CC BY
49
БИОТЕХНОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
Известия ТСХА, выпуск 4, 2011 год
УДК 577.212.3: 635.25/.26: 615.322
АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ САЙТОВ МЕТИЛИРОВАНИЯ НА ХРОМОСОМАХ 6 И 8 ALLIUM FISTULOSUM L.
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ К 5-МЕТИЛЦИТ ОЗИНУ
М.В. БУДЫЛИН, А.Н. САХАРОВА, ГН. АНДРЕЕВА, Л.И. ХРУСТАЛЕВА
(Центр молекулярной биотехнологии, кафедра генетики и биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева)
Проведены исследования распределения сайтов метилирования на хромосомах 6 и 8 Allium fistulosum L. с использованием антител к 5-метилцитозину. Установлено, что стабильно были метилированы дистальные регионы хромосом. Выявлены различия в метилировании гомологичных хромосом. Показано наибольшее соответствие стабильных сайтов метилирования с локализацией субтеломерного тандемного повтора и С-бэндами.
Ключевые слова: метилирование, хромосомы, Allium fistulosum.
В настоящее время накопилось достаточно знаний о характере метилирования ДНК у животных и грибов, однако данных о метилировании ДНК в растениях гораздо меньше, при этом известно, что ДНК растений является сильно метилированной [14]. Происхождение и функция такого высокого уровня метилирования на растениях пока остаются не совсем ясными. Уровень метилирования ДНК у растений в среднем в 10 раз выше, чем у позвоночных [8, 9]. При этом наблюдаются значительные различия в уровне метилирования ДНК у разных видов растений. К примеру, у араби-допсиса метилировано 6% цитозина, у большинства других растений — 20-30%. Эти различия связаны как с количеством повторяющихся последовательностей, так и с разным уровнем метилирования CNG-последовательностей [4].
Метилирование ДНК контролирует все генетические процессы в клетке, такие как репликация, транскрипция, репарация ДНК, рекомбинация, транспозиция генов, и является механизмом клеточной и половой дифференцировки и геномного импринтинга [2, 10]. Было показано, что у животных метилирование контролирует работу генов в процессе развития и клеточной дифференцировки, которое выражается в корреляции между слабым метилированием и активностью генов и полным метилированием в нетранскрибируемых регионах. Сохраняется ли эта корреляция в клетках растений, пока неясно. Похоже, что такая корреляция поддерживается в работе гена зеина кукрузы, но отсутствует в работе гена алкогольдегидрогеназы [20, 25]. В любом случае трудно себе представить, что все 5-метилцитозины у растений участвуют в контроле экспрессии генов. Наиболее хорошо метилирование изучено на Arabidopsis thaliana. Известны гены, отвечающие за метилирование. Показано, что метилирование наследуется стабильно. После обработки растений 5-азацитидином молчащие вследствие метилирования гены начинают работать, при этом на растениях наблюдали различные аномалии [11, 15, 17]. Исследования, проведенные в
2010 г. на гибридах между Raphanus и Brassica, показали значительные различия в сайтах метилирования по сравнению с родительскими формами, что может указывать на важную роль метилирования для стабилизации гибрида в процессе его формирования, когда сайты метилирования координируют взаимодействие ядерных генов с цитоплазматическими генами [16].
ДНК прокариот содержит модифицированные основания ^-метиладенин и 5-метилцитозин, тогда как ДНК высших эукариот в основном содержит
5-метилцитозин [1, 23, 25, 27]. Специфические антитела к 5-метилцитозину (5-мС) позволяют локализовать метилированные участки ДНК на физической хромосоме [18]. Детекция метилированных регионов с помощью антител к 5-мС была проведена на хромосомах человека и животных [19, 23], а также хромосомах растений: политенных хромосомах Phaseolus coccineus [5] и митотических метафазных хромосомах Allium cepa [6].
Нами были проведены исследования сайтов метилирования ДНК на митотических хромосомах A. fistulosum. Предпосылкой для проведения этих исследований послужил тот факт, что к настоящему времени накоплено достаточно данных о том, что стабильные сайты метилирования не несут в себе генов [1]. Возникают вопросы: во-первых, существуют ли стабильные сайты метилирования в геноме A. fistulosum и, во-вторых, будут ли они совпадать с местами локализации некодирующей повторяющейся ДНК? Несмотря на то, что сам феномен метилирования ДНК является эпигенетическим процессом и отражает как структуру, так и функциональную активность хромосом, анализ распределения сайтов метилирования на человеке и животных показал наличие стабильных сайтов метилирования [19, 23].
Материал и методы
Семена лука-батуна Allium fistulosum L. (2n=16), сорт Parado, проращивали в термостате при температуре 22°С, проводили предобработку корешков в насыщенном растворе а-бром-нафталине с последующей фиксацией в фиксаторе Кларка (3:1). Хромосомные препараты готовили по стандартной методике методом распластывания клеток [21].
Иммунная детекция. Предобработка препаратов хромосом заключалась в следующем: фиксация в 1%-м растворе формальдегида в PBS буфере (10 мМ фосфат натрия, 143 мМ NaCl) в течение 10 мин, промывка 2 раза в течение 5 мин в PBS, де-гидратировация стекол в 70%, 90% и 100% спиртах, денатурация хромосомной ДНК в HB50 (2x SSC, 50% формамид, 50 mM натрия фосфат pH 7,0) при t 80°C в течение 2 мин, промывка стекол в ледяном растворе 2х SSC в течение 5 мин 2 раза, инкубирование стекол в 1% BSA в PBS при t 37°С в течение 30 мин во влажной камере. Иммунную детекцию проводили антителами к 5-метилцитозину, полученными в мышах (Calbiochem Cat. No. NA81), с последующей детекцией антимышиными антителами, конъюгированными с флуорохромом FITC (Calbiochem Cat. No. 401219), хроматин окрашивали DAPI.
Микроскопию проводили на флуоресцентном микроскопе Carl Zeise Axiolmager (http://www.zeiss.com/), оснащённым ртутной лампой, набором фильтров для просмотра DAPI и FITC флуорохромов, цифровой камерой Axio Cam MRm. Обработку изображений производили с помощью Axio Vision, версия 4.6.3 пакета программ анализа изображений для современного микроскопа.
Анализ сайтов метилирования. Размер сайтов метилирования измеряли с помощью программы Micro Measure [22]. Измеряли длину хромосомы, центромерный индекс, размер каждого четко выраженного сайта метилирования. Данные обрабатывали с помощью программы Excel MS 2003.
Был проведен анализ распределения сайтов метилирования вдоль митотических метафазных хромосом А. fistulosum. На рисунке 1 представлена митотическая метафазная пластинка хромосом после иммунодетекции сайтов метилирования ДНК с использованием антител к 5-мС. Нами были выбраны для анализа хромосомы 6 и 8, так как эти хромосомы легко идентифицируются в хромосомном наборе без проведения кариотипирования: хромосома 6 — это субакроцентрическая хромосома, несущая спутник с относительной длиной 11,9±0,3 и центромерным индексом 18,2±2,6; хромосома 8 — это самая маленькая хромосома набора с относительной длиной 10,3±0,3 и центромерным индексом 38,2±3,0.
«А * • * *
; * * <
Л
"г
а б
Рис. 1. Митотическая метафаза А. Я^иОэит после детекции сайтов метилирования с антителами к 5-мС. Зеленая флуоресценция — места посадки антител, голубая флуоресценция — контрокрашивание хромосом DAPI: а) микрофотосъемка с использованием только FITC-фильтра; б) микрофотосъемка с использованием DAPI- и FITC- фильтров с последующим совмещением образов в программе AxioVision, версия 4.6
Хромосома 6. Анализ хромосомы 6 показал, что стабильно были метилированы дистальные регионы на обоих плечах. На длинном плече длина сайта метилирования составила в среднем 18,0% ± 3,2, а на коротком плече размер сайта — в среднем был 9,6% ± 1,9 хромосомы. У некоторых анализируемых хромосом 6 на длинном плече выявлены сайты метилирования в прицентромерной области — в среднем 14,5% ± 6,6 длины хромосомы и на этих же хромосомах были метилированы интер-калярные участки — 12,3% ± 5,5 длины хромосомы. На коротком плече интеркаляр-ных сайтов метилирования не было выявлено. Следует отметить наличие различий в распределении сайтов метилирования в гомологичных хромосомах. В ряде случаев соответствующие сайты в гомологичных хромосомах могли быть метилированы в одном гомологе и неметилированы в другом. Спутник не имеел четко выраженных сайтов метилирования. Результаты измерений для хромосом, несущих сайты метилирования только на дистальных участках, представлены в таблице 1. На основании полученных экспериментальных данных была составлена идиограмма хромосомы 6 с указанием размеров и положения стабильно и редко метилированных сайтов (рис. 2).
Т а б л и ц а 1
Размеры стабильных сайтов метилирования в дистальных районах хромосомы 6
АШит Ши!оэит
Длинное плечо Короткое плечо Спут- ник** Общая
Хромосома длина всего плеча длина дисталь- ного метили- рован- ного сайта длина неме- тили- рован- ного сайта длина всего плеча длина дисталь- ного метили- рован- ного сайта длина неме- тили- рован- ного сайта длина спут- ника* длина метили-рованых участков в хромосоме, %
1 85,08* 18,66 66,41 14,92 7,51 7,41 13,77 26,2
2 81,81 17,65 64,15 18,44 7,5 10,94 15,53 25,2
3 81,81 10,09 71,72 18,2 5,04 13,16 14,2 15,1
4 80,71 10,46 70,26 19,3 8,32 10,97 14,46 18,8
5 82,36 22,39 59,97 17,64 11,07 6,57 12,44 33,5
6 81,69 22,57 59,12 18,31 13,08 5,23 12,3 35,7
7 80,32 10,88 69,45 19,68 13,55 6,13 12,53 24,4
8 78,32 17,14 61,18 21,68 13,58 8,1 13,4 30,7
9 85,55 22,91 62,64 14,44 10,54 3,9 33,4
10 84,99 12,55 72,44 15 10,17 4,83 22,7
11 87,39 8,97 69,86 12,61 11,34 1,27 10,44 28,9
12 88,22 6,21 82,01 11,77 11,77 0 20,1
13 83,77 6,47 77,3 16,22 10,4 5,82 16,9
14 81,12 8,36 72,76 18,88 11,87 7,01 10,47 20,2
15 84,57 8,33 76,24 15,43 6,86 8,57 15,2
16 83,77 20,37 63,4 16,23 11,58 4,64 31,9
Среднее значение 83,09 14,00 68,68 16,80 9,61 6,53 8,10 24,9
Стандартное отклонение среднего, р=0,95 1,44 3,22 3,53 1,42 1,9 2,22 3,5 5,70
* Размеры длин указаны в процентах относительно длины всей хромосомы (без учета размера спутника).
** Не у всех анализированных хромосом были сохранены спутники при приготовлении цитологических препаратов. Сайтов метилирования на спутниках выявлено не было.
Хромосома 8. На хромосоме 8 были стабильно метилированы дистальные участки короткого и длинного плеча. На коротком плече размер метилированного сайта в среднем составил 18,9% ± 4,1 от длины всей хромосомы. Выявлено два случая, когда короткое плечо было почти по всей длине метилировано. В двух вариантах были метилированы прицентромерные участки, длина сайта метилирования составила 11,7% ± 8,05. Был отмечен единичный вариант интеркалярного метилирования короткого плеча, размер сайта составил 14,1%. Длинное плечо было стабильно метилировано в дистальном регионе, длина сайта метилирования соста-
вила 19,8% ± 4,7 хромосомы, в трех случаях метилированы прицентромерные области, длина участка составила 19,2% ± 7,1. Как и на хромосоме 6, были выявлены различия в метилировании соответсвующих сайтов у гомологов.
Результаты измерений представлены в таблице 2 для хромосом, несущих сайты метилирования только на дистальных участках. На основании полученных экспериментальных данных была составлена идиограмма хромосомы 8 с указанием сайтов метилирования (рис. 3).
Обсуждение
Нами впервые было проведено изучение распределения сайтов метилирования ДНК на хромосмах A. fistulosum. Физическая организация сайтов метилированной ДНК на хромосомах растений мало изучена. Большинство работ по in situ локализации метилированной ДНК выполнены на хромосомах человека и животных клетках.
Рис. 2. Расположение сайтов метилирования на хромосоме 6 лука Allium fistulosum: а) зеленая флуоресценция — места посадки антител к 5-мС; b) идиограмма хромосомы — районы стабильно
метилированные; !>'• У— районы редко метилированные, I I — неметилиро-ванные районы
Т а б л и ц а 2
Размеры стабильных сайтов метилирования в дистальных регионах хромосомы 8
Allium fistulosum
Длинное плечо Короткое плечо Общая
Всего проанализировано хромосом длина всего плеча длина дистального метилированного сайта длина немети- лирован- ного сайта длина всего плеча длина дистального метилированного сайта длина немети -лированного сайта длина метилированных участков в хромосоме, %
1 61,4* 15,1 36,3 38,6 21,4 27,2 36,5
2 59,5 15,9 43,6 40,6 13,4 29,1 29,4
3 61,4 17,8 43,6 38,6 21,8 16,8 39,5
4 62,5 16,3 46,2 37,5 21,7 9,8 38,0
5 63,2 16,1 47,1 36,8 30,3 6,5 46,3
6 62,4 11,0 51,4 37,6 14,6 22,8 25,6
7 59,1 15,6 59,1 40,9 14,8 26,7 30,3
8 59,7 31,7 28,0 40,3 14,7 25,6 46,4
9 63,8 24,2 39,6 36,2 16,8 19,5 40,9
10 63,6 16,5 47,1 36,4 14,8 21,6 31,3
11 69,2 29,2 40,0 30,8 13,7 17,1 42,9
Среднее значение 62,2 19,8 43,8 38,8 18,9 20,2 37,0
Стандартное отклонение среднего, р=0,95 2,2 4,7 6,8 3,0 4,1 7,3 7,8
* Размеры длин указаны в процентах относительно длины всей хромосомы.
Рис. 3. Расположение сайтов метилирования на хромосоме 8 лука Allium fistulosum: с) зеленая флуоресценция — места посадки антител
к 5-мС; с1) идиограмма хромосомы 8 районы стабильно метилированные районы редко метилированные, ЕГ
Ш77\ ZI
не-
Проведенный нами сравнительный анализ локализации сайтов метилирования с полученными ранее данными распределения С-бэндов на хромосомах A. fistulosum [13] выявил совпадение стабильных сайтов метилирования с сайтами С-бэндинга в дистальных регионах хромосом. Следует отметить, что на коротком плече хромосомы 8 также наблюдалось совпадение расположения интерстициальных редко метилированных участков с С-бэндами. Наши результаты согласуются с данными анализа хромосомного распределения сайтов метилирования на близкородственном виде A. cepa [6]. Авторами было показано, что сайты метилирования в основном совпадали с сайтами расположения гетерохроматина — С-бэндами. Исходя из наших данных и результатов исследований на A. cepa, мы можем предположить, что ДНК в С-бэндах, вероятнее всего, находится в метилированном состоянии. Однако, в аналогичных исследованиях на Zingeria biebersteiniana было отмечено, что не всегда высоко метилированные районы совпадали с локализацией С-бендов [7]. Для большинства представителей семейства Poaceae, к которому принадлежит Zingeria biebersteiniana, характерна ярко выраженная картина С-бэндирования. В то время как у луковых картина С-бэндирования слабо выражена только дистальными С-бэндами почти на всех хромосомах и редкими минорными интеркалярными бэндами на некоторых хромосомах. Пока мы можем лишь предположить, что эволюция структурной организации хроматина у Poaceae и Al-leaceae шла по разному сценарию. Считают, что различия в организации хроматина являются отражением эпигенетических изменений, следствием которых может быть разная степень упаковки ДНК в структуре хромосом [12].
Сравнение распределения сайтов метилирования с полученными нами ранее результатамим in situ гибридизации ПЦР-продуктов с праймерами на субтеломерный гетерохроматиновый повтор у A. fistulosum [3] выявил ко-локализацию сайтов метилирования и тандемного сателлитного повтора 382 п.н.
Наши результаты показали различия в распределении сайтов метилирования у гомологичных хромосом, что проявлялось в присутствии четко выраженного сайта метилирования у одного гомолога и его полном отсутствии у другого. Такое же различие в распределении сайтов метилирования между гомологичными хромосомами наблюдали на Zingeria biebersteiniana [7]. Авторы объясняют этот феномен различием организации хроматина в соответствующих регионах, что может отражать различия в транскипционной активности гомологичных хромосом.
Дальнейшие наши исследования по физическому картированию генов и некодирующей ДНК на хромосомах луковых и степени их метилирования внесут больше
метилированные районы
ясности в понимание структурно-функциональной организации ДНК в хромосоме. Учитывая важную роль метилирования в стабилизации гибридов, данные исследования помогут в создании новых сортов культур с использованием межвидовой гибридизации.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России», Государственный контракт № П809. Авторы выражают благодарность выпускнице РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева А.Н. Марченко за помощь в подготовке работы.
Библиографический список
1. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика // Генетика, 2006. Т. 42. № 9. С. 1186-1199.
2. Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК у растений: механизмы и биологическая роль // Ин-т физиологии растений. М.: Наука, 2009.
3. Фесенко И.А., Хрусталева Л.И., Карлов Г.И. Изучение организации сателлитного повтора 378 п.н. в терминальном гетерохроматине Allium fistulosum // Генетика, 2002. Т. 38. № 7. С. 894-903.
4. Хемлебен В., Беридзе Т.Г., Бахман Л. Сателлитные ДНК. Успехи биологической химии, 2003. Т. 43. С. 267-306.
5. Andreucci A., Castiglione R.M., Tagliasachi A.M. RNA synthesis and immunogold localization of 5-methylcytosine rich regions in polytene chromosomes of Phaseolus coccineus embryo suspensor at two stages of embryogenesis // Cytobios., 1994. V. 78. P. 99-113.
6. Castiglione R.M., Giraldi E., Frediani M. The DNA Methylation of Allium cepa Metaphase Chromosmes // Biol. Zent. bl., 1995. V. 114. P. 52-66.
7. Cremonini R., Castiglione M.R., Grif V.G., Kotseruba V.V., Punina E.O., Rodionov A.V, Muravenko O.V., Popov K.V., Samatadze T.E., Zelenin A.V Chromosome banding and DNA methylation paterns, chromatin organization and nuclear DNA content in Zingeria biebersteiniana // Biologia Plantarum, 2003. V. 46. P. 543-550.
8. Doerfler W. DNA Methylation — a regulatory signal in eukaryotic gene expression // J. Gen. Virol, 1981. V. 57. P. 1-20.
9. Erlich M and Wang R.Y. 5-methylcytosine in eukaryotic DNA // Science 1981, V 212. P. 1350-1357.
10. Finnegan E.J., Genger R.K., Peacock W.J., Dennis E.S. DNA methylation in plants Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular // Biology, 1998. V. 49. P. 223-247.
11. Finnegan E.J., Peacock W.J., Dennis E.S. Reduced DNA methylation inArabidopsis thal-iana results in abnormal plant development // Proc. Natl. Acad. Sci., 1996. V. 93. P. 8449-8454.
12. Heslop-Harrison J.S. Comparative genome organization in plants: from sequence and markers to chromatin and chromosomes // Plant Cell., 2000. V 12. P. 617-635.
13. Irifune K., Hirai K., Zheng J., Tanaka R., Morikawa H. Nucleotide sequence of a highly repeated DNA sequence and its chromosomal localization in Allium fistulosum // Theor Appl Genet., 1995. V. 90. P. 312-316.
14. Law J.A., Jacobson S.E. Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals. Review // Nature genetics, 2010. V 11. P. 203-220.
15. Liu B., Wendel J.F. Epigenetic phenomena and the evolution of plant allopolyploids // Mol. Phylogenet. Evol, 2003. V. 29. P. 365-379.
16. Li X., Guo W., Wang B., Li X., Chen H., Wei L., Wang Y., Wei J., Hong H. Instability of chromosome number and DNA methylation variation induced by hybridization and amphidiploid formation between Raphanus sativus L. and Brassica albogabra Bailei // BMC Plant Biology, 2010. V 10. P. 207-220.
17. Madlung A. Genomic changes in synthetic Arabidopsis polyploids // Plant J., 2005. Vol. 41. P. 221-230.
18. Montenero L.M., Filipski P.J., Gil J., Capel J.M., Martinez-Zapater, Salinas J. The distribution of 5-methylcytosine in the nuclear genome of plants // Nucl. Acid Res, 1992. V. 20. P. 3207-3210.
19. Miller O.J., Schnedl W., Allen J.B. Erlanger 5-methyl cytosine localised in mammalian constitutive heterochromatin // Nature, 1974. Vol. 251. P. 636-637.
20. Nick H., Bowen B., Ferl R.J., Gibert W. Detection of cytosine methylation in the maize alcohol dehydrogenase gene by genomic sequencing // Nature, 1986. V 319. P. 243-246.
21. Pijnacker L.P., Ferwerda M.A. Giemsa C-banding of potato chromosomes // Can J. Genet Cytol., 1984. V. 26. P. 415-419.
22. Reeves A., Tear J. Mlirromasure for Windows, Version 3.2. 1999. Free program distributed by the authors at www/colostate /edu/depts/biology/ micromeasure.
23. Schnedl W., Erlanger B.F. Miller O.J. 5-methylcytosine in heterochromatic regions of chromosomes in Bovidae // Hum. Genet., 1976. V. 31. P. 21-26.
24. Shapiro S., Chargaff E. Studies on the nucleotide arrangement in DNA. IV. Patterns of nucleotide sequence in the DNA of rye germ and its fractions // Biochimiea et Biophysica Acta, 1960. V 39. P. 68-82.
25. SpenaA., ViottiA., Pirrotta V Two adjacent genomic zein sequences: Structure, organization and tissue-specific restriction pattern // J. Mol Biol., 1983. Vol. 169. P. 799-811.
26. Vanyushin B.F., Belozersky A.N., Kokurina N.A., Kadirova D.X. 5-methylcytosine and
6-methylaminopurine in bacterial DNA // Nature, London, 1968. Vol. 218. P. 1066-1067.
27. Vanyushin B.F., Tkacheva S.G., Belozersky A.N. Rare bases in animal DNA // Nature. London, 1970. Vol. 225. P. 948-949.
Рецензент — д. б. н. А. А. Соловьев
SUMMARY
Having used antibodies against 5-mehyl cytosine, DNA methylation patterns of chromosomes 6 and 8 in Allium fistulosum L. have been studied. It has been established that constant highly methylated regions occur on distal regions of these chromosomes. Differences between homologous chromosomes have been revealed. Major correspondence is shown for chromosomal localization of constantly methylated sites, subtelomeric satellite DNA repeats and C-bands besides.
Key words: methylation, chromosome, Allium fistulosum.
Будылин Михаил Вячеславович — аспирант Центра молекулярной биотехнологии. Тел. (499) 977-70-01.
Сахарова Анна Николаевна — к. б. н.
Андреева Галина Николаевна — к. б. н.
Хрусталева Людмила Ивановна — д. б. н. Эл. почта: [email protected]
