Анализ спектров поглощения газовыделений колоний бактерий с использованием методов лазерной спектроскопии и интегральной оценки состояния Текст научной статьи по специальности «Математика»

31

Оптоэлектроника в медицине

УДК 535.34; 57.013

О. П. Бочкарева, канд. мед. наук, Ю. В. Кистенев, д-р физ.-мат. наук, Е. П. Красноженов, д-р мед. наук, Е. С. Никотин, аспирант, В. А. Фокин, канд. физ.-мат. наук,

Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

В. Е. Павлова, зав. лабораторией,

Томский областной противотуберкулезный диспансер

Анализ спектров поглощения газовыделении колонии бактерии с использованием методов лазерной спектроскопии и интегральной оценки состояния

Ключевые слова: газовыделения бактерий, лазерная спектроскопия, интегральная оценка состояния

В работе* представлены результаты анализа спектров поглощения газовыделений бактериальных культур, полученных с использованием техники лазерной спектроскопии и методов интегральной оценки состояния. Результаты показывают возможность контроля состояния колоний бактерий методами лазерной спектроскопии. В силу сложности функционирования бактериальных культур интерпретация экспериментальных данных достаточно нетривиальна и требует специальных методов анализа. В работе показана эффективность подхода, основанного на интегральной оценке состояния биообъекта.

Введение

Любая бактерия обладает определенным набором ферментов, определяющих особенности ее метаболизма. Часть метаболитов представляет собой летучие соединения, их можно непосредственно зарегистрировать благодаря использованию современных физических методов (см., например: [1, 2]).

Газовыделения бактерий представлены большим количеством молекулярных соединений. В частности, для получения энергии многие бактерии производят брожение, в процессе которого выделяются углекислота и водород; аммиак и азот выделяются при расщеплении белков и других азотсодержащих соединений, а также при восстановлении нитратов и нитритов. Метан является продуктом жизнедеятельности анаэробных бактерий. Ряд микроорганизмов, например Salmonella paratyphi В, способны ис-

* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке ФЦП (г/к № 02.740.11.0083, РФФИ (грант № 09-02-99038 р_офи)).

пользовать в процессе ферментации серосодержащие органические соединения, выделяя при этом значительное количество сероводорода.

Известно, что стафилококк производит аммиак, азот, оксид азота, сероводород, кишечная палочка — углекислый газ (при наличии в среде глюкозы), индол, оксид азота, синегнойная палочка — азот, оксид азота. Характерными газовыми метаболитами для микобактерий являются метанол, фторэтанол, 1-про-панол, 2-пропанол, циклогексанол, акролеин, про-пеналь, 2-бутеналь, 2-бутен, 2-метил-1-бутен, 1-пен-тен, 2-метилпропен, уксусная кислота, изопропило-вый спирт, метиловый спирт, метилформиат, 1,3-цик-лопентадиен, 1-бутиламин, диэтиламин, 1-пентаналь, метилбутаналь, пентаналь, гексаналь, 2,3-бутанди-он, 2-пентанон, 3-метил2-бутанон, 1-фенилэтанон, ацетофенон, 3-3-пентанон, 2-гексанон, 3-гексанон, ацетилацетон, аллилэтилэфир, анилин, фенол, т-, о-, р-ксилен, производные бензина, 1,3-дитиан [3].

Перспективным методом анализа сложных газовых смесей, какими являются газовыделения бактерий, является метод лазерной спектроскопии, обладающей высоким спектральным разрешением. Обнаружение и контроль газовыделений бактериальных культур (в литературе используется термин «мета-боломика») являются актуальной задачей с точки зрения контроля биозагрязнений окружающей среды, оптимизации биотехнологических процессов.

Приборное обеспечение экспериментальной части исследований

Для измерения спектров поглощения газовыделений микробиологических объектов использовался лазерный внутрирезонаторный газоанализатор

ILPA-1 (ООО «Специальные технологии», Новосибирск). Принцип действия газоанализаторов основан на оптико-акустическом (ОА) эффекте, возникающем в результате поглощения газами излучения лазерного источника. Оно пропускается через оптико-акустическую ячейку с анализируемым газом. Если частота излучения совпадает с частотой одной из линий поглощения исследуемого газа, то в результате поглощения излучения в газе появляются возбужденные молекулы. В процессе вращательной и колебательно-поступательной релаксаций газ нагревается, и в оптико-акустической ячейке возникает повышенное давление, которое регистрируется микрофоном. В эксперименте фиксируется также энергия лазерного излучения, отношение сигнала микрофона к энергии излучения содержит информацию о коэффициенте поглощения анализируемого газа на данной длине волны.

Приборы собраны на базе волноводных, перестраиваемых по частоте СО£-лазеров и резонансных оптико-акустических детекторов. Важной конструктивной особенностью газоанализаторов является возможность работать с пробами малого объема (2-5 см3), отключать прокачку при заборе пробы. Таким образом обеспечивается техническая возможность контроля газовыделений биологических микрообъектов, в частности бактерий in vitro.

Методика интеллектуального анализа спектров поглощения газовыделений бактерий

Особенностью спектра поглощения газовыделений биообъектов является то, что он формируется под влиянием большого количества разнообразных факторов. При этом бывает достаточно трудно однозначно оценить их состояние, выделяя какие-либо конкретные линии в спектре поглощения и сопоставляя с ними специфические маркеры состояния, поэтому особую важность приобретают обобщенные оценки спектра поглощения, основанные на методах интеллектуального анализа данных, под которым понимается выявление скрытых закономерностей и взаимосвязей между переменными в массивах данных. Для решения задач по интегральной оценке состояния биосистем различного уровня структурно-функциональной организации использовался следующий общий алгоритм расчета количественных оценок состояния [4]:

• задание множества состояний Si биосистемы S, где i — номер референтного состояния, на основе экспертных знаний:

{St | i е 1, К}, (1)

где К — количество различных состояний;

• формирование референтных групп объектов:

: {хи(х. х2' •••' хт)Ь 3 е ' (2)

** I

где х^ у — /-й объект ¿-го референтного состояния; N3. — количество объектов, представляющих состояние

• измерение множества показателей для каждого из состояний:

{X | хи ¡,1 е Т~К, ] е 1, ^ }, (3)

где Х1 — множество показателей, измеренных у объектов, относящихся к состоянию где г — номер референтного состояния;

• свертка множества показателей в одномерную количественную величину — интегральную оценку состояния:

X. ^; (4)

• сопоставление интервалов значений интегрального показателя и состояния, соответствующего экспертной классификации.

Критерий интегральной оценки близости объекта х; к состоянию задавался нами следующим образом:

18о (Х) = й( Х, £0) / л«50, (5)

где 4 (

XI, ) — некоторая мера близости объекта х 1 к множеству £9; — мера компактности области, занимаемой в пространстве признаков объектами, относящимися к состоянию В качестве меры близости объектов в пространстве признаков было использовано расстояние Махаланобиса:

4М (Хк, X) = (Хк - X )Т С^1 (Хк - X), (6)

где Сд — матрица ковариации признаков, характеризующих состояние

При использовании критериев, основанных на многомерных методах анализа данных, ключевая проблема связана с малыми объемами выборок, характеризующих референтное состояние, что приводит к значительной вариабельности оценок, получаемых при использовании этих методов. В этом отражается специфика биосистем и прежде всего широкая внутри- и межиндивидуальная вариабельность измеряемых показателей. Следовательно, проведение повторных измерений даже на материале одной и той же выборки может приводить к получению различных количественных значений оцениваемых характеристик. Поэтому мы выполняли сбор количественных оценок методами статистического моделирования, с применением разработанного программного обеспечения [5], что позволило, с одной стороны, количественно оценивать статистические свойства критерия интегральной оценки, а с дру-

гой — определять условия, от которых зависели объемы референтных выборок, необходимые для получения устойчивых оценок.

Результаты

Контроль суточной динамики газовыделений быстрорастущих бактериальных культур. В процессе роста бактерий в жидкой питательной среде выделяют фазы роста, отличающиеся по их физиологической активности. Для групп бактерий, характе-

ризующихся высокой скоростью роста (стафилококка, клебсиеллы, кишечной палочки, протея), определены следующие фазы:

• исходная фаза (2 ч): микроорганизмы адаптируются к питательной среде, увеличивается размер клеток;

• фаза задержки размножения (2 ч): начинается интенсивный рост клеток, но скорость их деления остается невысокой;

• экспоненциальная фаза (5 ч): имеет место постоянная максимальная скорость деления клеток и значительное увеличение числа клеток в популяции;

940 960 980 1000 1020 1040 1060 1080

V, см

-1

Рис. 1 | Суточная динамика интенсивности газовыделений колонии бактерий кишечной палочки

940 960 980 1000 1020 1040 1060 1080

V, см

1

Рис. 2 | Суточная динамика интенсивности газовыделений колонии бактерий клебсиеллы

• фаза отрицательного ускорения (2 ч): проис ходит постепенное замедление интенсивности рос та колонии;

• стационарная фаза (2 ч): число клеток в по пуляции перестает увеличиваться, наступает рав новесие между числом вновь образующихся и гиб нущих клеток;

• фаза ускорения гибели (3 ч): в популяции чис ленно преобладают погибшие клетки;

• логарифмическая фаза (5 ч): происходит прогрессивное снижение числа жизнеспособных бактерий;

• фаза уменьшения скорости отмирания (3 ч): оставшиеся живые бактерии переходят в состояние покоя.

На рис. 1-4 представлены результаты измерений суточной динамики интенсивности газовыделений бактериальных культур стафилококка, клебсиеллы, кишечной палочки и протея после посева на чистый

940 960 980 1000 1020 1040 1060 1080

V

Рис. 3 | Суточная динамика интенсивности газовыделений колонии бактерий протея

940 960 980 1000 1020 1040 1060 1080 V, см

Рис. 4 | Суточная динамика интенсивности газовыделений колонии бактерий стафилококка

питательный бульон. На рисунках использованы следующие обозначения: K(v) — коэффициент поглощения, v — частота генерации С02-лазера, входящего в состав газоанализатора.

Представленные экспериментальные данные показывают, что интенсивность газовыделений колоний бактерий, контролируемая методами лазерной оптико-акустической спектроскопии, хорошо коррелирует с фазами их роста. Данный факт является подтверждением высокого потенциала лазерной оптико-акустической спектроскопии в микробиологических исследованиях.

Влияние добавок на интенсивность газовыделений микобактерий. Одним из признаков, позволяющим дифференцировать колонии бактерий Mycobacterium tuberculosis от других видов микобактерий, является отсутствие роста на питательных средах с добавлением 5%-го NaCl. В литературе встречаются упоминания о стимулирующем влиянии NaCl на микобактерии [6]. Для изучения этого факта использовали Mycobacterium smegmatis.

Нами были проведено исследование влияния добавок NaCl в питательную среду на интенсивность газовыделения микобактерий на примере Mycobacterium smegmatis. Данная культура засевалась на мясопептонный агар (МПА) с добавлением NaCl (солевой МПА) в концентрациях 1, 5 и 10 %. Посевы помещались в термостат с температурой 37 °С). Через сутки после инкубации посевов отмечалось появление отдельных колоний в чашке Петри с 1 %-м солевым агаром. Посевы на 5 и 10 % -й солевой агар оставались стерильными. На вторые сутки на 1 %-м солевом агаре отмечался интенсивный рост Mycobacterium smegmatis. На 5 %-м солевом агаре выявлялись единичные колонии. Чашки с 10 % -м солевым агаром оставались стерильными (рис. 5).

Количественная оценка интенсивности газовыделений проводилась по результатам измерения спектров поглощения газовых проб с помощью газоанализатора ILPA-1. При проведении расчетов интегральные оценки рассчитывались для векторов состояния биосистемы, координатами которых яв-

Рис. 5 Рост колонии бактерий Mycobacterium smegmatis на МПА с добавлением NaCl различных концентраций:

1 — 10 %; 2 — 5 %; 3 — 1 %

лялись величины интенсивности поглощения на частотах генерации С02-лазера в диапазонах 924-956 и 964-986 см~*. Результаты расчета представлены в табл. 1. Полученные результаты показывают, что малые концентрации NaCl (порядка 1 %) существенно стимулируют интенсивность газовыделений микобактерий на ранней стадии роста колонии.

Для роста многим микобактериям нужны аминокислоты (L-аспарагин). В процессе метаболизма происходит превращение L-аспарагина в аспартат под действием фермента микобактерий аспарагиназы. При этом происходит выделение большого количества аммиака [7]. Добавленный глицерин разлагается микобактериями с образованием углекислого газа (С02) и воды (Н20). 0,25 г L-аспарагина и 1 мл глицерина растворяли в 45 мл дистиллированной воды. Кислотность раствора (рН) доводили до 7,2 добавлением NaOH. Полученный раствор стерилизовали в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 мин.

В табл. 2 представлены интегральные оценки спектров поглощения газовыделений Mycobacterium smegmatis при воздействия на колонию раствором L-аспарагина и глицерина. Представленные в таблице результаты показывают, что добавление в среду

Таблица 1

Интегральная оценка интенсивности газовыделений Mycobacterium smegmatis на МПА с добавлением NaCl различной концентрации (M ± ax)

Диапазон частот, скг1

Питательная среда

Период, сут.

924-956

964-986

Без добавок NaCl, 1 % NaCl, 5 % NaCl, 10 % Без добавок NaCl, 1 % NaCl, 5 % NaCl, 10 %

19,6 ±1,3 32,6 ±2,3 5,0 ± 0,3 3,6 ±0,2 137,0± 11,3 259,4 ±22,0 15,2 ±1,2 9,2 ±0,8

95,7 ±7,1 281,5 ±20,9 7,4 ± 0,5 5,4± 0,4 262,8 ±22,9 680,8 ±64,0 28,2 ±2,6 10,3 ±0,9

567.3 ±39,7

246.4 ±18,8 6,0 ± 0,4

2.3 ± 0,13 1355,6± 121,7

572,3 ±51,0

9.4 ±0,8 4,6 ±0,3

№ S-Б (11-12)/20Ю I

биотехносфера

Таблица 2 Интегральная оценка интенсивности газовыделений Mycobacterium smegmatis

Среда Диапазон частот,см 1

924-956 964-986

МПА МПА с добавлением смеси глицерина и аспарагина 11,45 ± 0,73 133,44 ± 10,32 40,21±2,55 541,94 ± 36,59

смеси аспарагина и глицерина существенно усиливает газовыделения Mycobacterium smegmatis в области генерации СО£-лазера, данный факт может служить основой для разработки методик количественного контроля их состояния.

Заключение

Приведенные результаты показывают возможность контроля состояния колоний бактерий методами лазерной спектроскопии. Сложность функционирования бактериальных культур и взаимосвязь различных факторов приводят к тому, что биохимические процессы меняют сложным образом состав

их газовыделений. Поэтому интерпретация экспериментальных данных достаточно нетривиальна и требует специальных методов анализа. В работе показана эффективность подхода, основанного на интегральной оценке состояния биообъекта.

| Л и т е р а т у р а |

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. А. А. Воробьева. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2004. 690 с.

2. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир, 1982. 310 с.

3. Steeghs М. М. L. Development of proton-transfer reaction mass spectrometry techniques; detection of trace gases in biology and medicine: Thesis / Ranbould University. Nijme-gen, 2007. 210 p.

4. Фокин В. А. Модель согласования биомедицинских данных и комплекс программ для интегральной оценки состояния биосистем: Дис. ... д-ра техн. наук. Томск, 2009. 286 с.

5. Свидетельство об официальной регистрации. № 2006614010 РФ. Программа для ЭВМ «StatSys» / В. А. Фокин, И. С. Ха-кимов, О. Ю. Никифорова; заявка № 2006613281; заявл. 29.09.2006; опубл. 22.11.2006. М.: Роспатент, 2006.

6. Салина Е. Г. «Некультивируемые» формы бактерий Mycobacterium Smegmatis и Mycobacterium Tuberculosis и их биохимическая характеристика: Автореф. дис. ... канд. биолог. наук. М., 2006. 27 с.

7. Ott J. L. Asparaginase from mycobacteria //J. Bacteriol. 1960. Vol. 80, N 3. P. 355-361.