Механизм адаптации микобакторий к условиям существования Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 504.72

МЕХАНИЗМ АДАПТАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ К УСЛОВИЯМ СУЩЕСТВОВАНИЯ

© 2007. Нуратинов Р.А., Исламова Ф.И.

Дагестанский государственный университет, Прикаспийский зональный НИВИ

Широкий спектр ферментативной активности микобактерий позволяет им осуществлять жизненные функции и адаптироваться к условиям существования. Рассмотрены известные питательные среды в качестве субстрата и при разных условиях культивирования этих микроорганизмов.

The wide spectrum of micobacteria ferment activity helps them to fulfill their living functions and adapt to life conditions. The article considers the known nutrient habitat as a substratum and within different conditions of cultivation of these microorganisms.

Микобактерии - аэробы и хемоавтотрофы [31]. Для нормального роста и размножения, мико-бактерии нуждаются в кислороде воздуха, однако они способны расти в жидкой среде Дюбо под масляным слоем, что в значительной степени опровергает мнение о строгом аэробизме микобактерий, на основании чего рассматривают как факультативных анаэробов [2]. Считают, что условия тканевой среды, в которой размножаются микобактерии, существенно не отличаются от тех, при которых размножаются анаэробы [15,32].

Вторым важным моментом физиологии микобактерий является питание. Будучи гетеротрофами, они нуждаются во многих химических веществах, которых не могут самостоятельно синтезировать.

В тканях макроорганизма источником азота для микобактерий служат белковые молекулы, имеющие характер легко дезаминирующихся аминокислот как глутаминовая, аланиновая и в несколько меньшем количестве - гликокол [2]. В клеточной цитоплазме они способны расщеплять липиды и окислять продукты их распада, которых используют как для своего синтеза, так и для биоэнергетических потребностей. Благодаря развитой ферментативной активности, особенно эстераз, способны расщеплять жиры и утилизировать их в качестве материала для питания. Они синтезируют лецитиназу, глицерофосфатазу и уреазу, в меньшем количестве некоторых протеаз, дегидротаз и других ферментов. Такое разнообразие энзимной активности позволяет микобактериям в организме хозяина осуществлять все свои жизненные функции. Однако, не все микобактерии в одинаковой степени активны при культивировании на питательных средах, что прямо зависит от количества и разнообразия продуцируемых ферментов.

У микобактерий обнаружены следующие ферменты: каталаза (M kansasii, M. szulqai, M. scrofu-laceum, M. gordonae, M. novum, M. triviale, M. asiaticum, M. porcinum); ниацин (M. tuberculosis, M. afri-canum, M. bovis - в следовых количествах; M. microti, M. marinum - нестабильно); арилсульфатаза (почти все микобактерии кроме M. tuberculosis, M. thermoresistibili, M. duvalii - через 3 сутки); А-эстераза (M. tuberculosis, M. bovis M. africanum, M. microti, M.scrofulaceum, M. avium и другие); В-галактозидаза (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti и другие); кислая фосфотаза (M. kansasii, M. marinum, M. szulqai, M. triviale и другие); нитратредуктаза (M. tuberculosis, M. bovis - нестабильно); аце-тамидаза (у большинства быстрорастущих микобактерий); бензамидаза (M. tocaiense, M. vacce, M. neoaurum, M. smeqmatis и другие); изоникатинамидаза (M. tocoense, M. vacce и т.д.); никотинамидаза (почти у всех быстрорастущих микобактерий); алантоидаза (в следовых количествах у медленнорастущих; M. tocaiense, M. obuense и т.д.); сукцинамидаза (M. tocaiense, M. vacce, M.komossense, M. por-cinum, M. smeqmatis); уреаза (почти у всех быстрорастущих микобактерий); пропионамидаза (M. gas-tri) и пероксидаза (M. kansasii, M. marinum) [35, 37, 40].

Как видно, ферментативная активность быстрорастущих микобактерий высокая, чем у медленнорастущих. Вероятно поэтому, они менее требовательны к условиям существования, благодаря чему получили широкое распространение в окружающей среде.

Следующим важным моментом для роста микобактерий считают минеральный обмен. Для нормального роста им необходим калий, магний, фосфор и сера. Установлено, что потребность в фосфоре значительно превосходит, чем в других макроэлементах. Такое положение объясняют участием фосфора в углеводном обмене [15]. Хороший выход микобактерий туберкулеза получили на среде содержащей не менее 300 мг% фосфора, 10 мг% серы, 2,5 мг% хлористого магния [2].

Общеизвестно большое значение так называемых «ростовых факторов» для роста и размножения микробных клеток. Установлено, что лабораторные штаммы микобактерий хорошо растут на синтетических средах, без добавления каких-либо факторов роста. Однако, свежевыделенные штаммы микобактерий не обладают таким признаком, поскольку не способны синтезировать некоторые вещества, абсолютно необходимые для их развития и размножения.

Так, например, микобактерии первых генераций плохо расщепляют лецитин яиц, так как в организме хозяина они не нуждаются в синтезе фермента лецитиназы. Такую способность они приобретают только в последующих генерациях, благодаря чему рост значительно ускоряется [22].

Таким образом, микобактерии характеризуются как микроорганизмы с достаточно развитой энзимной активностью, благодаря чему обладают свойством расщеплять многие субстраты на более простые, из которых синтезируют необходимые для жизнедеятельности вещества. Вместе с тем, они требовательны в отношении наличия определенных других условий для питания и роста. На средах без этих веществ при посеве материала с малым количеством микобактерий роста практически не наблюдают. Рост их значительно улучшается, если в питательную среду добавляют фракции яичного желтка, гидролизат казеина и аспарагин (либо гликокол). Поэтому большинство известных питательных сред состоят из куриных яиц с добавлением солевых растворов.

В качестве лучшего источника углерода признан глицерин. Избирательное отношение к глицерину связывают с жировоскообразованием, поскольку обнаруживают полное соответствие между содержанием глицерина в питательной среде и процентом жира в клетках микобактерий выращенных на них [3]. Наиболее оптимальным количеством глицерина в среде считают 7,5% от объема.

Однако, многие виды микобактерий способны усваивать, а значит и расти на средах в присутствии единственного источника углерода и азота. Находят, что эти признаки можно использовать как дифференцирующие [41]. Например: в присутствии бензоата растут М. рогетыт и М. smegmatis, плохо растут М. рага/оНиШт; в присутствии малоната хорошо растут М. flei и М. smegmatis, а с 1,4 битиленг-ликола - М. flavescens и М. smegmatis^; галактозы - М. оЬиете; в присутствии ацетамида из медленнорастущих микобактерий растет только М. foгtuitum [42, 43]. Большинство микобактерий растут на средах с единственным источником углерода и азота: пирувата, н-пропанола, н-бутанола, изобутанола, мочевины, пиразинамида, никотинамида и нитрата [35,37,42].

Микобактерии не обладают протеолитическим ферментом, поэтому не расщепляют белков и не пептонизируют желатин. Считают, что чем глубже гидролизован белок, тем легче продукты его распада могут быть ассимилированы микобактериями [15]. По мнению автора, ион аммония является вполне нормальным источником азота для них.

Мнения большинства исследователей сходятся в отношении оптимальной концентрации водородных ионов в питательных средах для микобактерий. Пределы возможности выращивания микобактерий находятся при значениях рН 6,5-7,5, однако оптимальная концентрация водородных ионов имеет более узкие пределы - 7,0-7,3. Указывают, что чем дольше штамм микобактерий культивировался при определенном рН, тем он более требователен к привычной для него концентрации водородных ионов [3].

Исходя из изложенного следует, что идеальная питательная среда для микобактерий должна содержать достаточно широкий спектр питательных веществ обеспечивающих рост из малого числа бактерий находящихся в исследуемом материале, содействовать ускоренному росту, легкой идентификации типичных колоний и чистоту культур. Они могут быть жидкими и плотными, однако те и другие, наряду с достоинствами имеют и недостатки.

Следует так же отметить, что многие из предложенных питательных сред для выращивания микобактерий туберкулеза имеют лишь историческое значение.

Питательные среды для микобактерий достаточно широко описаны в монографии [2]. Однако, как в гуманной, так и в ветеринарной медицине, для бактериологической диагностики туберкулеза наиболее широко используют плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Финн II, картофельную, «Новая»

(Г.Г. Мордовского), среды 6 и 9, предложенные В. А. Аникиным с соавторами и т. д. Все перечисленные среды мало отличаются по химическому составу, физическим свойствам и состоят из солевой основы с добавлением желтков куриных яиц. Поэтому при сравнительной оценке результатов полученных исследователями, трудно определить, которая из них наиболее эффективная для индикации микобактерий. Используют так же жидкие питательные среды как Моделя, ГДР, Сотона, и ВКЛ [6,9,15,24].

Известная, традиционно используемая в бактериологии туберкулеза питательная среда Левен-штейна-Йенсена не полностью удовлетворяет запросы фтизиобактериологов. К недостаткам этой среды причисляют низкую частоту индикации микобактерий из исследуемого материала, длительные сроки появления первичных колоний, и как обязательный компонент - внесение в среду дефицитного и дорогого ингредиента - аспарагина [18]. При сравнительном испытании на высеваемость среды Ле-венштейна-Йенсена и Финн II было установлено значительное превосходство второй. Средние значения появления первичных колоний на среде Левенштейна-Йенсена 13,8 суток, тогда как на среде Финн II - 4,2. обильный рост микобактерий лабораторных штаммов на среде Левенштейна-Йенсена наблюдали через 37,6 суток, а на Финн II - через 29,2 суток.

Попытки исследователей сконструировать не менее чувствительную питательную среду, чем Ле-венштейна-Йенсена, в составе которой аспарагин был бы заменен более дешевым и доступным ингредиентом, увенчались успехом, разработкой среды Финн II. Замена аспаригина глутаминатом натрия позволило получить среду, не уступающую по высеваемости и скорости роста при первичном выделении микобактерий из биоматериалов [23]. Последняя претерпела множество разнообразных модификаций, а данные, полученные в результате сравнительных испытаний по частоте индикации и скорости роста ми-кобактерий только незначительно расходятся в ту или иную сторону, что связывают с несовершенством методов выявления МБТ, олигобациллярностью и биологическими особенностями возбудителя. [26].

Сообщают о результатах испытания модификации среды Финн II. В состав среды Финн II включили гликокол (взамен глутаминовокислого натра) - в качестве источника азота, дополнительно внесли экстракт микобактерий флеи (в качестве ростового фактора). Полученные данные свидетельствовали, что рост культур микобактерий на этой среде происходит, в среднем, на 2 сутки раньше и более обильный, чем на традиционной среде [1].

Среды, содержащие глутаминовую кислоту (взамен глутамата натрия) в составе среды Финн II не уступали по эффективности среде Левенштейна-Йенсена [28]. Автор предлагает 2 варианта среды: «Ставропольская - 2» с рН 7,1-7,3, рекомендованную для индикации микобактерий при посеве мокроты, обработанной щелочными препаратами, без последующей нейтрализации осадка перед посевом; «Ставропольская-1» - для выращивания микобактерий [23].

Испытаны среды, в которых источником углерода служат жидкие парафины. Так, питательная среда, в которой единственным источником углерода и энергии является жидкий очищенный парафин (смесь н-алканов от С12 до С18), а источником азота служит минеральная смесь аммония, оказалась более благоприятной для микобактерий. На этой среде туберкулезные микобактерии образовывали обильную бакмассу в 6-7 раз быстрее, чем на среде Левенштейна-Йенсена [12].

На возможность роста микобактерий на среде с н-алканами указывали и ранее [7,10,36]. Представители рода микобактерий были выделены из глубинных вод нефтяных месторождений [21]. Сообщают о том, что клетки M. rubrum выросшие в атмосфере пропана содержали 8,9 мкг. витамина В12 в грамме сухой биомассы [13]. Культура M. lakticolum могла образовывать красные или оранжевые пигменты, развиваясь на углеродных средах [16]. Способность роста микобактерий на средах содержащих н-алканы находит и теоретическое обоснование. Характерная для них гидрофобная клеточная стенка, содержащая высокомолекулярные миколовые кислоты, обеспечивают клеткам возможность поглощения н-алканов из среды путем пассивной диффузии [11]. Так же известно, что часть составляющих компонентов углеводородокисляющего ферментного комплекса, входит в состав дыхательной цепи, а концевая оксидаза (цитохром З-450 или цитохром О) индуцируется субстратом [4].

Известны работы, в которых в качестве источника азота в составе среды Финн II использовали дрожжевой аутолизат и аммоний щавелевокислый, а в качестве источника углерода - глицерин. Такая модификация позволила авторам повысить частоту индикации микобактерий при посевах гомо-генатов патологического материала и увеличить скорость их роста в сравнении с контрольной средой - Финн II [20]. Другие исследователи использовали комбинированную среду, в состав которой вклю-

чили дрожжевой аутолизат и смесь н-алканов. На полученной таким путем среде, сроки роста первичных колоний и обильной бакмассы сократились на 15-20 суток, а частота индикации микобактерий из патматериала от животных повысилась на 16,3%, а из мокроты больных туберкулезом людей в 2 раза по сравнению со средой Левенштейна-Йенсена [17, 18].

Сообщают о приготовлении модифицированного варианта среды Финн II, где в качестве основного органического компонента использовали триптический гидролизат кильки в сочетании с витаминным препаратом «ЭКД». Среда обеспечила выделение типичных культур микобактерий человеческого и бычьего видов из клинического материала [14].

При сравнительном испытании сухой питательной среды «Новая» (Мордовского) со средой Ле-венштейна-Йенсена пришли к выводу, что по ростовым и «механическим» свойствам, первая уступает второй [27]. Стремление увеличить скорость роста микобактерий первых генераций из биоматериалов от животных закончилось созданием питательной среды ФАСТ-3Л, обладающей специфическими ростостимулирующими свойствами. Первичный рост полевых культур на среде ФАСТ-3Л проявлялся на 14-22 сутки, на среде Левенштейна-Йенсена - на 40-53 сутки и на среде Гельберга -37-45 сутки. Интенсивность роста микобактерий на предложенной среде оценена от 3,6 до 5,0 баллов, на среде Левенштейна-Йенсена - 1,2-2,5 баллов, на среде Гельберга - 1,1-1,9 баллов [25].

Высокой чувствительностью обладают и жидкие питательные среды. Так, при сравнительном испытании сред Левенштейна-Йенсена, Шулы и вариантов, Банича и вариантов, установили существенное влияние на эффективность жидких питательных сред количества добавляемой сыворотки крупного рогатого скота. Оптимальные результаты получили на средах содержащих не менее 10% сыворотки. Рекомендуют применять среду Бунича для культивирования материала, обработанного лаурилсульфатом натрия [38]. Благоприятным оказалось влияние катодной фракции электрохимически активированной солевой композиции среды Сотона на выход жизнеспособных микобактерий и скорость их роста при культивировании in vivo [30]. При этом, рост некоторых штаммов микобактерий на 2-4 порядка превышал среду Сотона при увеличении скорости роста на 2-3 сутки.

Следует отметить, что жидкие среды не получили популярности у фтизиобактериологов в целях индикации микобактерий из биоматериалов и из проб объектов внешней среды. Считают, что частое загрязнение материалов банальной микрофлорой значительно тормозит получение первой генерации микобактерий. Вместе с тем, еще не существует такая жидкая среда, которая могла бы заменить плотные, предназначенные для индикации микобактерий. Исследователи также находят, что частота индикации микобактерий из биоматериалов на той или иной питательной среде, равно как их эффективность, зависима от способов предпосевной обработки биоматериала, от условий культивирования. Трудности, связанные с выделением чистых культур микобактерий, обусловлены обсеме-ненностью большинства анализируемых образцов (патологических материалов человека и животных, почв, воды и т.д.) микроорганизмами размножающими значительно быстрее микобактерий. В связи с этим предложен ряд методов и препаратов для освобождения исследуемых проб от посторонней микрофлоры: методы с использованием растворов NaOH, Н28О4, Na3PO4, N-ацетил - L - цистеина и NaOH, цифирана и Na3PO4, Na-лаурилсульфата и NaOH, цетилпиринидий хлорида, NaCL, хлоргекси-динбиглюконикума и т.д. [5,8,33, 34,39]. Кроме того, условия культивирования оказывают существенное влияние на рост и размножение микобактерий. При сравнительном испытании различных пробок к пробиркам с посевами, лучшие результаты получили на пробирках с корковыми пробками, несколько хуже - с резиновыми с прорезом, затем - с ватно-марлевыми и самый худший рост оказался в пробирках с резиновыми пробками без прореза [6,19]. Изложенное показывает, что мнения большинства исследователей сходятся в том, что для выделения микобактерий следует использовать несколько питательных сред. Наряду с этим, предлагают отработанные комплексы методов предпосевной обработки биоматериала в сочетании с условиями культивирования. Такое положение говорит о несовершенстве методов выделения микобактерий, а значит, соответственно, о низкой эффективности используемых питательных сред. Поэтому, разработка новых эффективных питательных сред для индикации и культивирования микобактерий является актуальной проблемой.

Библиографический список

1. Алиев А.И., Фадеева Н.Г., СалиховЮ.С. Улучшенная среда для культивированияM. phlei // Сб. н. работ ДагНИВИ.

- 1976. - Т.8. - С.35-40. 2. Василев В.Н. Микобактериозы и микозы легких. - София: Медицина и физкультура, 1971. - 382 с. 3. Вишневский П.П. Туберкулез крупного рогатого скота. - Москва: Сельхозгиз, 1935. - 172 с. 4. Готшалк Г. Метаболизм микобактерий. - Москва, 1982. 5. Должанский В.М., Капюк А.Н., Немсадзе М.Н. и др. Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза. - Москва, 1992. - 22 с. 6. Донченко А.С., Донченко В.С. Туберкулез крупного рогатого скота, верблюдов, яков, овец и пантовых оленей. - Новосибирск, 1994. - 353 с. 7. Ерошин В.К., Перцовская А.Ф., Скрябин Г.К. О росте грибов Mucoralis на парафине // Микробиология. - 1965. - Т.ХХХ1У. - С. 883. 8. ЗыковМ.П., Ильина Т.Б. Потенциально патогенные микобактерии и лабораторная диагностика микобактериозов. - Москва: Медицина, 1978. - 174 с. 9. Иванов М.М. Основные методы получения туберкулина и изучение его активности // Тр. Всесоз. Гос. науч. контроль. института. - Москва, 1959. - Вып. 8. - С.50-54. 10. Иерусалимский Н.Д., Скрябин Г.К. Исследование микрофлоры сточных вод нефтеперерабатывающих предприятий // Прикладная биохимия и микробиология. - 1965. - №1. - С.163. 11. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. // Успехи микробиологии. - 1977. - №12. - С.164-189. 12. Коронелли Т.В., Фадеева Н.И. Культивирование туберкулезных и условно-патогенных микобактерий на среде с н-алканами // Пробл. туб. - 1986. - С.44-46. 13. Маврина Л.А., Кузнецова В.А. Аминокислотный состав белка метанпропионокисляющих бактерий // Приклад. биохим. и микробиол. - 1965. - Т.11. - 87 с. 14. Меджидов М.М., Темирханова З.У., Балаклеец В.С., Алиева Х.М., Шаломинская Г.Д. К вопросу о питательных средах для выделения олигобациллярных форм туберкулеза. // Мат. междунар. науч. конф. - Махачкала, 1998. - С.105-107. 15. Модель Л.М. Биология туберкулезных микобактерий и иммунобиология туберкулеза. Москва: Медгиз, 1958. - 315 с. 16. Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардо-подобные и коринеподобные бактерии. - Киев: Наукова думка, 1985. - 333 с. 17. Нуратинов Р.А. Выявление больного туберкулезом крупного рогатого скота в состоянии анергии к туберкулину. Автореф. дис.. канд. вет. наук. -Москва, 1987. - 22 с. 18. Нуратинов Р.А., Вердиева Э.А., Гаргацов А.А. Влияние качественного изменения состава питательной среды Финн II на выделение и культивирование микобактерий, нокардий и родококков. / Мат. медунар. науч. конф., посв. 70-летию НПО «Питательные среды». - Махачкала, 1998. - С.103-105. 19. РумачикИ.И. Сравнительное испытание различных пробок при культивировании микобактерий // Ветер. - 1989. - №1. - С.62-63. 20. Самилло Г.К., Ромашева Е.Н. Пути повышения высе-ваемости и ускорения роста микобактерий на модифицированной среде Финн II // Пробл. туб. - 1988. - №12. - С.62-63. 21. Славнина Г.П. Термоустойчивые бактерии, окисляющие газообразные и жидкие углеводороды // Микробиология. - 1963. -Т.ХХХП. - С.121. 22. Ургуев К.Р. Клостридиозы овец. - Москва: Россельхозиздат, 1987. - 182 с. 23. Финн Э.Р. Пути повышения высеваемости и ускорения роста микобактерий туберкулеза в современных условиях их изменчивости: Автореф. дис.. канд. мед.. наук. - Кишинев, 1973. - 22 с. 24. Хайкин Б.Я., Боганец Н.С. Сравнительная оценка высеваемости и скорости роста микобактерий на питательных средах. / Научно-техн. Бюлл. ВАСХНИЛ. Сиб. отд. - Новосибирск, 1985. - Вып. 30.

- С.34-37. 25. Ходун Л.М. Лабораторные методы экспресс диагностики туберкулеза животных. / Тез. докл. науч. конф. «100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России». - Курск, 1996. - С.335-338. 26. Чернушенко Е.Ф., КлименкоМ.Т. Микробиологическая диагностика туберкулеза / Реф. сб. «Туберкулез». - 1999. - №3. - С.1-5. 27. Чичибабин Е.С. Испытание питательной среды «Новая» (Мордовского) в практических условиях бактериологической лаборатории // Пробл. туб. - 1983. - №1. - С.67-68. 28. Чичибабин Е.С. Питательные среды для выращивания микобактерий туберкулеза. // Пробл. туб. - 1987. - №2. - С.56-58. 29. Чичибабин Е.С. Совершенство питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза. // Пробл. туб. - 1990. - №2. - С.60-61. 30. Ющенко А.А., Ющин М.Ю., Иртуганова О.А. Способ культивирования медленнорастущих микобактерий // Реф. сб. «Туберкулез». - 1999. - №4. - С.9-14. 31. Besta B. Atipical mikobacteria // Clinical and bacteriological studies. Bull. Union Int cjntre Tubercl. - 1959. - V.29. - P.308-322. 32. Cflmette A. Infetion bacil-larie et la tuberculose chez I homme et chez les animaux, Vasson Cie, Paris, 1936. 33. Yenkins P.A. Diagnostic Bacteriologi. // The biologii of the Mycobacteria. - Acad press. - 1982. - V.1. - P.441-470. 34. Kubica Q.P. The genus Mycobacterium (except M.leprae). // The procariotes. - Berlin Heidelberg: Springer, 1981. - V.2. - P.1962-1984. 35. Levy-Frebault V. Mycobacterium fallax sp. Nov. // Int Q. Sist. Bacteriol. - 1983. - 33. - № . - P.336-343. 36. Likines H.B, Foster I. W. // G. allq. Microbiol. - 1963.

- Vol. 3. - P.251-264. 37. Meisner Q. Et al. A. Cooperative numerical analisis of nonscoto-and nonphotochromoqenic slowly qro-vinq mycobacteria // G. Gen. Microbiol. - 1974. - 83. - №2. - P.207-237. 38. Mysac J. Moznost ponciti tekutych pud pri kultivaci sput zpracovanyych laurilsulfates sodnim // Stud. Pnemuol. Phtisea cech. - 1974. - 9. - P.608-612. 39. Runion E.H. Mycobacterium. - In: Manual of clinical microbiologi. 2 nd ed //Amer. Soc. Microbiol. - 1981. - P.150-179. 40. Tsukamura M. // Int. G. Sist. Bacteriol. - 1981. - 31. - №3. - P.247-258. 41. Tsukamura M. // Int. G. Sist Bacteriol - 1982. - 32. - №1. - P.67-69. 42. Tsukamura M. // Int. G. Sist. Bacteriol. - 1983. - 33. - №2. - P.162-165. 43. Wayne L.G. et al. // G. Qen Microbiol. - 1978. - 109. - №2.

- P.319-327.