CC BY
20
УДК:616.36-008.64:613.63:612.017.1
АНАЛИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ИММУНОГЕНЕЗА ПРИ АЛЛО-И КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ
М.Д. УРАЗМЕТОВА, Ф.А. ХАДЖИБАЕВ, А.Г. МИРЗАКУЛОВ
Республиканский научный центр экстренной медицинской помощи
Цель. Изучение основных иммунологических показателей при трансплантации эмбриональных гепатоцитов (ЭГ) крыс и человека при лечении острой печеночной недостаточности (ОПН) в эксперименте.
Материал и методы. Модель ОПН воспроизводилась на 70 белых крысах-самцов массой около 200 г. путем введения СС14. ЭГ получали из печени эмбрионов крыс и эмбрионов человека, полученных в результате абортов, выполненных по медицинским показаниям. Животные были разделены на 4 группы: 1-я группа - контрольная - 10 здоровых крыс; 2-я группа - 20 крыс с моделью ОПН, индуцированной CCI4; 3-я группа - 20 крыс с моделью ОПН, которым проводилась трансплантация аллогенных ЭГ (гепатоциты крыс); 4-я группа - 20 крыс с моделью ОПН, которым проводилась трансплантация ксеногенных ЭГ (гепатоциты человека).
Результаты. У крыс с ОПН, наряду с достоверным снижением общего количества Т-лимфоцитов (СР3+клеток), наблюдалось снижение Т-хелперов/индукторов (CD4+) и тенденция к снижению содержания Т-супрессоров/цитотокси-ческих лимфоцитов (CD8+), отмечалось также увеличение количества натуральных киллеров (CD16+). Со стороны неспецифического фактора защиты было выявлено резкое снижение активности нейтрофилов и повышение в 3,3 раза уровня ЦИК. Трансплантация ЭГ вызывала изменение иммунологических показателей с тенденцией к нормализации, что коррелировало с улучшением общего состояния животных.
Заключение. Трансплантация ЭГ оказывает иммунокорригирующее действие при ОПН, что определяет возможность использования алло- и ксеногенных ЭГ в качестве донорского материала при ОПН.
Ключевые слова: острая печеночная недостаточность, моделирование, иммуногенез, лечение, трансплантация эмбриональных гепатоцитов.
ANALYSIS OF IMMUNOGENESIS INDICATORS IN ALLO- AND XENOTRANSPLANTATION OF EMBRYONIC HEPATOCYTES
M.D. URAZMETOVA, F.A. KHADJIBAEV, A.G. MIRZAKULOV Republican Research Centre of Emergency Medicine
Aim: The study of the main immunological parameters in the transplantation of embryonic hepatocytes (EH) in rats and humans in the treatment of acute hepatic failure (AHF) in the experiment.
Materials and methods: The AHF model was reproduced on 70 white male rats weighing about 200 g by the administration of CCl4. EH was obtained from the liver embryos of rats and human embryos, obtained as a result of abortions performed on medical indications. Animals were divided into 4 groups: 1st group - control group - 10 healthy rats; 2nd group - 20 rats with a model of AHF induced by CCl4; 3rd group - 20 rats with a model of AHF who underwent transplantation of allogeneic EH (hepatocytes of rats); 4th group - 20 rats with a model of AHF, who underwent transplantation of xenogeneic EH (human hepatocytes).
Results: In rats with AHF, along with a significant decrease in the total number of T-lymphocytes (CD3+ cells), there was a decrease in T-helpers/inducers (CD4+) and a tendency to decrease T-suppressor / cytotoxic lymphocyte (CD8+) content, there was also an increase in the number of natural killers (CD16+). On the part of the nonspecific defense factor, a sharp decrease in neutrophil activity and a 3.3-fold increase in the level of the circulating immune complexes (CIC) were observed. EH transplantation caused a change in immunological parameters with a tendency toward normalization, which correlated with an improvement in the general condition of the animals. Conclusion: EH transplantation has an immunocorrective effect in AHF, which determines the possibility of using allo- and xenogeneic EH as a donor material in AHF.
Keywords: acutehepaticfailure, experimental model, immunogenesis, treatment, transplantation of embryonic hepatocytes.
Лечение заболеваний печени - актуальная проблема современной медицины. Несмотря на достижения в этой области, использование стандартных терапевтических подходов при хронических и острых заболеваниях печени оказывается недостаточным, смертность сохраняется на уровне 80-90%. Основным способом лечения тяжелых заболеваний печени остается пересадка органа
или его части. В связи с нехваткой донорского материала разрабатываются методики заместительной клеточной терапии заболеваний печени. Большое количество данных, накопленных за последние годы, показывает, что клеточную терапию можно рассматривать как одно из приоритетных направлений современной биомедицины и биотехнологии [2].
Клеточная терапия имеет ряд существенных преимуществ: во-первых, трансплантация клеток, в отличие от сложных хирургических операций, технически гораздо проще, менее инвазивна, не несет рисков отторжения и других осложнений. Во-вторых, донорский материал для клеточной терапии доступнее, может быть заготовлен заранее и подвергнут длительному криохранению. В-третьих, клеточная трансплантация не только компенсирует дисфункцию органа и способствует восстановлению функционирования собственных клеток больного, но и препятствует возникновению фиброза поврежденных тканей, восполняя утраченную клеточную нишу [1].
Следовательно, рациональным подходом к восстановлению печени может стать вторичное заселение печеночной ткани здоровыми клетками. Поэтому одним из подходов к решению этой проблемы на современном этапе является использование клеточных технологий, в частности трансплантация эмбриональных гепатоцитов (ЭГ) [3]. Однако из-за дефицита донорского материала необходимо изыскание различных видов клеточного аналога, являющегося наиболее эффективным и доступным для пациента [4,5].
Цель. Изучение основных иммунологических показателей при трансплантации ЭГ крыс и человека при лечении острой печеночной недостаточности (ОПН) в эксперименте.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В эксперименте использовано 70 белых крыс-самцов массой около 200 г. Модель ОПН воспроизводилась путем однократного введения крысам разведенного в масле СС14 в объемном соотношении 1:1. Для получения ЭГ использовали печень эмбрионов крыс и эмбрионов человека, полученных в результате абортов, выполненных по медицинским показаниям, которые выделяли модифицированным способом. Определяли следующие показатели иммунограммы: лимфоцитарный профиль ^D3, CD4, CD8, CD16), фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН), содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Для определения разных популяций и субпопуляций лимфоцитов крови используется реакция иммунофлуоресценции. ФАН определяли путем инкубации 50 мкл смеси лейкоцитов и латексных частиц в термостате при температуре 37оС в течение 30 минут. При определении уровня ЦИК в сыворотке крови применяли метод, основанный на нефелометрии раз-
личной растворимости мономеров иммуноглобулинов в составе иммунных комплексов при наличии в среде по-лиэтиленгликоля.
Животные были разделены на следующие группы: 1-я группа - контрольная - 10 здоровых крыс; 2-я группа - 20 крыс с моделью ОПН, индуцированной СС14; 3-я группа - 20 крыс с моделью ОПН, которым проводилась трансплантация аллогенных эмбриональных гепатоцитов (гепатоциты крыс); 4-я группа - 20 крыс с моделью ОПН, которым проводилась трансплантация ксеноген-ных эмбриональных гепатоцитов (гепатоциты человека).
Статистическую обработку результатов исследования проводили на основе методов вариационной статистики с применением параметрического критерия Стью-дента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изучение показателей иммунограммы на экспериментальной модели острой печеночной недостаточности показало, что на фоне токсического влияния СС14 отмечается подавление общего пула Т-лимфоцитов, которое остается сниженным в течение всего эксперимента.
Следует отметить, что наименьшая концентрация СЭ3-лимфоцитов зарегистрирована в 1-е сутки эксперимента, когда она была снижена на 33,4%. На 7-е сутки эксперимента уровень данного пула лимфоцитов был в 1,3 раза ниже исходного.
Т-хелперы относятся к регуляторным клеткам. Без них невозможна трансформация В-лимфоцитов в плазматические клетки, образующие антитела. Они также способны усиливать клеточные реакции иммунной системы. СЭ4+Т-лимфоциты (хелперы) на фоне токсического влияния четыреххлористого углерода также имели тенденцию к подавлению концентрации, что говорит об усугублении иммунологической защиты организма (рис. 1). Здесь также прослеживается аналогичная зависимость, когда в 1-е сутки эксперимента уровень хелперов снизился на 36,9%, а на 7-е сутки был в 1,3 раза ниже контроля.
Содержание СЭ8+Т-лимфоцитов (супрессоров), хоть и в меньшей степени, но также было подавлено на модели ОПН токсического генеза. При этом концентрация натуральных киллеров имела тенденцию к повышению, что говорит о выраженности у данной группы животных явлений иммунологического воспаления (рис. 2).
Рис. 1. Содержание CD3- и Сй4-лимфоцитов на фоне токсического действия СС14.
Рис. 2. Содержание CD8- и Сй16-лимфоцитов на фоне токсического действия СС1
В 1-е сутки эксперимента уровень СР8-лимфоцитов был снижен на 12,4%, а на 7-е сутки их концентрация была в 1,1 раза ниже контроля. Обратная зависимость прослеживалась в отношении натуральных киллеров. Так, в 1-е сутки эксперимента отмечается максимальный подъём их концентрации в 1,6 раза по сравнению с исходной. В течение первой недели эксперимента уровень натуральных киллеров оставался выше контрольных значений на 20,9%. Это обстоятельство позволяет заключить, что при токсическом поражении печени развивается каскад реакций, которые становятся причиной развития иммунологического воспаления, в динамике поддерживаемое вновь образующимися
токсическими агентами и не имеющее тенденции к самостоятельному восстановлению.
Одним из важных аспектов неспецифического клеточного иммунитета является фагоцитоз. Для поддержания гомеостаза при компенсированном течении патологического процесса нейтрофилы захватывают токсические агенты и устраняют их негативное действие путем фагоцитоза. В связи с этим фагоцитарная активность нейтрофилов играет важную роль в процессах иммунитета. Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов показало, что при введении четыреххло-ристого углерода отмечается подавление фагоцитоза (рис. 3).
Рис. 3. ПоказательФАН на фоне токсического действия СС1
Контроль
Рис. 4. Содержание ЦИК на фоне токсического действия СС!..
Наши исследования показали, что процентное содержание фагоцитарной активности нейтрофилов в крови интактных крыс в среднем составило 52,3±1,9%, с размахом индивидуальных значений от 45 до 56%. В кровотоке больных крыс этот показатель в 1-й день эксперимента достоверно снижался в среднем до 40,5±2,4%, что на 11,8% ниже контроля (р<0,01). 5-й и 7-й дни эксперимента характеризуются дальнейшим достоверным снижением фагоцитарной активности- 37,6±2,1 и 35,2±1,8% (р<0,01)
Циркулирующие иммунные комплексы являются показателем выраженности иммунологического воспаления. Отмечено, что при формировании острой печеночной недостаточности наблюдается достоверное повышение концентрации ЦИК в крови (рис. 4).
При изучении состояния иммунной системы крыс с печеночной недостаточностью под воздействием CCI4 было установлено, что в 1-й день в периферической крови больных крыс относительное содержание ЦИК увеличилось в среднем до 56,3±1,9%, что в 1,9 раза превышало контрольные значения (28,5±1,8%)(р<0,01). На 7-е сутки эксперимента уровень ЦИК был повышен в 3,3 раза, что говорит об усугублении течения патологического процесса и выраженности иммунологического воспаления.
Следующим этапом нашей работы явилось изучение влияния трансплантации аллогенных и ксеногенных эмбриональных гепатоцитов крыс экспериментальным животным.
Так, абсолютное количество Т-лимфоцитов (Сй3+клеток) у животных контрольной группы при трансплантации аллогенных эмбриональных гепатоцитов на 7-е сутки эксперимента было выше исходного значения на 93,2%. Эти изменения свидетельствовали о положи-
тельном влиянии трансплантации эмбриональных ге-патоцитов на фоне ОПН с тенденцией к нормализации. При трансплантации ксеногенных гепатоцитов человека видимого улучшения подавленного уровня Сй3+клеток не зарегистрировано .
Содержание Сй4+Т-лимфоцитов (хелперов) на фоне токсического влияния четыреххлористого углерода также имело тенденцию к снижению, а при трансплантации эмбриональных гепатоцитов отмечалась положительная динамика, более выраженная в отношении аллогенных гепатоцитов (рис. 5). Однако в обоих случаях на 7-е сутки эксперимента этот показатель не достиг контрольного значения.
Изменения уровня Сй8+Т-лимфоцитов были выражены в меньшей степени, хотя и здесь стоит отметить, что влияние аллотрансплантации было более выраженным, чем ксенотрансплантации. Также показательна динамика концентрации натуральных киллеров, которая при токсическом влиянии CCI4 была патологически повышена. При трансплантации ксеногенных гепатоцитов отмечалось незначительное снижение (на 7,7%) данного показателя. При аллотрансплантации уровень патологически повышенных натуральных киллеров снижался на 27,7% (рис. 6).
Повышение ФАН до нормальных пределов со снижением количества натуральных киллеров с нормализацией абсолютного количества лимфоцитов также отражали положительную динамику иммунного статуса. При этом отмечалось незначительное изменение процесса апоптоза.
Так, если у животных с ОПН уровень ФАН был ниже контроля в 1,4 раза, то у крыс с ксенотрансплантацией отмечалось постепенное восстановление активности фагоцитоза, при этом уровень ФАН соответствует 81,6%
Рис. 5. Содержание СЭЭ- и СЭ4-лимфоцитов на 7-е сут на фоне токсического влияния СС14 и лечения трансплантацией ЭГ.
I Контроль ОПН
аллотрансплантация ксенотрансплантация
Рис. 6. Содержание СЭЭ- и СЭ4-лимфоцитов на 7-е сут на фоне токсического влияния СС! и лечения трансплантацией ЭГ.
уровня контрольной группы. В группе с аллотрансплан-тацией наблюдалось не только полное восстановление фагоцитарной активности, но и некоторое повышение ее, что говорит о более выраженной защитной роли ал-лотрансплантации (рис. 7).
Анализ полученных данных показал, что трансплантация эмбриональных гепатоцитов крыс оказывала положительное влияние. Уровень ЦИК в 1-й день эксперимента снизился на 20%, на 5-й день - в 1,8 раза, а на 7-й день - в 2,7 раза (р<0,001, р<0,001, р<0,001). Следует
отметить, что при трансплантации эмбриональных гепатоцитов крыс результаты лучше, чем при трансплантации эмбриональных гепатоцитов человека.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, у крыс с экспериментальной печеночной недостаточностью, вызванной действием CCl4, при проведении иммунологических исследованиях обнаружены значительные изменения некоторых показателей иммунной системы. Наиболее выраженные изменения затрагивали содержание Т-лимфоцитов.
Рис. 7. Показатель ФАН на 7-е сут на фоне токсического влияния СС14 и лечения трансплантацией ЭГ.
Наряду с достоверным снижением общего количества Т-лимфоцитов (СР3+клеток) наблюдалось снижение Т-хелперов/индукторов (СР4+) и тенденция к снижению содержания Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов (СР8+), отмечалось также увеличение количества натуральных киллеров (СР16+). Со стороны неспецифического фактора защиты было выявлено резкое снижение активности нейтрофилов и повышение в 3,3 раза уровня ЦИК.
Трансплантация эмбриональных гепатоцитов на фоне индуцирования ОПН вызывала изменение иммунологических показателей с тенденцией к нормализации, что стало одной из главных причин стабилизации достигнутых результатов. В результате трансплантации эмбриональных гепатоцитов улучшение иммунного статуса коррелировало с общим состоянием животных. Результаты наших исследований совпадают с данными литературы, согласно которым при воздействии четы-реххлористого углерода формируется ОПН с развитием вторичного иммунодефицита, который влияет и на клеточное, и на гуморальное звено. Следствием развития и усугубления иммунологического воспаления становится резкое возрастание в крови уровня ЦИК и провоспа-лительных цитокинов, подавление ФАН и противовоспалительных цитокинов. Все эти нарушения на фоне
применения клеточных технологий постепенно стабилизируются с тенденцией к восстановлению.
Положительные иммунологические сдвиги свидетельствуют о том, что трансплантация эмбриональных гепатоцитов оказывает иммунокорригирующее действие при ОПН. Все вышесказанное определяет возможность использования алло- и ксеногенных ЭГ в качестве донорского материала при ОПН.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сухих Г.Т., Штиль A.A. Трансплантация эмбриональных гепатоцитов: экспериментальное обоснование нового подхода к лечению недостаточности печени. Бюл экспер биол и медицины 2002; 134 (12): 604-610.
2. Урываева И.В. Стволовые клетки в регенерации печени. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. М Медицина 2009; 2: 456.
3. Conigliaro A., Brenner D.A., Kisseleva T. Stem Cells and Cloning. AdvAppl 2010; 3: 39-47.
4. Kainath P.S., Kim W.R. Advanced liver disease study group. The model for end-stage liver disease (MELD). Hepatology 2007; 45: 797-805.
5. Michalopoulos G.K., Barua L., Bowen W.C. Hepatology 2005; 41 (3): 535-44.
ЭМБРИОНАЛ ГЕПАТОЦИТЛАРНИНГ АЛЛО- ВА КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИЯСИДА ИММУНОГЕНЕЗ КУРСАТКИЧЛАРИНИНГ ТАХ.ЛИЛИ
М.Д.Уразметова,Ф.А.Хаджибаев,А.Г.Мирзакулов
Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази
Ма°сад. Экспериментда уткир жигар етишмовчилиги (УЖЕ)ни даволашда каламуш ва инсоннинг эмбрионал гепа-тоцитлар (ЭГ)ининг трансплантациясидаги асосий иммунологик курсаткичларни урганиш.
Материал ва услублар. УЖЕнинг модели вазни 200 г. атрофида булган 70 та о° эркак каламушларда СС14 юбо-риш йули билан *осил °илинган. ЭГлар каламуш ва инсон эмбрионларидан тиббий курсатмалар буйича бажарилган
аборт ва°тида олинган. Жониволарни 4 гуру^га булдик: 1-гуру* - назорат - 10 та сорлом каламушлар; 2-гуру* - СС14 ёрдамида ча°ирилган УЖЕ модели булган 20 та каламушлар; 3-гуру* - УЖЕ булган 20 та жониворлар булиб, уларга каламушлардан олинган ЭГ аллоген трансплантацияси бажарилган; 4-гуру* - УЖЕ булган 20 та жониворлар булиб, уларга ксеноген ЭГлар трансплантацияси (инсон гепатоцитлари) утказилган.
Натижалар. УЖЕ булган каламушларда Т-лимфоцит (СО3 + хужайра)ларнинг умумий микдори камайиши билан бир °аторда Т-хелпер/индуктор (С04+)лар камайиши ва Т-супрессор/цитотоксик лимфоцит (С08+)ларнинг камайи-шига мойиллик кузатилди, шунингдек табиий киллер (С016+)ларнинг ми°дори ортиши °айд °илинди. Носпецифик *имоя омиллари томонидан нейтрофиллар фаоллигининг кескин сусайиши ва ЦИК даражасининг 3,3 баробар ортиши ани°ланди. ЭГ трансплантацияси иммунологик курсаткичларнинг меъёрга я°инлашувини ча°ириб, бу узгаришлар жониворлар умумий а^волининг яхшиланиши билан кечган.
Хулоса. ЭГ трансплантацияси УЖЕда иммунокоррекцияловчи таъсир курсатиб, алло- ва ксеноген ЭГни УЖЕда донор материал сифатида °уллаш имконини белгилайди.
Калит сузлар: уткир жигар етишмовчилиги, моделлаштириш, иммуногенез, даволаш, эмбрионал гепатоцит-ларнинг трансплантацияси.
Контакт: Мирзакулов Акмал Гафуржанович, врач-хирург отдела экстренной хирургии РНЦЭМП. 100115, Ташкент, ул. Кичик халка йули, 2. Тел.: +99894-6398024. [email protected]
