Концентрацию и качество выделенной тотальной РНК определяли на спектрофотометре Libra S32PC (Biochrom Ltd., Великобритания). Для последующей процедуры обратной транскрипции отбирали образцы РНК со следующими показателями (по соотношениям оптической плотности А260 / А280): 260 нм/280 нм = 2, 260 нм/230 нм = 1,8-2,2.
Для обратной транскрипции (синтез кДНК) использовали «Набор реагентов для проведения обратной транскрипции (ОТ)» («СИНТОЛ», РФ). RT-PCR проводили на конечном объеме 25 мкл, содержащем 10 мкл готовой реакционной смеси 2,5Х, 11 мкл деионизированной Н2О, 1 мкл праймеров Random-6, 1 мкл обратной транскриптазы и 2 мкг РНК. Обратную транскрипцию проводили при 45 °С в течение 45 минут с последующим нагреванием в течение 5 мин при 92 °С. Амплификацию проводили на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) с мастер-мик-сом Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific). Финальная реакционная смесь для амплификации включала краситель SYBR Green, ДНК-полимеразу Maxima HotStartTaq DNA Polymerase, по 0,2 мкл прямого и обратного специфических праймеров, 1 мкл матрицы (кДНК). Реакционную смесь доводили до общего объема 25 мкл добавлением деионизи-рованной Н2О. Специфические пары праймеров (5'-3') для анализа исследованных и референсно-го генов были подобраны с помощью программного обеспечения PrimerBlast (www.ncbi.nlm.nih. gov/tools/primer-blast) и изготовлены фирмой Metabion (Германия) (см. табл. 1).
После начальной денатурации в течение 10 мин при 95 °C амплификация состояла из 45 циклов и проводилась при таких условиях: денатурация — 95 °С, 15 с, отжиг — 59-61 °С, 30-60 с, элонгация — 72 °С, 30 с. В качестве референс-гена для определения относительного значения изменения уровня экспрессии исследованных генов был использован ген глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH). Относительное нормализованное количество кДНК таргетных генов определяли по методу Ct. Статистический анализ данных ПЦР проводили при помощи программного обеспечения CFX Manager™ (Bio-Rad, США). В эксперимент были включены негативные контроли: без добавления кДНК-матрицы в реакцию ПЦР, без добавления мРНК-матрицы в синтезе кДНК, без добавления фермента в син-
ТАБЛИЦА 1. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРАИМЕРЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
TABLE 1. SPECIFIC PRIMERS WHICH WERE USED IN REAL-TIME RT-PCR
Ген Gen Нуклеотидная последовательность праймера Nucleotide sequence of the primer Тпл, °С Tm, °С Длина продукта ПЦР, п. н. PCR product length, n. p. Экзон-экзонный стык Exon-exon joint
Gp2 F = ACTCCCCGAAGTACAGGGTT R = AGACAGGCAGGAAGAACGTG 60 60 55 1633/1634
SpiB F = GAACCACCATGCTTGCTCTG R = TCTGGGTACTGCAAACAGCTT 59 60 70 59/60
Nfkbl F = ATATGCACCGTGACAGCAGG R = GTTTGCAAAGCCAACCACCA 60 60 51 752/753
cRel F = GTCAAGGGAAGGAGCTGTCG R = GGATTATATCCGCCGAGCCC 60 60 41 64/65
Tnf (TNFa) F = CTCGAGTGACAAGCCCGTAG R = GCTTGGTGGTTTGCTACGAC 60 60 45 433/434
Tnfrsfla (TNFr) F = AACGGCTTGACACTGCAGAC R = CACAGCATACAGCATCGCAG 61 60 41 1315/1316
GAPDH (NM_017008.4) F = GCCTGGAGAAACCTGCCAAG R = GCCTGCTTCACCACCTTCT 61 60 52 825/826
Примечание. F - прямой праймер; R - обратный праймер; Тпл - температура плавления.
Note. F, direct primer; R, reverse primer; Tm, melting point.
тезе кДНК. Все реакции амплификаци проводили на индивидуальных образцах в трех повторах.
Все полученные экспериментальные данные обрабатывались на персональном компьютере пакетом прикладных и статистических программ Excel из пакета MS Office 2010 (Microsoft Corp., США), Statistica 13 (TIBCO Software Inc., 2018). Для всех показателей рассчитывали значения средней арифметической выборки (М), ее дисперсии и ошибки средней (m). Для определения достоверности отличий результатов исследования в экспериментальных и контрольных группах животных определяли коэффициент Стью-дента (t), потом определяли вероятность разницы выборок (р) и доверительный интервал средней. Критичный уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.
Результаты
Введение экспериментальным животным STZ приводило к развитию ЭСД. Таким образом, на второй неделе развития патологического процесса концентрация глюкозы в крови у крыс линии Wistar увеличивалась в 3,1 раза (9,78±0,71 ммоль/л, р < 0,05) по сравнению с контролем (3,13±0,12 ммоль/л), на 28-й день увеличивалась в 2,1 раза (6,48±0,84 ммоль/л, р < 0,05) по сравнению с контролем (3,13±0,12 ммоль/л). А также появлялись все основные симптомы, характерные для сахарного диабета 1 типа (полидипсия, гиперфагия и полиурия). Изучение
серийных срезов подвздошной кишки контрольных крыс линии Wistar, предварительно инкубированных с МКАТ к рецепторам крысы показало, что суммарная плотность клеток в собственной пластинке слизистой оболочки ворсинок (СПСОВ) составляла 70±1 на 1 мм2, что приблизительно совпадает с их количеством и в субэпителиальной зоне изолированных лимфо-идных фолликулов (ИЛФ) (рис. 1А).
Развитие диабета сопровождалось снижением суммарной плотности TLR2+ клеток в СПСОВ на 37% (р < 0,05) на 14-й день и в 2,3 раза (р < 0,05) на 28-й день экспериментального сахарного диабета, а в ИЛФ на 26% (р < 0,05) на 14-й день и в 2,1 раза (р < 0,05) на 28-й день экспериментального сахарного диабета по сравнению с контролем (рис. 1А).
Введение диабетическим животным пенток-сифиллина сопровождалось достоверным снижением суммарной плотности популяции клеток в СПСОВ на 41% (р < 0,05) на 14-й и увеличением этого показателя на 81% (р < 0,05) на 28-й день развития ЭСД (рис. 1Б). На фоне введения пентоксифиллина наблюдались изменения и в субэпителиальной зоне ИЛФ. Так, суммарная плотность популяции клеток
на 2-й неделе развития патологии снижалась на 14% (р < 0,05), но уже на 4 неделе возрастала на 84% (р < 0,05) по сравнению с группами диабетических животных, которым препарат не вводили (рис. 1Б).
Измерение интенсивности флюоресценции TLR2+ клеток, что отображает плотность TLR2 на мембране иммунопозитивных клеток, показало достоверное снижение данного параметра в ходе развития диабета у TLR2+ лимфобластов в СПСОВ (на 11-12%, р < 0,05) на 2-й и на 4-й неделе (рис. 2А) и у TLR2+ средних лимфоцитов (на 4%, р < 0,05) на 4-й неделе развития ЭСД (рис. 2Б) по сравнению с контролем, а у TLR2+ малых лимфоцитов этот показатель увеличивался на 4% (р < 0,05) на 14-й день развития экспериментальной патологии (рис. 2В). Введение диабетическим животным пентоксифиллина нашло отображение в незначительном увеличении интенсивности флюоресценции TLR2+ средних лимфоцитов на 2-3% (р < 0,05) на 2-й и 4-й неделе развития патологии по сравнению с диабетическими интактными животными (рис. 2Б).
В субэпителиальной зоне ИЛФ наблюдались схожие изменения при развитии экспериментальной патологии по сравнению с контролем: снижалась интенсивность флюоресценции у TLR2+ лимфобластов и TLR2+ средних лимфоцитов на 28-й день развития ЭСД (на 10% и 4%, р < 0,05 соответственно) (рис. 2А, Б), однако этот показатель увеличивался у TLR2+ малых лимфоцитов на 2% (р < 0,05) на 14-й день развития ЭСД (рис. 2В). Введение диабетическим животным пентоксифиллина приводило к разнонаправленным изменениям интенсивности флюоресценции TLR2+ клеток: снижалась у TLR2+ лимфобластов на 4% (р < 0,05) на 14-й день развития ЭСД (рис. 2А), увеличивалась у TLR2+ средних лимфоцитов (на 2-6%, р < 0,05) на 2-й и 4-й неде-
ле (рис. 2Б) и у TLR2+ малых лимфоцитов (на 6%, р < 0,05) на 4-й неделе (рис. 2В) развития патологии по сравнению с аналогичными показателями у интактных диабетических животных.
Изучение серийных срезов подвздошной кишки контрольных крыс линии Wistar, предварительно инкубированных с МКАТ к рецептору TLR4, показало, что суммарная плотность TLR4+ клеток в собственной пластинке слизистой оболочки ворсинок (СПСОВ) составляла 60±1 на 1 мм2, что приблизительно совпадает с их количеством и в субэпителиальной зоне изолированных лимфоидных фолликулов (ИЛФ) — 54±3 на 1 мм2 (рис. 3А).
Развитие диабета сопровождается снижением суммарной плотности TLR4+ клеток в СПСОВ на 27% (р < 0,05) на 14-й день и на 25% (р < 0,05) на 28-й день экспериментального сахарного диабета, а в ИЛФ на 24% (р < 0,05) на 28-й день экспериментального сахарного диабета по сравнению с контролем (рис. 3А).
Введение диабетическим крысам линии Wistar пентоксифиллина сопровождалось достоверным увеличением плотности популяции TLR4+ клеток в СПСОВ на 14-й день развития ЭСД на 30% (р < 0,05) по сравнению с интактными диабетическими животными (рис. 3Б).
Измерение интенсивности флюоресценции TLR4+ клеток, что отражает плотность TLR4 на мембране иммунопозитивных клеток, показало следующие изменения. В СПСОВ достоверно увеличивался этот показатель у TLR4+ средних лимфоцитов на 1,4% (р < 0,05) и на 4% (р < 0,05) на 14-й и 28-й день развития ЭСД соответственно
А (A)
80 л
70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 -0
TLR2+ клетки (диабет) TLR2+ cells (diabetes)
Б (B)
70 1 60 -50 -40 -30 -20 -10 -0
TLR2+ клетки (диабет + ПФ) TLR2+ cells (diabetes + PF)
Диабет 2 Diabet 2
Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ
Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF
СПСОВ Villus ■■ ИЛФ Субэпит ILF Subep
СПСОВ Villus ИЛФ Субэпит ILF Subep
Рисунок 1. Суммарная плотность (на 1 мм2) TLR2+ клеток в СПСОВ (villus) и субэпителиальной зоне ИЛФ (ILF Subep) при развитии диабета (2 и 4 недели) и введения пентоксифиллина (PF) диабетическим животным Примечание. * - p < 0,05.
Figure 1. Total density (per 1 mm2) of TLR2+ cells in lamina propria of villus mucous layer (Villus) and in subepithelial zone of the ILF (ILF Subep) during the development of diabetes (2 and 4 weeks) and the administration of pentoxifylline (PF) to diabetic animals Note. *, p < 0.05.
А (A)
0,84 -, 0,82 -0,8 -0,78 -0,76 -0,74 -0,72 -0,7 -0,68 -0,66 0,64
Контроль Control
TLR2 лимфобласты TLR2 lymphoblasts
Диабет 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ
Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF
СПСОВ Villus ИЛФ Субэпит ILF Subep
Б (B)
0,405-i 0,40,395 -0,390,3850,38 -0,375 -0,370,3650,36
TLR2 средние лимфоциты TLR2 middle lymphocytes
Контроль Control
Диабет 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ
Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF
СПСОВ Villus ИЛФ Субэпит ILF Subep
В (C) TLR2 малые лимфоциты
TLR2 small lymphocytes
0,235-i 0,230,2250,220,215 -0,21
Контроль Control
Диабет 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ
Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF
■ СПСОВ Villus ■ ИЛФ Субэпит ILF Subep
Рисунок 2. Плотность TLR2 на мембране иммунопозитивных клеток (Еиф)
Примечание. * - р < 0,05 по отношению к контролю; ** - р < 0,05 по отношению к диабету 2; *** - р < 0,05 по отношению к диабету 4.
Figure 2. Density of TLR2 on the membrane of immunopositive cells (fluorescence intensity in arbitrary units, AU) Note. *, р < 0.05 relative to the control; **, р < 0.05 relative to the diabetes 2; ***, р < 0.05 relative to the diabetes 4.
А (A)
TLR4+ клетки (диабет) TLR4+ cells (diabetes)
Б (B) TLR4+ клетки (диабет + ПФ)
TLR4+ cells (diabetes + PF)
70 ! 60 -50 -40 -30 -20 -10 -0
60 i
50 -
40 -
30 -
20 -
10 -
Контроль Control
Диабет 2 Диабет 4 0 - Диабет 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ
Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF
СПСОВ Villus ■ ИЛФ Субэпит ILF Subep
СПСОВ Villus ■ ИЛФ Субэпит ILF Subep
Рисунок 3. Суммарная плотность (на 1 мм2) TLR4+ клеток в СПСОВ (Villus) и субэпителиальной зоне ИЛФ (ILF Subep) при развитии диабета (2 и 4 недели) и введения пентоксифиллина (PF) диабетическим животным
Примечание. * - p < 0,05.
Figure 3. Total density (per 1 mm2) of TLR4+ cells in lamina propria of villus mucous layer (Villus) and in subepithelial zone of the ILF (ILF Subep) during the development of diabetes (2 and 4 weeks) and the administration of pentoxifylline (PF) to diabetic animals Note. *, p < 0.05.
(рис. 4Б), а у TLR4+ малых лимфоцитов на 4,2% (р < 0,05) и на 5,2% (р < 0,05) в этих же группах экспериментальных животных (рис. 4В). Аналогичные изменения наблюдались и в ИЛФ: на 4-й неделе развития экспериментального СД увеличивалась интенсивность флюоресценции TLR4+ средних лимфоцитов и TLR4+ малых лимфоцитов на 4% (р < 0,05) (рис. 4Б, В). Введение диабетическим животным пентоксифиллина приводило к достоверным изменениям интенсивности флюоресценции только у TLR4+ средних лимфоцитов в СПСОВ (рис. 4Б). Этот показатель увеличивался на 2,6% (р < 0,05) на 14-й день и снижался на 2,5% (р < 0,05) на 28-й день развития патологии по сравнению с диабетическими животными, которые препарат не получали.
Изучение транскрипционной активности гена Gp2 в клетках подвздошной кишки крыс на 2-й неделе развития диабета показало увеличение концентрации mRNA в 3,2 раза, а на 4-й неделе — в 2,2 раза по сравнению с контрольной группой животных (рис. 5А). Уровень нормализованной экспрессии mRNA Spi-B также демонстрировал динамику к увеличению на фоне развития экспериментального диабета у животных. Так, на 14-й день развития патологии этот показатель увеличивался в 2,1 раза, а на 28-й день — в 2 раза по срав -нению с контрольной группой крыс (рис. 5Г).
Введение экспериментальным животным пентоксифиллина приводило к росту уровня экспрессии Gp2 в 6,8 раза на 2-й неделе развития ЭСД по сравнению с диабетическими интактны-
А (A)
TLR4 лимфобласты TLR4 lymphoblasts
Б (B) TLR4 средние лимфоциты В (C) TLR4 middle lymphocytes
TLR4 малые лимфоциты TLR4 small lymphocytes
ü,9 -, ü,85 -ü,8 -ü,75 -ü,7 -ü,65
Control
СПСОВ Villus ■ ИЛФ Субэпит ILF Subep
Jj
Диабет 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ Ü.36 - Контроль Диабет 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ Ü.2Ü5 - Контроль Диабет 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ
Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF Control Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF Control Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF
0,23 -
jLïnL^
rr 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ Контроль Диабет 2 Диабет 4 Диабет 2 + ПФ Диабет 4 + ПФ
^ 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF Control Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 + PF Diabet 4 + PF
СПСОВ Villus ИЛФ Субэпит ILF Subep
■ СПСОВ Villus ■ ИЛФ Субэпит ILF Subep
Рисунок 4. Плотность TLR4 на мембране иммунопозитивных клеток (Еиф)
Примечание. * - р < 0,05 по отношению к контролю; ** - р < 0,05 по отношению к диабету 2; *** - р < 0,05 по отношению к диабету 4.
Figure 4. Density of TLR4 on the membrane of immunopositive cells (fluorescence intensity in arbitrary units, AU) Note. *, р < 0.05 relative to the control; **, р < 0.05 relative to the diabetes 2; ***, р < 0.05 relative to the diabetes 4.
А (A) mRNA Gp2 (диабет)
* ' mRNA Gp2 (diabetes)
Б (B) mRNA Gp2 (диабет 2 нед. + ПФ) mRNA Gp2 (diabetes 2 weeks + PF)
В (C) mRNA Gp2 (диабет 4 нед. + ПФ) mRNA Gp2 (diabetes 4 weeks + PF)
3,5ÜCÜÜ i 3,(ШЮ -2,5ÜCÜÜ -3,(ШЮ -1,5ÜCÜÜ -
f 8,CÜCÜÜ -I Ï 7,(ШЮ ^ | 6,(ШЮ ! & 5,CÜCÜÜ I J 4,(ШЮ Ü É 3,(ШЮ
Si
S 2,(ШЮ
É J 1,ÜÜCÜÜ SE K
§ Ü,CÜCQÜ
§ ft Ü
Диабет 4 + ПФ Diabet 4 + PF
Г (D) mRNA Spi-B (диабет)
mRNA Spi-B (diabetes)
Д (E) mRNA Spi-B (диабет 2 нед. + ПФ) mRNA Spi-B (diabetes 2 weeks + PF)
E (F) mRNA Spi-B (диабет 4 нед. + ПФ)
mRNA Spi-B (diabetes 4 weeks + PF)
1 I Ü,5ÜÜCÜ I ос
Контроль Диабет 2 Диабет 4
Control Diabet 2 Diabet 4 |
■ _
Диабет 2 Диабет 2 + ПФ
Diabet 2 Diabet 2 + PF
Ü.235 -
Ü42
C.4
C.39
C.38
C.37
ü.üüüüü
2.5ÜÜCÜ
Рисунок 5. Относительное нормализованное количество мРНК генов Gp2 и Spi-B в клетках подвздошной кишки крыс
Примечание. Нормализация по методу AACt с референс-геном GAPDH. Диабет 2, диабет 4 - 2- и 4-недельный ЭСД соответственно; диабет 2 + ПФ, диабет 4 + ПФ - после введения пентоксифиллина диабетическим животным.
Figure 5. Relative normalized expression of mRNA of Gp2 and Spi-B genes in rat ileum cells
Note. Normalization by the AACt method with the GAPDH reference gene. Diabetes 2, diabetes 4 - 2 and 4 week experimental diabetes mellitus, respectively; diabetes 2 + PF, diabetes 4 + PF - after the administration of pentoxifylline to a diabetic animal.
ми животными (продолжительность ЭСД 2 недели) (рис. 5Б) и достоверному снижению уровня mRNA Gp2 в 10 раз на 4-й неделе развития патологии по сравнению с диабетическими интакт-ными животными (продолжительность ЭСД 4 недели) (рис. 5В).
Введение экспериментальным животным пентоксифиллина не показало достоверного
влияния на уровень экспрессии mRNA Spi-B (рис. 5Д, Е).
Изучение относительной нормализованной экспрессии гена Щ-кВ1 в клетках подвздошной кишки крыс на 2-й неделе развития диабета показало увеличение концентрации mRNA в 10,7 раза, а на 4-й неделе — в 5,2 раза по сравнению с контрольной группой животных (рис. 6А).
Транскрипционная активность гена c-Rel также демонстрировала тенденцию к росту на фоне развития ЭСД. Так, на 14-й день развития диабета этот показатель увеличивался в 3,6 раза, а на 28-й день — в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой экспериментальных животных (рис. 6Г).
Введение экспериментальным животным пентоксифиллина приводило к снижению уровня экспрессии NF-кB1 в 3,2 раза на 2-й неделе развития ЭСД по сравнению с диабетическими интактными животными (длительность ЭСД 2 недели) (рис. 6Б), а также к достоверному снижению уровня mRNA NF-кB1 в 5 раз на 4-й неделе развития патологии по сравнению с диабетическими интактными животными (длительность ЭСД 4 недели) (рис. 6В).
Уровень нормализованной экспрессии с^е1 на фоне введения диабетическим животным пен-токсифиллина показал достоверные изменения только на 14-й день развития патологического процесса — показатель увеличивался в 7,8 раза по сравнению с диабетическими интактными животными (длительность ЭСД 2 недели) (рис. 6Д).
Уровень относительной нормализованной экспрессии mRNA TNFa в клетках подвздошной
кишки крыс на фоне развития ЭСД по сравнению с контрольной группой демонстрировал тенденцию к росту — в 31 раз на 2-й неделе развития патологического процесса и в 13,7 раза на 4-й неделе (рис. 7А). Уровень экспрессии mRNA TNFr, в свою очередь, показал достоверные изменения лишь на 14-й день развития экспериментальной патологии. Этот показатель увеличивался в 2,9 раза по сравнению с контрольными животными (рис. 7Г).
Введение диабетическим животным пенток-сифиллина приводило к снижению танскрипци-онной активности гена TNFa в 9 раз на 2-й неделе развития ЭСД по сравнению с диабетическими интактными крысами (длительность ЭСД 2 недели) (рис. 7Б), а также к достоверному снижению уровня mRNA TNFa в 3,8 раза на 4-й неделе развития патологии по сравнению с диабетическими интактными животными (длительность ЭСД 4 недели) (рис. 7В).
Транскрипционная активность гена TNFr на фоне введения диабетическим животным пен-токсифиллина показала достоверные изменения на 14-й день развития патологического процесса — снижение в 2,9 раза по сравнению с диабети-
А (A)
mRNA Nf-kb1 (диабет) mRNA Nf-kb1 (diabetes)
Контроль Control
I
Б (B)
mRNA Nf-kb1 (диабет 2 нед. + ПФ) mRNA Nf-kb1 (diabetes 2 weeks + PF)
В (C) mRNA Nf-kb1 (диабет 4 нед. + ПФ) mRNA Nf-kb1 (diabetes 4 weeks + PF)
1,20000 -
s SO
I Диабет 2 1_1_ S 0,00000 • Диабет 4 p Диабет 2 Диабет 2 + ПФ s 0,00000 • CD Диабет 4 Диабет 4 + ПФ
| Diabet 2 Diabet 4 | Diabet 2 Diabet 2 + PF Diabet 4 Diabet 4 + PF
Г (D)
J 4,00000 » 3,50000 I f 3,00000 ! ! 2,50000
I J 2,00000
J I 1,50000
! J 1,00000
! * 0,50000
I 0,00000
mRNA с-Rel (диабет) mRNA с-Rel (diabetes)
Д (E)
-
Контроль Диабет 2 Диабет 4
Control Diabet 2 Diabet 4
mRNA с-Rel (диабет 2 нед. + ПФ) mRNA с-Rel (diabetes 2 weeks + PF)
IÏ4
É 0
Е (F) mRNA с-Rel (диабет 4 нед. + ПФ) mRNA с-Rel (diabetes 4 weeks + PF)
9,00000
8,00000- *
7,00000-
6,00000-
5,00000-
4,00000-
3,00000-
2,00000-
1,00000-
000000
Диабет 2 Диабет 2 + ПФ
Diabet 2 Diabet 2 + PF
5 a
Диабет 4 + ПФ Diabet 4 + PF
Рисунок 6. Относительное нормализованное количество мРНК генов Nf-kB1 и c-Rel в клетках ИЛФ подвздошной кишки крыс
Примечание. Нормализация по методу AACt с референс-геном GAPDH. Диабет 2, диабет 4 - 2- и 4-недельный ЭСД соответственно; диабет 2 + ПФ, диабет 4 + ПФ - после введения пентоксифиллина диабетическим животным.
Figure 6. Relative normalized expression of mRNA of Nf-kB1 and c-Rel genes in rat ileum ILF cells
Note. Normalization by the AACt method with the GAPDH reference gene. Diabetes 2, diabetes 4 - 2 and 4 week experimental diabetes mellitus, respectively; diabetes 2 + PF, diabetes 4 + PF - after the administration of pentoxifylline to a diabetic animal.
12,00000
А (A)
35,00000-
I
I 30,00000* '8 25,00000-
¡ | 20,00000-S J
I g 15,00000-
Г (D)
35,00000 ¡ 30,00000" ■§ 25,000001 Ё 1 8 20,00000-
;§ J 10,00000-¡ 5,00000-d 0,00000-
mRNA TNFa (диабет) mRNA TNFa (diabetes)
Контроле Диабет 2
Control) Diabet 2
mRNA TNFr (диабет) mRNA TNFr (diabetes)
I
Б (B) mRNA TNFa (диабет 2 нед. + ПФ) mRNA TNFa (diabetes 2 weeks + PF)
Диабет 4 I Diabet 4 |
Д (E)
1,20000 1,00000
I
mRNA TNFr (диабет 2 нед. + ПФ) mRNA TNFr (diabetes 2 weeks + PF)
В (C) mRNA TNFa (диабет 4 нед. + ПФ) mRNA TNFa (diabetes 4 weeks + PF)
Е (F)
il i E
8 S S .ï S &
Диабет 2 Диабет 4 -, о 0,00000- Диабет 2 Диабет 2 + ПФ ¿5 0,0C0C0- Диабет 4 Диабет 4 + ПФ
Diabet 2 Diabet 4 Diabet 2 Diabet 2 + PF Diabet 4 Diabet 4 + PF
mRNA TNFr (диабет 4 нед. + ПФ) mRNA TNFr (diabetes 4 weeks + PF)
Рисунок 7. Относительное нормализованное количество мРНК генов TNFa и TNFr в клетках ИЛФ подвздошной кишки крыс
Примечание. Нормализация по методу AACt с референс-геном GAPDH. Диабет 2, диабет 4 - 2- и 4-недельный ЭСД соответственно; диабет 2 + ПФ, диабет 4 + ПФ - после введения пентоксифиллина диабетическим животным.
Figure 7. Relative normalized expression of mRNA of TNFa and TNFr genes in rat ileum ILF cells
Note. Normalization by the AACt method with the GAPDH reference gene. Diabetes 2, diabetes 4 - 2 and 4 week experimental diabetes mellitus, respectively; diabetes 2 + PF, diabetes 4 + PF - after the administration of pentoxifylline to a diabetic animal.
S .5 10,00000
5 №
6 5,00000
о 0,00000
¡ '« 15,00000
control
ческими интактными животными (длительность ЭСД 2 недели) (рис. 7Д), с сохранением аналогичной динамики и на 28-й день — снижение в 3,8 раза по сравнению с диабетическими интактны-ми животными (длительность ЭСД 4 недели) (рис. 7Е).
Обсуждение
Роль ^Яз в развитии СД 1 типа активно дискутируется в целом ряде работ. Так, введение новорожденным NOD-мышам бактериальных экстрактов способно предотвратить развитие СД 1 типа и это напрямую зависит от и ^Я4-зависимой продукции TGF-p [2]. Экспрессия и TLR4 в моноцитах у пациентов с СД1 усилена по сравнению со здоровыми [13], а Devaraj S. и соавт. показали, что продукция моноцитами TNFa и ^-1р также коррелирует с экспрессией и TLR4 [6]. У человека наивные CD4+ и CD8+Т-клетки экспрессируют TLR2 и мРНК, однако поверхностная экспрессия данных рецепторов в достаточной степени представлена только у активированных лимфоцитов. Усиление экспрессии TLR2 в CD4+Т-клетках
может способствовать их поляризации в направлении ТЫ-фенотипа и активировать продукцию №N7. Следует отметить, что данный эффект в наибольшей степени выражен при сочетанной активации TLR2 и ТСЯ [12], однако, если дифференцированные ТЫ-клетки рестимулировать агонистами то для продукции №N7 и про-
лиферации не будет необходимости в активации ТСЯ, но эффект может быть усилен добавлением ^-2. Также TLR2 оказывают влияние и на ТЫ7, принимая непосредственное участие в их диффе-ренцировке. Было показано, что CD4+Т-клетки, лишенные TLR2, не способны к индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) [7]. В то же время активированные CD4+Т-клетки через рестимуляцию спо-
собны к усилению продукции ^-17 [3]. Кроме того, гиперактивация способна привести
к поляризации в сторону клеток с фенотипом ТЫ7 и потере супрессорной активности. Таким образом, активация TLR2 представляет собой новый путь в регуляции провоспалительных функций ТЫ7-клеток.
Усиление сигнализации через TLR4 также может контролировать функцию CD4+T-KreTOK. Так, у TLR4-дефицитных животных, после введения ЛПС снижается способность к продукции CD4+Т-клетками IFNy, но активируется продукция IL-17 [12]. Zanin-Zhorov A. и соавт. показали, что активация TLR4 у человека способна усилить миграцию CD4+Т-клеток за счет повышения связывания фибронектина [30]. In vivo нокаут TLR4 в CD4+Т-клетках приводит к снижению продукции IFNy и IL-17 только в месте локализации воспаления, но не на периферии. Известны и противоположные данные, демонстрирующие, что делеция гена TLR4 в CD4+Т-клетках приводит к увеличению продукции IFNy и развитию воспаления. Такие различия в описанных данных можно объяснить наличием различных лигандов TLR в кишечнике по сравнению со стерильным микроокружением в ЦНС. То есть в кишечнике Т-клетки и TLR, несомненно, имеют непосредственный контакт с микробиотой и стимулирующими сигналами от нее, тогда как в ЦНС, вероятно, они будут в большей степени реагировать на сигналы от DAMP (Damage-associated molecular pattern molecules).
Обнаруженная нами индукция транскрипционной активности генов Gp2 и Spi-B может свидетельствовать о важной роли М-клеток в прогрессии диабета. Гликопротеин Gp2, экс-прессирующийся на апикальной мембране М-клеток (ранее считалось, что прерогатива экс-пресии Gp2 принадлежит ацинарным панкреатическим клеткам), взаимодействует с FimH компонентом пилей 1 типа, присутствующем у представителей комменсальной и патогенной флоры (E. coli, S. enterica серовар Typhimurium). Антигены, трансцитированные М-клетками, доставляются к незрелым дендритным клеткам, а растворимая форма Gp2 опсонизирует бактерии, несущие FimH, что в значительной степени облегчает процесс трансцитоза [11]. Процесс дифференцировки М-клеток из стволовых клеток кишечника во многом зависит от иммунных клеток КАЛТ, продуцирующих рецептор активатора лиганда ядерного фактора кВ (RANKL), который является одним из членов семейства TNF [26]. Это подтверждается тем, что у RANKL-дефицитных мышей обнаруживается значительное снижение количества М-клеток, которое может быть восстановлено после введения экзогенного рекомбинантного RANKL [15]. Кроме того, важную роль в поддержании дифферен-цировки М-клеток играет транскрипционный фактор Spi-B, экспрессия которого усиливается на ранних стадиях дифференцировки М-клеток. Было установлено что у Spi-B-/- мышей не происходила дифференцировка М-клеток [14], также
они были дефицитны по нескольким маркерам, таким как Gp2, CCL9, M-Sec и Sgen-1, что указывает на их более позднюю экспрессию. Еще одним эффектом, отмеченным для Spi-B-/- мышей, было значительное снижение уровня активации специфических Т-клеток. Megan В. Wood и соавт. обнаружили, что TNFa усиливает полноценную RANKL-зависимую экспрессию генов, участвующих в дифференцировке М-клеток, посредством канонического пути активации NF-кВ, но не способен к самостоятельной индукции транскрипции Spi-B [29].
Обнаруженное в работе усиление транскрипционной активности генов Nf-kB1 и c-Rel в клетках ИЛФ подвздошной кишки крыс способно оказывать непосредственное влияние на диффе-ренцировку лимфоцитов. Так, в Т-лимфоцитах гены, кодирующие IL-2 и FoxP3, непосредственно связаны с с-Rel, а с-Rel-зависимая транскрипция IL-12 и IL-23 макрофагами и дендритными клетками критична для дифференцировки субпопуляций Т-клеток и осуществления их эффекторных функций. В последнее время появляются данные о том, что с-Rel играет одну из критичных ролей в развитии воспалительных заболеваний, таких как колит и экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ). Так, у с-Rel-дефицитных мышей, параллельно со снижением вероятности развития ЕАЕ, отмечены нарушения в пролиферации и дифферен-цировке Th1 и Th17 [31]. В то же время активация с-Rel в DC приводит к экспресии IL-12 и IL-23, что положительно влияет на продукцию IL-17 активированными CD4+Т-клетками со сдвигом реакции в провоспалительную сторону [18]. Кроме того, выключение c-Rel приводит к резистентности к стрептозотоцин-индуцированному диабету. С другой стороны, c-Rel имеет решающее значение для развития FoxP3-позитивных Treg-клеток, которые подавляют активность аутореактивных Т-клеток [24].
Полученные нами данные подтверждают важную роль и TNFa и его рецепторов в прогрессии СД 1 типа. Koulmanda M. и соавт. показали [16], что введение NOD-мышам ингибиторов продукции TNFa в неонатальный период приводит к предупреждению старта СД 1 типа, однако системное применение нетоксичных доз TNFa самкам NOD-мышей до 24 дня жизни приводит к увеличению числа случаев СД 1 типа. Вместе с тем введение TNFa в более позднем возрасте способно привести к задержке старта и снижению заболеваемости СД 1 типа. Все это свидетельствует о том, что TNFa, наряду с другими факторами, способен осуществлять как положительную, так и отрицательную регулировку толерантности периферических Т-лимфоцитов к аутоантиге-
нам, в том числе к антигенам ß-клеток островков. Кроме описанного выше эффекта, anti-TNFa-терапия имеет дополнительный терапевтический эффект — восстановление чувствительности к инсулину. Liu C. и соавт. показали, что у пациентов с ревматоидным артритом на фоне назначения МКАТ к TNFa наблюдается снижение уровня Th1, Th17 IFNy-продуцирующих CDS+T-клеток, а уровень Treg-клеток возрастает, что может говорить о снижении количества провоспалительных ТЫ7-клеток на фоне усиления продукции IFNy и увеличения количества Treg. Однако, несмотря на многочисленные положительные эффекты, использование МКАТ к TNFa может стать индуктором развития инфекционной патологии (туберкулез, пневмония и сепсис), реактивации латентной инфекции, а также нарушения нормального морфогенеза КАЛТ. Именно поэтому все более интересными становятся менее агрессивные блокаторы TNFa, например пентокси-филлин (PTX). PTX — это ингибитор фосфоди-эстераз (ИФДЭ), который увеличивает уровень цАМФ, угнетает активацию NF-kB и транскрипцию гена TNFa [17]. Данные, полученные в ходе нашего эксперимента, совпадают с результатами других авторов, что IFNy/TNFa/NO-индуцированный апоптоз ß-клеток значительно ослаблен на фоне введения PTX. Visser J. и соавт. показали, что эффект от введения PTX в значительной мере зависит от сроков использования препарата. Так, если DP-BB (Diabetes-prone Bio Breeding) крысам вводили PTX в течение 2 месяцев, то развития патологии практически не происходило, а у DR-BB (Diabetes-resistant) наблюда-
лась лишь задержка старта развития СД. В обеих линиях ВВ-крыс введение PTX результировалось в ингибировании продукции TNFa [28].
Выводы
1. Развитие диабета сопровождалось снижением количества TLR2+ и TLR4+ лимфоцитов в СПСОВ и ИЛФ подвздошной кишки крыс, при этом плотность TLR2 на мембране иммунопози-тивных клеток увеличивалась у малых, а TLR4 — у средних и малых лимфоцитов.
2. Введение ПФ диабетическим крысам приводило к снижению числа TLR2+ клеток на 2-й неделе и увеличению данного показателя на 4-й неделе развития патологии, суммарная плотностьTLR4+ клеток демонстрировала динамику к росту только в СПСОВ. Изменения плотности TLR2 иTLR4 на поверхности лимфоцитов носили разнонаправленный характер.
3. Диабет вызывал транскрипционную индукцию генов Nf-kB1 и c-Rel в клетках КАЛТ, тогда как введение ПФ снижало уровень экспрессти мРНК Nf-kB1 и увеличивало мРНК c-Rel.
4. Отмечен рост нормализованной экспрессии маркеров М-клеток Gp2 и Spi-B в ходе развития экспериментальной патологии. Введение ПФ приводило к разнонаправленным эффектам на интенсивность экспрессии мРНК Gp2 в зависимости от срока развития диабета и не влияло на уровень мРНК Spi-B.
5. Развитие ЭСД приводило к транскрипционной активации генов TNFa и TNFr и демонстрировало динамику к снижению этого показателя на фоне введения ПФ диабетическим животным.
Список литературы / References
1. Деген А.С., Камышный А.М. Экспрессия цитоплазматических NOD-2 и RIG-I рецепторов врожденного иммунитета в кишечнике крыс при экспериментальном сахарном диабете // Российский иммунологический журнал, 2014. № 3. С. 525-528. [Degen A.S., Kamyshnyi A.M. Expression of cytoplasmic nod-2 and rig-i receptors of innate immunity in intestine of rats in experimental diabetes mellitus. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Immunology, 2014, no. 3, pp. 525-528. (In Russ.)]
2. Alyanakian M.A., Grela F., Aumeunier A., Chiavaroli C., Gouarin C., Bardel E., Normier G., Chatenoud L., Thieblemont N., Bach J.F. Transforming growth factor-beta and natural killer T-cells are involved in the protective effect of a bacterial extract on type 1 diabetes. Diabetes, 2006, Vol. 55, no. 1, pp. 179-185.
3. Biswas A., Banerjee P., Biswas T. Porin of Shigella dysenteriae directly promotes toll-like receptor 2-mediated CD4+ T cell survival and effector function. Mol. Immunol., 2009, Vol. 46, no. 15, pp. 3076-3085.
4. d'Addio F., Fiorina P. Type 1 diabetes and dysfunctional intestinal homeostasis. Trends Endocrinol. Metab., 2016, Vol. 27, no. 7, pp. 493-503.
5. Degen A., Kamyshny A. Distribution characteristics of RIG-I receptors of innate immunity in experimental diabetes mellitus and administration of nonspecific blockers of TNF-a. J. Immunol. Clin. Microbiol., 2018, Vol. 3, no. 3, pp. 50-59.
6. Devaraj S., Dasu M.R., Rockwood J., Winter W., Griffen S.C., Jialal I. Increased toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 expression in monocytes from patients with type 1 diabetes: further evidence of a proinflammatory state. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2008, no. 93, pp. 578-583.
7. Dong C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat. Rev. Immunol., 2008, no. 8, pp. 337-348.
8. Faustman D.L. TNF, TNF inducers, and TNFR2 agonists: A new path to type 1 diabetes treatment. Diabetes Metab. Res. Rev., 2018, Vol. 34, no. 1.
9. Flaherty S., Reynolds J.M. TLR function in murine CD4(+) T lymphocytes and their role in inflammation. Methods Mol Biol., 2016, no. 1390, pp. 215-227.
10. Fulford T.S., Ellis D., Gerondakis S. Understanding the roles of the NF-kB pathway in regulatory T cell development, differentiation and function. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 2015, no. 136, pp. 57-67.
11. Hase K., Kawano K., Nochi T., Pontes G.S., Fukuda S., Ebisawa M., Kadokura K., Tobe T., Fujimura Y., Kawano S., Yabashi A., Waguri S., Nakato G., Kimura S., Murakami T., Iimura M., Hamura K., Fukuoka S., Lowe A.W., Itoh K., Kiyono H., Ohno H. Uptake through glycoprotein 2 of FimH1 bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature, 2009, Vol. 462, no. 7270, pp. 226-230.
12. Imanishi T., Hara H., Suzuki S., Suzuki N., Akira S., Saito T. Cutting edge: TLR2 directly triggers Th1 effector functions. J. Immunol., 2007, no. 178, pp. 6715-6719.
13. Jialal I., Yun J.M., Bremer A., Devaraj S. Demonstration of increased TLR2 and TLR4 Expression in monocytes of type 1 diabetic patients with microvascular complications. Metabolism, 2011, Vol. 60, no. 2, pp. 256-259.
14. Kanaya T., Hase K., Takahashi D., Fukuda S., Hoshino K., Sasaki I., Hemmi H., Knoop K.A., Kumar N., Sato M., Katsuno T., Yokosuka O., Toyooka K., Nakai K., Sakamoto A., Kitahara Y., Jinnohara T., McSorley S.J., Kaisho T., Williams I.R., Ohno H. The Ets transcription factor Spi-B is essential for the differentiation of intestinal microfold cells. Nat. Immunol., 2012, Vol. 13, no. 8, pp. 729-736.
15. Knoop K.A., Kumar N., Butler B.R., Sakthivel S.K., Taylor R.T., Nochi T., Akiba H., Yagita H., Kiyono H., Williams I.R. RANKL is necessary and sufficient to initiate development of antigen-sampling M cells in the intestinal epithelium. J. Immunol., 2009, Vol. 183, no. 9, pp. 5738-5747.
16. Koulmanda M., Bhasin M., Awdeh Z., Qipo A., Fan Z., Hanidziar D., Putheti P., Shi H., Csizuadia E., Libermann T.A., Strom T.B. The role of TNF-a in mice with type 1- and 2- diabetes. PLoS ONE, 2012, Vol. 7, no. 5, pp. 332-354.
17. Liang L., Beshay E., Prud'homme G.J. The phosphodiesterase inhibitors pentoxifylline and rolipram prevent diabetes in NOD mice. Diabetes, 1998, Vol. 47, no. 4, pp. 570-575.
18. Maloy K.J., Powrie F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature, 2011, no. 474, pp. 298-306.
19. Nakamura Y., Kimura S., Hase K. M cell-dependent antigen uptake on follicle-associated epithelium for mucosal immune surveillance. Inflamm. Regen., 2018, no. 38, pp. 1-5.
20. Needell J.C., Zipris D. The Role of the intestinal microbiome in type 1 diabetes pathogenesis. Curr. Diab. Rep., 2016, Vol. 16, no. 10, pp. 8-9.
21. Ohno H. Intestinal M cells. J. Biochem., 2016, Vol. 159, no. 2, pp. 151-160.
22. Opazo M.C., Ortega-Rocha E.M., Coronado-Arrazola I., Bonifaz L.C., Boudin H., Neunlist M., Bueno S.M., Kalergis A.M., Riedel C.A.. Intestinal microbiota influences non-intestinal related autoimmune diseases. Front. Microbiol., 2018, Vol. 9, 432. doi: 10.3389/fmicb.2018.00432.
23. Qiao Y.C., Chen Y.L., Pan Y.H., Tian F., Xu Y., Zhang X.X., Zhao H.L. The change of serum tumor necrosis factor alpha in patients with type 1 diabetes mellitus: A systematic review and meta-analysis. PLoS ONE, 2017, Vol. 12, no. 4, e0176157. doi: 10.1371/journal.pone.0176157.
24. Ramakrishnan P., Yui M.A., Tomalka J.A., Majumdar D., Parameswaran R., Baltimore D. Deficiency of nuclear factor-KB c-Rel accelerates the development of autoimmune diabetes in NOD mice. Diabetes, 2016, Vol. 65, no. 8, pp. 2367-2379.
25. Sato S., Kaneto S., Shibata N., Takahashi Y., Okura H., Yuki Y., Kunisawa J., Kiyono H. Transcription factor Spi-B-dependent and -independent pathways for the development of Peyer's patch M cells. Mucosal Immunol., 2013, Vol. 6, no. 4, pp. 838-846.
26. Taylor R.T., Patel S.R., Lin E., Butler B.R., Lake J.G., Newberry R.D., Williams I.R. Lymphotoxin-independent expression of TNF-related activation-induced cytokine by stromal cells in cryptopatches, isolated lymphoid follicles, and Peyer's patches. J. Immunol., 2007, Vol. 178, no. 9, pp. 5659-5667.
27. Vaarala O. Human intestinal microbiota and type 1 diabetes. Curr. Diab. Rep., 2013, Vol. 13, no. 5, pp. 601-607.
28. Visser J., Groen H., Klatter F., Rozing J. Timing of pentoxifylline treatment determines its protective effect on diabetes development in the Bio Breeding rat. Eur. J. Pharmacol., 2002, Vol. 445, no. 1-2, pp. 133-140.
29. Wood M.B., Rios D., Williams I.R.TNF-a augments RANKL-dependent intestinal M cell differentiation in enteroid cultures. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2016, Vol. 311, no. 3, pp. 498-507.
30. Zanin-Zhorov A., Tal-Lapidot G., Cahalon L., Cohen-Sfady M., Pevsner-Fischer M., Lider O., Cohen I.R. Cutting edge: T cells respond to lipopolysaccharide innately via TLR4 signaling. J. Immunol., 2007, Vol. 179, no. 1, pp. 41-44.
31. Zhang H., Bi J., Yi H., Fan T., Ruan Q., Cai L., Chen Y.H., Wan X. Silencing c-Rel in macrophages dampens Th1 and Th17 immune responses and alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Immunol. Cell Biol., 2017, Vol. 95, no. 7, pp. 593-600.
Авторы:
Деген А.С. — ассистент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
Коваль Г.Д. — д.м.н., профессор кафедры клинической иммунологии, аллергологии и эндокринологии, Буковинский государственный медицинский университет, г.Черновцы, Украина
Сухомлинова И.Е. — к.м.н., доцент кафедры нормальной физиологии, Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
Морозова О.В. — к.м.н., доцент кафедры нормальной физиологии, Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
Камышный А.М. — д.м.н., профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
Поступила 22.11.2018 Принята к печати 25.12.2018
Authors:
Degen A.S., Assistant Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine
Koval G.D., PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Clinical Immunology, Allergology and Endocrinology, Bukovinian State Medical University, Chernivtsi, Ukraine
Sukhomlinova I.E., PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Normal Physiology, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine
Morozova O.V., PhD (Medicine), Associate Professor, Department of Normal Physiology, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine
Kamyshnyi A.M., PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Department of Microbiology, Virology and Immunology, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine
Received 22.11.2018 Accepted 25.12.2018
