CC BY
46
Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология ОЮЫгННаЛЬНЬ1@ C^fttt^ftbU Meditsinskaya Immunologiya 2016, Т. 18, № 4, стр. 339-346 * ^ . . . . . 2016, Vol. 18, No 4, pp. 339-346
© 2016, СПбРО РААКИ Original articles © 2016, SPb RAACI
ИЗМЕНЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Glutl, mTOR И AMPKIa ЛИМФОЦИТАМИ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ
Путилин Д.А., Камышный А.М.
Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
Резюме. С помощью молекулярно-генетических методов исследовали уровень экпрессии мРНК генов Glut1, mTOR и AMPK1a в ПЛУ крыс с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом (ЭСИСД) и после введений метформина. Для определения уровня мРНК исследуемых генов проводили ОТ-ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96™ Real-Time PCR Detection Systems ("Bio-Rad Laboratories, Inc.", США). Иммунопозитивные mTOR+ лимфоциты были идентифицированы с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции с использованием моно-клональных антител. Установлено, что гипергликемия вызывала транскрипционную индукцию генов транспортеров глюкозы Glut1 (в 9,9-28,9 раз, p < 0,05) и протеинкиназы mTOR (в 5,3-3,3 раза, p < 0,05) в клетках ПЛУ. Развитие диабета также сопровождалось увеличением общего числа mTOR+ клеток в ПЛУ на 5 неделе патологического процесса на 24-34% (р < 0,05) и концентрации мишени рапамицина в иммунопозитивных клетках. Введения метформина диабетическим крысам приводили к увеличению уровня мРНК гена AMPK1a на 87% (p < 0,05) на 3 неделе и в 38 раз (p < 0,05) на 5 неделе развития ЭСИСД и угнетению экспрессии mTOR в ПЛУ (в 3-14,7 раз, p < 0,05), сопровождаясь снижением на 40% (р < 0,05) суммарной плотности mTOR+ клеток в мякотных тяжах ПЛУ у животных с 5-ти недельным ЭСИСД.
Ключевые слова: стрептозотоцин-индуцированный сахарный диабет, панкреатические лимфатические узлы, Glut1, mTOR, AMPK1a, экспрессия генов
GANGES OF Glutl, mTOR AND AMPKIa GENE EXPRESSION IN PANCREATIC LYMPH NODE LYMPHOCYTES OF RATS WITH EXPERIMENTAL DIABETES MELLITUS
Putilin D.A., Kamyshnyi A.M.
Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine
Abstract. With the help of molecular genetic method we have investigated the level of mRNA gene expressions Glut1, mTOR and AMPK1a in PLN in pancreatic lymph nodes (PLN) of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus (SIDM) and after administration of metformin. The levels of Glut1, mTOR and AMPK1a mRNA were determined by means of RT-PCR using CFX96™ thermocycler (Real-Time PCR Detection
Адрес для переписки:
Камышный Александр Михайлович Запорожский государственный медицинский университет
69035, Украина, г. Запорожье, пр. Маяковского, 26. Тел.: +38(061) 234-26-31. E-mail: alexkamyshny@yandex.ru
Address for correspondence:
Kamyshnyi Aleksandr M.
Zaporozhye State Medical University
69035, Ukraine, Zaporozhye, Mayakovsky ave, 26.
Phone: +38 (061) 234-26-31.
E-mail: alexkamyshny@yandex.ru
Образец цитирования:
Д.А Путилин, А.М. Камышный «Изменения уровня экспрессии генов Gluti, mTOR ИAMPK1 лимфоцитами панкреатических лимфатических узлов крыс при экспериментальном сахарном диабете» // Медицинская иммунология, 2016. Т. 18, № 4. С. 339-346. doi: 10.15789/1563-0625-2016-4-339-346
© Путилин Д.А., Камышный А.М., 2016
For citation:
D.A. Putilin, A.M. Kamyshnyi "Changes of Glutl, mTOR and AMPK1 gene expression in pancreatic lymph node lymphocytes of rats with experimental diabetes mellitus", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2016, Vol. 18, no. 4, pp. 339-346. doi: 10.15789/1563-0625-2016-4-339-346
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2016-4-339-346
Systems, Bio-Rad, USA). Relative gene expression levels were calculated as ratios to GAPDH reference gene using Ct method. Statistical analysis was performed with available "Bio-Rad CFX Manager 3.1" software (Bio-Rad, USA). The mTOR+ positive lymphocytes were identified by means of monoclonal antibodies, using an indirect immunofluorescence method. Hyperglycemia was accompanied by transcriptional induction of glucose transporter Gluti gene (9.9 to 28.9-fold, p < 0.05), and mTOR protein kinase gene (5.3 to 3.3-fold, p < 0.05) in PLN. Development of diabetes was also associated with increase by 24-34% in total mTOR+ cell numbers in PLN at the 5th week of developing diabetes (p < 0.05) and increased concentrations of rapamycin target in the immunopositive cells. Metformin administration to diabetic rats was followed by increased AMPKla mRNA level of by 87% (p < 0,05) at the 3rd week, and 38-fold (p < 0,05), at the 5th week of SIDM development and inhibition of mTOR expression in PLN (3 to 14.7-fold, p < 0.05) accompanied by a 40 per cent decrease (p < 0.05) in total density of mTOR+ cells in PLN lymph cords of the rats following 5 weeks of SIDM. Keywords: streptozotocin-induced diabetes mellitus, lymph nodes, pancreatic, Gluti, mTOR, AMPKla, gene expression
Введение
В последние годы стало понятно, что важную роль в механизмах развития сахарного диабета (СД) играют изменения функционального состояния панкреатических лимфатических узлов (ПЛУ), дренирующих панкреатические островки и экзокринную часть поджелудочной железы, а также отдельные сегменты кишечника [3]. Именно в ПЛУ происходит начальная активация диабетогенных CD8+ и CD4+Т-клеток к их миграции в панкреатические островки, а хирургическое удаление ПЛУ у NOD мышей препятствует развитию диабета из-за отсутствия праймирова-ния Т-клеток панкреатическими антигенами [9].
С другой стороны, метаболические изменения, которые развиваются в условиях СД, прежде всего гипергликемия, способны непосредственно влиять на иммунометаболизм лимфоцитов [2]. Т-клетки экспрессируют ряд транспортеров глюкозы, основным из которых является Glutl [19, 16]. Продиабетогенные Th1- и ТЫ7-клетки, вызывающие инсулит, характеризуются высоким уровнем экспрессии Glut1 и склонностью к гликолизу [17]. У супресорных Treg, наоборот, низкий уровень экспрессии Glut1 и высокая скорость окислительного метаболизма [1]. В свою очередь, важным регулятором иммуно-метаболизма лимфоцитов является протеинки-наза mTOR (англ. mammalian target of rapamycin), которая существует как субъединица внутриклеточных мультимолекулярных сигнальных комплексов mTORCl и mTORC2 [21]. В составе этих комплексов mTOR является «проводником» как внутриклеточных, так и внеклеточных сигналов и служит одним из центральных регуляторов метаболизма, роста, пролиферации и выживания лимфоцитов и других клеток [22], а одним из ее блокаторов является метформин, который действует через AMPK (AMP-activated protein kinase) [7, 13]. Высокая активность mTOR способна усиливать прогрессию диабета через активацию эф-фекторных провоспалительных субпопуляций лимфоцитов [26, 15], и наоборот, низкая способствует дифференцировке Treg [4, 34], блоки-
рующих инсулит. Поэтому целью работы было выяснить уровень экспрессии мРНК генов Gluti, mTOR и AMPKla, а также распределение mTOR+ лимфоцитов в ПЛУ крыс с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом (ЭСИСД) и после введений метформина.
Материалы и методы
Исследования проведены на 100 самцах крыс линии Вистар весом 115-135 грамм, полученных из питомника Объединение ветеринарной медицины ЧП «Бюмодельсервю» (Киев). Животные были разделены на 5 экспериментальных групп по 20 крыс: контрольные крысы, которым однократно внутрибрюшинно вводили 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рН = 4,5) (группа 1); крысы с 3-недельным экспериментальным стрепто-зотоцин-индуцированным сахарным диабетом (ЭСИСД) (группа 2); крысы с 5-недельным экспериментальным стрептозотоцин-индуцирован-ным сахарным диабетом (ЭСИСД) (группа 3); крысы с 3-недельным ЭСИСД (группа 4) и 5-не-дельным ЭСИСД (группа 5), которым внутриже-лудочно (в/ж) ежедневно на протяжении 3 и 5 недель вводили метформин в дозе 50 мг/кг начиная с 1 дня индукции диабета.
Для индукции ЭСИСД стрептозотоцин (STZ) (SIGMA Chemical, США) вводили крысам вну-трибрюшинно в дозе 50 мг/кг, растворенного в 0,5 мл 0,1 М цитратного буфера (рН = 4,5) перед самим моментом введения. Время, прошедшее с дня введения препарата, в дальнейшем изложении материала интерпретировалось как длительность течения диабета. Определение концентрации глюкозы в крови, которую брали из хвостовой вены, проводили глюкозо-оксидазным методом с применением прибора "BIONIMERigh test™GM 110" (Швейцария) через 12 часов и на 1, 3, 21 и 35 сутки после инъекции стрептозотоцина. Измерение уровня гликемии осуществляли через 6 часов с момента последнего приема пищи. На 21 и 35 сутки после введения STZ животных выводили из эксперимента декапитированием под тиопенталовым
наркозом. Изымали ПЛУ, которые на 20 часов помещали в фиксатор Буэна и после промывки заливали в парапласт.
Структуру популяции mTOR+-лимфоцитов изучали на основании анализа серийных гистологических срезов ПЛУ и данных их морфоме-трических и денситометрических характеристик. Для проведения данного исследования на ротационном микротоме MICROM HR-360 (Microm, Германия) делали 5-микронные серийные срезы ПЛУ, которые потом депарафинизировали в ксилоле, проводили регидратацию в нисходящих концентрациях этанола (100%, 96%, 70%), отмывали в 0,1 М фосфатном буфере (pH = 7,4) и красили с первичными кроличьими поликло-нальными антителами (ПКАТ) к mTOR (Santa Cruz Biotechnology, США, sc-1550-R) в течение 18 часов во влажной камере при Т = 4 °С. После отмывания излишка первичных антител в 0,1 М фосфатном буфере, срезы инкубировали 60 минут (Т = 37 °С) с вторичными антителами к полной молекуле IgG кролика (Santa Cruz Biotechnology, США), конъюгированными с FITC. После инкубации все срезы промывали 0,1 М фосфатным буфером и помещали в смесь глицерина и фосфатного буфера (1:9) для дальнейшей люминесцентной микроскопии. Обработанные гистологические срезы изучали с помощью компьютерной программы Image J (NIH, США). Изображения, полученные на микроскопе Primo Star (ZEISS, Германия) в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390 нм (FITC) при помощи высокочувствительной камеры Axio Cam 5c (ZEISS, Германия) и пакета программ для получения, архивирования и подготовки изображения к публикации Axio Vision 4.7.2 (ZEISS, Германия) немедленно вводили в компьютер. При этом в автоматическом режиме определялись области со статистически значимой флюоресценцией, характерной для лимфоцитов, экспрессирую-щих mTOR. Вычислялись морфометрические и денситометрические характеристики иммуно-положительных клеток. Определяли абсолютную (количество клеток на 1 мм2 площади среза) и относительную (%) плотность распределения иммуноположительных клеток различных классов в исследованных зонах ПЛУ. Концентрацию транскрипционного фактора mTOR определяли, учитывая интенсивность флюоресценции идентифицированных иммуноположительных клеток и неспецифическую флюоресценцию препарата (так называемый фон). На основании этих показателей вычислялась корректированная клеточная флюоресценция (в условных единицах интенсивности флюоресценции УЕИФ): Integrated Density (интегрированная плотность) — (площадь
выделенных клеток * среднюю флюоресценцию фона).
Объектом для молекулярно-генетических исследований методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР) у экспериментальных животных были ПЛУ, которые помещали в фиксатор Буэна, проводили дегидратацию в восходящих концентрациях этанола и укладывали в парафиновые блоки. Молекулярно-генетические исследования проведены на архивном материале возрастом 2 года. РНК получали из гистологических срезов толщиной 15 мкм, для этого проводили их депарафинизацию в ксилоле и регидратацию в нисходящих концентрациях этанола (100%, 96%, 70%). Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора "Trizol RNA Prep 100" (Изоген Lab., LTD, Россия), который содержит Trizol reagent (лизирующий реагент, в состав которого входит денатурирующий агент гуани-динтиоционат и фенол с рН = 4,0) и ExtraGene Е (суспензия смеси ионообменников). РНК выделяли согласно протоколу к набору.
Для проведения обратной транскрипции и получения кДНК использовали набор ОТ-1 фирмы «Синтол» (Россия). Реакционная смесь общим объемом 25 мкл содержала 1 мкл Random-6 прай-мера, 2 мкл тотальной РНК, 8,5 мкл деионизиро-ванной Н2О, очищенной от нуклеаз, 12,5 мкл 2,5х реакционной смеси и 1 мкл ревертазы MMLV-RT. Обратную транскрипцию проводили при 45 °С в течение 45 минут с последующим нагреванием для инактивации MMLV-RT в течение 5 минут при 92 °С.
Для определения уровня экспрессии исследованных генов GLUTI (NM_138827.1), mTOR (NM_019906.1) и AMPKla (Prkaal) (NM_019142.2) использовали амплификатор CFX96™Real-Time PCR Detection Systems ("Bio-Rad Laboratories, Inc.", США) и набор реактивов Maxima SYBR Green/ROX qPCR MasterMix (2X) (ThermoScientific, США). Финальная реакционная смесь для амплификации включала краситель SYBR Green, ДНК — по-лимеразу Maxima HotStartTaq DNA Polymerase, по 0,2 мкл прямого и обратного специфических праймеров, 1 мкл матрицы (кДНК). Реакционную смесь доводили до общего объема 25 мкл добавлением деионизированной Н2О. Специфические пары праймеров (5'-3') для анализа исследованных и референсного генов были подобраны с помощью программного обеспечения PrimerBlast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) и изготовлены фирмой Metabion (Германия) (см. табл. 1).
После начальной денатурации в течение 10 минут при 95 °C амплификация состояла из 45 циклов и проводилась при таких условиях: денатура-
ТАБЛИЦА 1. ПРАИМЕРЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ мРНК ИССЛЕДОВАННЫХ И РЕФЕРЕНСНОГО ГЕНОВ
Ген Праймер Тпл,°C Длина продукта (пн) Экзонный стык
mTor F = TCTGGCCAAAAGACAGGTGG R = CTGTCCCAGGGTCCACAAAG 60 60 40 2577/ 2578
Slc2a1 (Gluti) F = CGTCGTTGGGATCCTTATTGC R = AGTCTAAGCCGAACACCTGG 5 5 CD CD 41 724/ 725
Prkaal (AMPK) F = GGGAAAGTGAAGGTGGGCAA R = TATGTCCAGTCAACTCGTGCT 5 6 CD О 40 127/ 128
GAPDH F = GCCTGGAGAAACCTGCCAAG R = GCCTGCTTCACCACCTTCT 61 60 52 825/ 826
ция - 95 °С, 15 сек., отжиг - 59-61 °С, 30-60 сек., элонгация — 72 °С, 30 сек. В качестве референс-гена для определения относительного значения изменения уровня экспрессии исследованных генов был использован ген глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH). Относительное нормализованное количество кДНК таргетных генов определяли по методу Ct. Статистический анализ данных ПЦР проводили при помощи программного обеспечения CFX Manager ™(Bio-Rad, США). В эксперимент были включены негативные контроли: без добавления кДНК матрицы в реакцию ПЦР, без добавления мРНК матрицы в синтезе кДНК, без добавления фермента в синтезе кДНК. Все реакции амплификаци проводили на индивидуальных образцах в трех повторах.
Результаты
Введение экспериментальным животным стрептозотоцина приводило к развитию патологического процесса: так, на 3 неделю ЭСИСД концентрация глюкозы в крови у крыс линии Ви-стар увеличивалась в 3,6 раза (12,23±0,4 ммоль/л, р < 0,05) по сравнению с контролем (3,37±0,08 ммоль/л), а на 5 неделю возрастала до 14,39±0,7 ммоль/л. Наблюдались полидипсия, гиперфагия и полиурия, то есть все основные симптомы, характерные для СД 1 типа.
Гипергликемия вызывала транскрипционную индукцию гена транспортеров глюкозы Gluti в клетках ПЛУ. В частности, развитие диабета приводило к возрастанию уровня мРНК Gluti в 9,9 раз (p < 0,05) на 3 неделе и в 28,9 раз (p < 0,05) на 5 неделе патологического процесса (рис. 1А, Б). Эти изменения сопровождались увеличением уровня мРНК протеинкиназы mTOR в 5,3 раза (p < 0,05) при 3-недельном и в 3,3 раза (p < 0,05) при 5-недельном ЭСИСД (рис. 2В, Г) по сравнению с контрольной группой крыс.
Введение метформина диабетическим крысам приводило к возрастанию уровня транскрипционной активности АМФ-активируемой протеинкиназы AMPKla в ПЛУ. Так, относительное нормализованное количество мРНК гена AMPKia увеличивалось на 87% (p < 0,05) на 3 неделе и почти в 38 раз (p < 0,05) на 5 неделе развития ЭСИСД (рис. 2А, Б). Наблюдаемая индукция AMPKla закономерно угнетала экспрессию mTOR: мы наблюдали уменьшение уровня мРНК мишени рапамицина в ПЛУ в 14,7 раз (p < 0,05) при 3-недельном и в 3 раза (p < 0,05) при 5-не-дельном ЭСИСД (рис. 2В, Г) по сравнению с контрольной группой крыс.
Структуру популяции mTOR+ лимфоцитов изучали на основании анализа серийных гистологических срезов ПЛУ и данных их морфоме-трических и денситометрических характеристик.
А
О ж ^ о.
го " 1 го с
Gluti мРНК экспрессия
□ К
*
i
| _ |
Gluti Мишень
□ Д 3 нед
I Д 5 нед
го с со о
0
СО
Ü i 4
1 i. 3
* R
СП о
I ¡s 2
с
е
¡E 1
о
о
Á 0
mTor мРНК экспрессия
i
□ К
mTor Мишень
□ Д 3 нед
I Д 5 нед
Рисунок 1. Относительное нормализованное количество мРНК генов Glut1 (А) и тТ01^ (Б) в клетках ПЛУ
Нормализация по методу ДДС с референс-геном GAPDH. к-контроль; д 3 нед., д 5 нед. - 3-х и 5-ти недельный ЭСИСД соответственно.
Б
*
А
АМРК1а мРНК экспрессия
Б
АМРК1а мРНК экспрессия
2,0
го m о
СО
Ü 1,5
го 5
Р ° ^1,0 í§ у
О
0,5
о
X I—
О
т
40
го m о
30
я п
го У
со
10
я го
нн го 1 0-
о
с 0 8-
м р о ¡0,6-
н р
я го н ь m 0,4-
и 0,2
о н 0
1— о
АМРК1а Мишень □ Д 3 □ Д 3+мед
mTor мРНК экспрессия
о
н
i—
О
mTor Мишень □ Д 3 ЦЦД 3+мед
я го
нн го 1 0-
о
s с 08-
м р о ия 8 0,6-
н р
я го н ь m 0,4-
и 0,2
о н 0
1— О
АМРК1а Мишень □ Д 5 □ Д 5+мед
mTor мРНК экспрессия
1
mTor Мишень □ Д 3 □ Д 3+мед
Рисунок 2. Относительное нормализованное количество мРНК генов AMPK1a (А, Б) и тТОЯ (В, Г) в клетках ПЛУ после введений метформина диабетическим крысам
Примечание. Нормализация по методу ДДС с референс-геном GAPDH. д 3 нед., д 5 нед. - 3-х и 5-ти недельный ЭСИСД соответственно; д3+метф, д5+метф - введения метформина диабетическим крысам.
Нами установлено, что развитие диабета не влияло на суммарную плотность mTOR+ клеток в ПЛУ на 3 неделю патологического процесса и приводило к их увеличению у крыс с 5-недельным ЭСИСД — на 24% (р < 0,05) в паракортикальной зоне и на 34% (р < 0,05) в мякотных тяжах. Изучение распределения отдельных классов mTOR+ клеток показало, что данное увеличение общего количества иммунопозитивных к протеинкиназе mTOR лимфоцитов было вызвано главным образом ростом плотности популяции (ПП) mTOR+ малых лимфоцитов — на 23% (р < 0,05) в паракортикальной зоне и на 46% (р < 0,05) в мякотных тяжах и mTOR+ средних лимфоцитов (соответственно, на 22% и 50%, р < 0,05).
Введение метформина не влияло на общую численность mTOR+ клеток у крыс с 3-недель-ным ЭСИСД и приводили к снижению их количества на 40% (р < 0,05) в мякотных тяжах ПЛУ у животных с 5-недельным ЭСИСД. При этом в структуре популяции достоверно изменялась только ПП mTOR+ средних лимфоцитов.
Измерение интенсивности флюоресценции иммунопозитивных клеток показало увеличение
концентрации протеинкиназы mTOR у mTOR+ лимфобластов и mTOR+ малых лимфоцитов на 3-ю неделю и mTOR+ средних лимфоцитов паракортикальной зоны ПЛУ на 5-ю неделю развития диабета. Введение метформина снижало концентрацию мишени рапамицина в mTOR+ лимфобластах у животных с 3-недельным ЭСИСД в паракортикальной зоне ПЛУ на 17% (р < 0,05) и в мякотных тяжах на 28% (р < 0,05). При увеличении длительности ЭСИСД до 5-ти недель отмечалось также достоверное снижение концентрации mTOR у mTOR+ средних и mTOR+ малых лимфоцитов.
Обсуждение
Лимфоциты чутко реагируют на изменения метаболизма. В качестве таких основных лимфо-цитарных сенсоров иммунометаболизма можно выделить: киназу mTOR, воспринимающую сигналы от аминокислот, ростовых факторов и др., и являющуюся одним из центральных регуляторов пролиферации и выживания лимфоцитов; ключевой сенсор глюкозы и регулятор энергетического баланса клеток АМФ-активируемая
0
0
В
Г
*
протеинкиназа (АМРК); рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами PPAR, эндогенными лигандами которых являются свободные жирные кислоты и эйкозаноиды; образ-распознающие рецепторы врожденного иммунитета (TLR, NLR, RLR и др.), активирующиеся не только микробными лигандами, но и целым рядом эндогенных паттернов повреждения, таких как HSP70, HMGB1; сенсоры внеклеточной АТФ с P2XR; сенсоры ксенобиотиков арил-гидрокар-боновые рецепторы (AHR); рецепторы коротко-цепочечных жирных кислот FFAR2, лигандами для которых являются такие микробные метаболиты, как бутират, ацетат и пропионат (рис. 3).
Иммунные нарушения приводят к развитию СД 1 типа, а гипергликемия, развивающаяся при этом, усиливает аутоиммунную атаку, приводя к формированию «порочного» круга. Так, CD4+T-клетки экспрессируют целый ряд транспортеров глюкозы (Glut), в частности Gluti, 3, 6, и 8 [16]. Gluti функционирует главным образом на активированных, но не на пребывающих в покое CD4+T-клетках, а изменение его экспрессии, наверное, может влиять на уровень дифферен-цировки CD4+Th1- и ТЫ7-клеток. Было показано in vitro, что разные субпопуляции CD4+T-эффекторных и Т-регуляторных клеток отдают предпочтение гликолитическим или окислительным метаболическим программам, которые отличаются, контролируя уровень поглощения ими глюкозы. Несмотря на экспрессию различных транспортеров глюкозы, дефицит Glut1 избирательно нарушает метаболизм и функции тимоци-тов и Т-эффекторных клеток, предотвращая их
пролиферацию и уменьшая выживание и диф-ференцировку [16]. Важно также то, что дефицит Gluti уменьшает экспансию эффекторных лимфоцитов и их способность вызывать воспалительные заболевания in vivo. Клетки Treg, наоборот, оказались нечувствительными к уровню экспрессии Glut1 и их способность к супрессии при этом не страдала. Таким образом, метаболические отличия субпопуляций лимфоцитов состоят в том, что Thi, Th2 и клетки Th17 характеризуются высоким уровнем экспрессии транспортера глюкозы Gluti, и чрезвычайно высокой способностью к гликолизу. У Treg, наоборот, низкий уровень экспрессии Gluti и высокая скорость окислительного метаболизма. Таким образом, влияя на метаболические программы лимфоцитов, можно манипулировать численностью их отдельных субпопуляций. Так, авторы показали, что стимуляции AMP-активированной про-теинкиназы было достаточно, чтоб уменьшить экспрессию Gluti и увеличить генерацию Treg в модели астмы [i0].
Другим важным регулятором метаболизма лимфоцитов является mTOR — протеинкина-за серин-треониновой специфичности, которая в клетке существует как субъединица внутриклеточных сигнальных комплексов mTORCi и mTORC2. mTOR-сигнализация является одной из основных детерминант Т-клеточной диффе-ренцировки [30, 3i]. При высокой активности mTOR происходит дифференцировка наивных CD4+ клеток в эффекторные провоспалительные субпопуляции Thi, Th2, Thi7, а также активация цитотоксических CD8+ клеток [28] (рис. 3).
Рисунок 3. Лимфоцит как сенсор изменений метаболизма
Примечание. Условные обозначения: mTOR - мишень рапамицина, AMPK - АМФ-активируемая протеинкиназа, PPARy - рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами, Gluti - транспортеры глюкозы 1 типа, P2XR - пуринергические рецепторы, FFAR2 - рецепторы короткоцепочечных жирных кислот, AHR - арил-гидрокарбоновые рецепторы, PRR - образ-распознающие рецепторы врожденного иммунитета, PAMP - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, DAMP - молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением.
И наоборот, если активность mTOR в CD4+ клетках низкая, то они дифференцируются в Treg-клетки, которые блокируют развитие инсулита и прогрессию диабета [5, 23].
Таким образом, установленное нами увеличение уровня мРНК генов транспортеров глюкозы Glutl и протеинкиназы mTOR в клетках ПЛУ при диабете является важным триггером их диффе-ренцировки в эффекторные провоспалительные субпопуляции Th1 и Th17.
В свою очередь, важным стратегическим заданием есть поиск эффективных путей коррекции иммунных нарушений, развивающихся при СД и поддерживающих его прогрессию. Одной из перспективных терапевтических мишеней при СД есть ингибиторы mTOR. В связи с этим мы остановили свой выбор на метформине, который способен снижать концентрацию глюкозы в крови через АМФ-активируемую протеинкина-зу (АМФК) [25]. Метформин, как и рапамицин, но более мягко, без развития иммуносупрессии, угнетает активность mTOR [12]. Интересно, что сигнализация через mTOR вызывает метаболическое перепрограммирование лимфоцитов, стимулируя гликолиз c-MYC — зависимым путем, что повышает пролиферацию иммунных клеток [29]. Метформин способен и непосредственно, без участия mTOR, как АМФК-зависимым, так и АМФК-независимым путем [33] влиять на метаболизм лимфоцитов. Так, у Т-лимфоцитов AMPK-зависимая сигнализация важна для образования Т-клеток памяти в динамике иммунного ответа [24]. Способность метформина через активизацию AMPK угнетать выработку эффек-торных Т-лимфоцитов и стимулировать диффе-ренцировку Т-клеток памяти была подтверждена целым рядом исследований [14, 20]. Провоспа-
лительные действия метформина объясняют его способность угнетать развитие аутоиммунных заболеваний [18]. Кроме того, метформин ин-гибирует пролиферацию и выживание опухолевых клеток в условиях острого миелоидного и Т-клеточного острого лимфобластного лейкозов [11], влияет на эмиграцию Т-клеток из тимуса у пациентов с СД 2 типа [6]. Kang K. et al. (2013) продемонстрировали способность метформина уменьшать количество RORyt+ CD4+Тh17-клеток в лимфатических узлах у мышей с аутоиммунным ревматоидным артритом, снижать уровень сывороточных провоспалительных цитокинов TNFa и IL-1 [14]. Способность метформина блокировать активацию ТЫ7-клеток, продукцию IFNy и IL-17 была продемонстрирована и на модели системной красной волчанки [32]. Эффекты метформина на уровень иммунного ответа также реализуются через ингибирование МНС-рестриктированной презентации антигенов АПК, в частности путем супрессии продукции дендритными клетками костимулирующих факторов, таких как CD54, CD80 и CD86 [27]. В недавнем исследовании Forslund K. et al. (2015) продемонстрирована способность метформи-на вызывать изменения в кишечном микробио-ме у пациентов с СД 2 типа, в частности влиять на продукцию короткоцепочных жирных кислот [8], которые через свои рецепторы, в частности FFAR2, влияют на дифференцировку Т-клеток, особенно Treg. Установленные нами возрастание уровня мРНК AMPK1a и угнетение экспрессии mTOR в ПЛУ после введений метформина диабетическим крысам свидетельствуют о возможности его использования для коррекции иммунных нарушений, развивающихся при СД.
Список литературы / References
1. Basu S., Hubbard B., Shevach E.M. Foxp3-mediated inhibition of Akt inhibits Glutl (glucose transporter 1) expression in human T regulatory cells. J. Leukoc. Biol., 2015, Vol. 97, no. 2, рр. 279-283.
2. Buck M.D., O'Sullivan D., Pearce E.L. T cell metabolism drives immunity. J. Exp. Med., 2015, Vol. 212, no. 9, рр. 1345-1360.
3. Calderon B., Unanue E. Antigen presentation events in autoimmune diabetes. Curr. Opin. Immunol., 2012, Vol. 24, no. 1, рр. 119-128.
4. Chapman N.M., Chi H. mTOR signaling, Tregs and immune modulation. Immunotherapy, 2014, Vol. 6, no. 12, рр. 1295-1311.
5. Chi H. Regulation and function of mTOR signalling in T cell fate decisions. J. Nat. Rev. Immunol., 2012, Vol. 325, р. 38.
6. Dworacki G., Urazayev O., Bekmukhambetov Y., Iskakova S., Frycz B.A., Jagodzinski P.P., Dworacka M. Thymic emigration patterns in patients with type 2 diabetes treated with metformin. Immunology, 2015, Vol. 146, no. 3, рр. 456-469.
7. Foretz M., Guigas B., Bertrand L., Pollak M., Viollet B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab., 2014, Vol. 20, no. 6, рр. 953-966.
8. Forslund K., Hildebrand F., Nielsen T., Falony G. Disentangling type 2 diabetes and metformin treatment signatures in the human gut microbiota. Nature, 2015, Vol. 528, no. 7581, рр. 262-266.
9. Gagnerault M., Lua J., Lotto C., Lepau F. Pancreatic lymph nodes are required for priming of в cell reactive T cells in NOD mice. J. Exp. Med., 2002, Vol. 196, рр. 369-377.
10. Gerriets V., Rathmell J. Metabolic pathways in T cell fate and function. Trends Immunol., 2012, Vol. 33, no. 4, рр. 168-173.
11. Green A.S., Chapuis N., Trovati M.T, Willems L., Lambert M., Arnoult C. The LKB1/AMPK signaling pathway has tumor suppressor activity in acute myeloid leukemia through the repression of mTOR-dependent oncogenic mRNA translation. Blood, 2010, Vol. 116, pp. 4262-4273.
12. Hardie D. AMPK: a target for drugs and natural products with effects on both diabetes and cancer. J. Diabetes, 2013, Vol. 216, p. 72.
13. Hardie D.G., Ashford M.L. AMPK: regulating energy balance at the cellular and whole body levels. Physiology (Bethesda), 2014, Vol. 29, no. 2, pp. 99-107.
14. Kang K.Y., Kim Y.K., Yi H., Kim J., Jung H.R., Kim I.J., Cho J.H., Park S.H., Kim H.Y., Ju J.H. Metformin down regulates Th17 cells differentiation and attenuates murine autoimmune arthritis. Int. Immunopharmacol., 2013, Vol. 16, no. 1, pp. 85-92.
15. Liu Y., Zhang D.T., Liu X.G. mTOR signaling in T cell immunity and autoimmunity. Int. Rev. Immunol., 2015, Vol. 34, no. 1, pp. 50-66.
16. Macintyre A.N., Gerriets V.A., Nichols A.G., Michalek R.D., Rudolph M.C., Deoliveira D., Anderson S.M., Abel E.D., Chen B.J., Hale L.P., Rathmell J.C. The glucose transporter Glut1 is selectively essential for CD4 T cell activation and effector function. Cell Metab., 2014, Vol. 20, no. 1, pp. 61-72.
17. Michalek R.D., Gerriets V.A., Jacobs S.R., Macintyre A.N., MacIver N.J., Mason E.F., Sullivan S.A., Nichols A.G., Rathmell J.C. Cutting edge: distinct glycolytic and lipid oxidative metabolic programs are essential for effector and regulatory CD4+ T cell subsets. J. Immunol., 2011, Vol. 186, no. 6, pp. 3299-3303.
18. Nath N., Khan M., Paintlia M.K., Hoda M.N., Giri S. Metformin Attenuated the Autoimmune Disease of the Central Nervous System in Animal Models of Multiple Sclerosis. The Journal of Immunology, 2009,182, pp. 8005-8014.
19. Palmer C.S., Hussain T., Duette G., Weller T.J., Ostrowski M., Sada-Ovalle I., Crowe S.M. Regulators of glucose metabolism in CD4+ and CD8+ T cells. Int. Rev. Immunol., 2015, Vol. 25, pp. 1-12.
20. Pearce E.L., Walsh M.C., Cejas P.J., Harms G.M., Shen H., Wang L.S., Jones R.G., Choi Y. Enhancing CD8 T-cell memory by modulating fatty acid metabolism. Nature, 2009, Vol. 460, pp. 103-107.
21. Pollizzi K.N., Patel C.H., Sun I.H., Oh M.H., Waickman A.T., Wen J., Delgoffe G.M., Powell J.D. mTORC1 and mTORC2 selectively regulate CD8+ T cell differentiation. J. Clin. Invest., 2015, Vol. 125, no. 5, pp. 2090-2108.
22. Pollizzi K.N., Powell J.D. Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns. Trends Immunol., 2015, Vol. 36, no. 1, pp. 13-20.
23. Powell J.D., Pollizzi K.N., Heikamp E.B., Horton M.R. Regulation of immune responses by mTOR. Annu Rev. Immunol., 2012, pp. 39-68.
24. Rolf J., Zarrouk M., Finlay D.K., Foretz M., Viollet B., Cantrell D.A. AMPKa 1: A glucose sensor that controls CD8 T-cell memory. Eur. J. Immunol., 2013, Vol. 43, no. 4, pp. 889-896.
25. Russo G.L., Russo M., Ungaro P. AMP-activated protein kinase: a target for old drugs against diabetes and cancer. J. Biochem. Pharmacol., 2013, Vol. 339, p. 50.
26. Shan J., Feng L., Sun G., Chen P., Zhou Y., Xia M., Li H., Li Y. Interplay between mTOR and STAT5 signaling modulates the balance between regulatory and effective T cells. Immunobiology, 2015, Vol. 220, no. 4, pp. 510-517.
27. Shin S., Hyun B., Lee A., Kong H., Han S., Lee C.K., Ha N.J., Kim K. Metformin Suppresses MHC-Restricted Antigen Presentation by Inhibiting Co-Stimulatory Factors and MHC Molecules in APCs. Biomol. Ther., 2013, Vol. 21, no. 1, pp. 35-41.
28. Waickman A.T., Powell J.D. mTOR, metabolism, and the regulation of T-cell differentiation and function. J. Immunol Rev., 2012, pp. 43-58.
29. Wang R., Dillon C.P., Shi L.Z., Milasta S., Carter R., Finkelstein D., McCormick L.L., Fitzgerald P., Chi H., Munger J., Green D.R. The transcription factor Myc controls metabolic reprogramming upon T lymphocyte activation. Immunity, 2011, Vol. 35, pp. 871-882.
30. Xu X., Ye L., Araki K., Ahmed R. mTOR, linking metabolism and immunity. Semin. Immunol., 2012, Vol. 24, no. 6, pp. 429-435.
31. Yang K., Chi H. mTOR and metabolic pathways in T cell quiescence and functional activation. Semin. Immunol., 2012, Vоl. 421, p. 8.
32. Yin Y., Choi S.C., Xu Z., Zeumer L., Kanda N., Croker B.P., Morel L. Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus. J. Immunol., 2015, Vol. 25, pp. 80-90.
33. Zarrouk M., Finlay D.K., Foretz M., Viollet B., Cantrell D.A. Adenosine-mono-phosphate-activated protein kinase-independent effects of metformin in T cells. PLoS One., 2014, Vol. 2, no. 9, е. 106710.
34. Zeng H., Chi H. Metabolic control of regulatory T cell development and function. Trends Immunol., 2015, Vol. 36, no. 1, pp. 3-12.
Авторы:
Путилин Д.А. — ассистент кафедры нормальной физиологии, Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
Камышный А.М. — д.м.н., профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, заведующий молекулярно-генетической лабораторией, Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
Поступила 22.04.2016 Отправлена на доработку 31.05.2016 Принята к печати 20.06.2016
Authors:
Putilin D.A., Assistant Professor, Department of Normal Physiology, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine
Kamyshnyi A.M., PhD, MD (Medicine), Professor, Chief, Department of Microbiology, Virology, and Immunology, Head, Laboratory of Molecular Genetics, Zaporozhye State Medical University, Zaporozhye, Ukraine
Received 22.04.2016 Revision received 31.05.2016 Accepted 20.06.2016
