Анализ морфологических изменений костной ткани височной кости при воздействии микроволнового излучения с использованием различных декальцинаторов Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК: 616.284-002.1-018.4-076

АНАЛИЗ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ КОСТНОЙ ТКАНИ ВИСОЧНОЙ КОСТИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ МИКРОВОЛНОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ДЕКАЛЬЦИНАТОРОВ

Зубарев И. В. 1, Тюхай М. В. 2, Маркелов А. В. 3, Коркмазов М. Ю. 4, Дубинец И. Д. 4

1 Уральский федеральный университет, научно-исследовательский институт физики и прикладной математики, уральский центр коллективного пользования «Современные нанотехнологии», 620026, Куйбышева, 48, Екатеринбург, Россия

2 Лаборатория электронной микроскопии Челябинского областного патологоанатомического бюро, 454000, Татищева 249/3, Челябинск, Россия

3Патологоанатомическое бюро ГБ №1 Копейского ГО, 456600, Братьев Гожевых, 5а, Копейск, Россия 4 ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России, 454000, Воровского 70, Челябинск, Россия

Для корреспонденции: Дубинец Ирина Дмитриевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры отоларингологии ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России, E-mail: [email protected]

For correspondence: Irina D. Dubinets, Cand. Med. Sci., associate professor of the Department of Otolaryngology, Federal State Educational Establishment of Health Care in the South Federal Medical University of the Ministry of Health of Russia, E-mail: 89124728166@ mail.ru

Information about authors:

Zubarev I. V., http://orcid.org/0000-0002-7827-498X Tyukhay M. V., http://orcid.org/0000-0001-7127-3936 Markelov A. V., http://orcid.org/0000-0001-9679-9694 Korkmazov M. Yu., http://orcid.org/0000-0002-8642-0166 Dubinets I. D., http://orcid.org/0000-0002-7085-113X

РЕЗЮМЕ

При хронических гнойных средних отитах в воспалительный процесс вовлекается не только слизистая оболочка среднего уха, но и костная ткань височной кости, подвергаясь частичной деструкции, фиброзированию или окостенению. При работе с материалом важно сохранить морфологическую и биохимическую картину препарата. Патоморфологическое исследование костной ткани затрудняет содержащееся в ней большое количество минеральных веществ. Наиболее часто применяются кислотные декальцинаторы, вызывая значительные повреждения структур костной ткани, не подлежащие дальнейшей оценке. Бескислотные декальцинаторы имеют длительную процедуру декальцинации. Описан метод микроволновой декальцинации костной ткани в гистопроцессоре. В настоящее время не существует единого мнения о наиболее эффективном режиме декальцинации и остается актуальной проблема выбора декальцинирующего агента для наиболее эффективной и в то же время бережной декальцинации костных образцов. Цель исследования - анализ морфологических изменений костной ткани височной кости при традиционном методе декальцинации и под действием микроволнового излучения с использованием различных декальцинаторов. На основании микрооценки методами световой микроскопии костных фрагментов, полученных при реконструктивно-санирующих операциях у пациентов с хроническим средним отитом изучены особенности состояния структур костной ткани височной кости при воздействии микроволнового излучения с использованием различных декальцинаторов. Для оценки эффективности и качества декальцинации костной ткани на светооптическом уровне авторами предложены критерии оценки степени деструкуции и ремоделирования структурных элементов костной ткани височной кости при хроническом среднем отите.

Ключевые слова: костная ткань, реконструктивно-санирующая отохирургия, хронический средний отит, декальцинаторы, трансмиссионная электронная микроскопия

THE ANALYSIS OF THE MORPHOLOGICAL CHANGES OF BONE TISSUE OF THE TEMPORAL BONE UNDER MICROWAVE RADIATION USING VARIOUS DEKALCINER

Zubarev I. V.1, Tyukhay M. V.2, Markelov A. V.3, Korkmazov M. Yu., Dubinets I. D.4

1 Ural Federal University, Research Institute of Physics and Applied Mathematics, Ural Center for Collective Use "Modern Nanotechnologies" (Prof. Shur V. Ya.), 620026, Kuibyshev 48, Yekaterinburg, Russia

2 Laboratory of Electron Microscopy of the Chelyabinsk Regional Pathoanatomical Bureau (chief: G.V. Sychugov), 454000, Tatishcheva 249/3, Chelyabinsk, Russia

3The Pathological Bureau of GB No. 1 of Kopeysky GO (chief: Markelov), 456600, Gozhevyh brothers 5а, Kopeisk, Russia

4 FGBOU in the South Federal Medical University of the Ministry of Health of Russia, 454000, Vorovsky 70, Chelyabinsk, Russia

SUMMARY

In chronic purulent otitis media, not only the mucosa of the middle ear but also the bone tissue of the temporal bone is involved in the inflammatory process, undergoing partial destruction, fibrosis or ossification. When working with the material it is important to preserve the morphological and biochemical picture of the preparation. Pathomorphological examination of bone tissue makes it difficult to contain a large number of minerals. The most commonly used are acid decalcinators, causing significant damage to the structures of bone tissue, which can not be further evaluated. Acidless decalcinators have a long decalcification procedure. A method of microwave decalcification of bone tissue in a histoprocessor is described. At present, there is no consensus on the most effective decalcification regime, and the problem of decalcifying agent selection for the most effective and at the same time gentle decalcification of bone samples remains urgent. The aim of the study was to analyze the morphological changes in the bone tissue of the temporal bone with the traditional method of decalcification and under the action of microwave radiation using various decalcinators. Based on the micro-evaluation, light microscopy of bone fragments obtained during reconstructive-sanitizing operations in patients with chronic otitis media was used to study the features of the state of bone tissue structures in the temporal bone under the influence of microwave radiation using various decalcinators. To assess the effectiveness and quality of decalcification of bone tissue at the light-optical level, the authors proposed criteria for assessing the degree of destruction and remodeling of structural elements of the bone tissue of the temporal bone in chronic otitis media.

Key words: bone, reconstructive and sanitize otohirurgiya, chronic otitis media, decalcinatory, transmission electron microscopy

В гистологической и патологоанатомической работе поступает материал после реконструктив-но-санирующих вмешательств при хроническом гнойном среднем отите, содержащий костную ткань. К интраоперационному материалу можно отнести костную ткань барабанной полости и сосцевидного отростка [1, 2, 3] у 12 пациентов с хроническим гнойным средним отитом Челябинской области. Кости по строению губчатые и компактные, подвергшейся деструкции и/или фиброзиро-ванию и окостенению вследствие хронического воспаления. При работе с таким материалом очень важно сохранить морфологическую и биохимическую картину препарата, получить качественные срезы с сохранными тинкториальными свойствами. Исследование костной ткани затрудняет содержащееся в ней большое количество минеральных веществ. Существует много методов удаления солей Са2+ из костной ткани. Наиболее часто применяется кислотная декальцинация слабыми органическими и неорганическими кислотами, такими как муравьиная, уксусная, серная, соляная, азотная и их смесями в различных пропорциях. Так же применяется бескислотная декальцинация солями этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Показано, что при использовании кислотных декаль-цинаторов сокращается время декальцинации, но при этом наблюдаются сильные повреждения структур костной ткани. В свою очередь бескислотные декальцинаторы имеют длительное время декальцинации, но на хорошем уровне сохраняют морфологию и тинкториальные свойства ткани.

Кроме этого существует метод декальцинации костной ткани под действием микроволнового излучения в гистопроцессоре. Микроволновая декальцинация является новой техникой по сравнению с традиционным способом, и было показано ускорение процесса декальцинации от нескольких дней до нескольких часов, где твердые ткани по-

мещают в декальцинирующий агент в микроволновую печь и регулярно меняют раствор до достижения конечной точки [4].

В настоящее время не существует единого мнения о более эффективном декальцинирующем агенте и режиме декальцинации. Из этого формируется основная проблема выбора декальцинирую-щего агента для более эффективной и в то же время бережной декальцинации костных образцов.

Цель работы. Анализ морфологических изменений костной ткани височной кости при традиционном методе декальцинации и под действием микроволнового излучения с использованием различных декальцинаторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа проводилась на костных фрагментов, полученных при реконструктивно-санирующих операциях у пациентов с хроническим средним отитом. Материал фиксировался в 10% забуферен-ном формалине 72 часа. На каждый декальцина-тор было вырезано по 8 фрагментов компактной и губчатой костной ткани. Степень декальцинации оценивалась гравиметрическим и механическим методами [5].

Для сравнения были выбраны следующие де-кальцинаторы [4, 6]:

1. Смесь муравьиной и соляной кислот Кал-лиса-Стерчи (К.-С.). Пропись декальцинатора: концентрированная HCl (концентрация 36%-ая, уд. вес 1,180) - 40 мл, концентрированная муравьиная кислота (90%-ая) - 40 мл, дистиллированная вода - 920 мл;

2. 5%-ая муравьиная кислота, 1 Н раствор (5% МК). Пропись декальцинатора: концентрированная муравьиная кислота (90-92%) - 50 мл, дистиллированная вода - 950 мл;

3. Динатриевая соль этилендиаминтетраук-сусной кислоты (ЭДТА). Пропись декальцинатора:

трилон Б - 250 гр, дистиллированная вода - 1750 мл, гидроксида натрия - 25 гр до достижения раствором pH 7,0 - 7,4;

4. 5%-ая азотная кислота (5% АК). Пропись декальцинатора: концентрированная азотная кислота (70%) - 50 мл, дистиллированная вода - 950 мл;

5. Смесь муравьиной и соляной кислот Рих-мана-Гельфанда-Хилла (Р.-Г.-Х.). Пропись декаль-цинатора: концентрированная муравьиная кислота (90-92%) - 100 мл, концентрированная соляная кислота (концентрация 36%-ая, уд. вес 1,180) - 80 мл, дистиллированная вода - 820 мл.

Помимо традиционной декальцинации в работе был использован аппарат для ускоренной декальцинации материала под действием микроволнового излучения "HISTOS REM" (производитель Milestone, Италия, Rapid microwave histoprocessor) при температуре 37о и частоте 50 Hz.

После декальцинации осуществляли стандартную проводку материала для его обезвоживания и уплотнения. Парафиновые блоки резались, срезы окрашивались по Фёльгену и гематоксилином-эозином. Материал для электронной микроскопии после декальцинации фиксировали в 2% пара-формальдегиде и 2,5% глутаральдегиде на какоди-латном буфере (по Карновскому) с 5% сахарозой, затем дофиксировали в 2% тетраоксиде осмия, контрастировали ацетатом урана «в блоке» и заливали в смолу. Полутонкие срезы толщиной 900 нм с эпоксидных блоков окрашивали толуидиновым синим с добавлением 1% буры и просматривали в световом микроскопе. Ультратонкие срезы толщиной 60 нм контрастировали по методу Рейнольдса уранилацетатом и цитратом свинца. Сетки изучали в трансмиссионном электронном микроскопе Libra-120 («Carl Zeiss & MT», Германия) с цифровой SSCCD камерой UltraScan 950 (4 мпикс.) в диапазоне увеличения 1200-20000.

Для оценки эффективности и качества декальцинации костной ткани височной кости на свето-оптическом уровне нами были выделены следующие критерии: выраженность спайной линии, выраженность Гаверсова канала, четкость концентрических пластинок, четкость вставочных пластинок, изменение тинкториальных свойств ядра и отростков остеоцитов и время декальцинации. При электронно-микроскопическом исследовании костной ткани нами были оценены следующие критерии: целостность плазмалеммы остеоцитов, степень вакуолизации цитоплазмы, целостность мембранных органелл, степень конденсации и деструкции хроматина, целостность стенок лакун, сохранность отростков и каналов, в которых проходят отростки, исчерченность коллагеновых фибрилл. Выраженность каждого критерия оценивалась в баллах: при отсутствии выраженности критерия - 0 баллов, слабая выраженность - 1 балл, при хорошей выра-

женности критерия - 2 балла. Затем баллы суммировались и находилось наибольшее значение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В первой серии исследования нами была поставлена задача оценить влияние различных де-кальцинаторов на сохранность костной ткани височной кости при традиционном способе проводки материала. Нами показана следующая картина (табл.1, рис.1, рис. 2).

При световой микроскопии спайная линия нечётко или зонально выражена после декальцинато-ров К.-С., Р.-Г.-Х и в 5% АК, тогда как материал из других декальцинаторов имеет чётко выраженную базофильно окрашенную спайную линию. Концентрические пластинки оказались чётко выражены только после декальцинации в 5% МК и ЭДТА. После декальцинации в декальцинаторе С.-8. вставочные пластинки становятся не чёткими. Остальные декальцинаторы показывают чётко выраженные вставочные пластинки. Одним из критериев сохранности сосудов в костной ткани является состояние Гаверсова канала. При декальцинации кости декальцинатором К.-С. отмечается потеря чёткости контура канала, просвет слабо базофильный. Напротив, все остальные декальцинаторы не затрагивают морфологию и тинкториальные свойства Гаверсова канала, он имеет чёткий контур, во всех них хорошо выраженная базофилия.

В губчатой части костной ткани сосцевидного отростка отмечается сохранение целостности плазмалеммы остеоцитов при декальцинации во всех декальцинаторах. При этом, при декальцинации в ЭДТА цитоплазма не вакуолизируется, в то время как в других декальцинаторах цитоплазма частично вакуолизирована. Мембранные органел-лы остаются интактными при декальцинации в 5% МК и ЭДТА.

Для оценки сохранности структуры ДНК на светооптическом уровне мы использовали метод окраски по Фельгену. Результат на всех декальци-наторах оказался положительный, ядра окрасились в красный цвет. Также, сохранность ядра может быть оценена по степени конденсации хроматина и выявлению гетеро- и эухроматина. Нами показано, что 5% -АК и Р.-Г.-Х. дают лучшие результаты, сохраняют морфологию ядра и не вызывают конденсацию и разрушение хроматина. При декальцинации К.-С. отмечается светлый, неструктурированный хроматин без чёткой дифференциации на эу- и гетерохроматин, в 5% МК ядра подвергаются конденсации. При декальцинации в ЭДТА хроматин включает участки гетеро- и эухроматина, однако встречаются ядра с конденсированным хроматином.

Одним из показателей сохранности остеоци-тов является целостность их отростков в костных

ЩЩ Н ' < .

) -

Ц,3?ЕЬ

б

Рис. 1. Остеоциты в лакунах, увел. 4000 а) Фрагмент остеоцита. Мембранные органеллы разрушены,

целостность плазмалеммы сохранена, плотно прилегает к лакуне. В ядре обнаруживается слабо-дифференцированный хроматин. На периферии лакуны отмечаются тёмные гранулы. К.-С., губчатая ткань, традиционная проводка. б) Остеоцит в просвете лакуны. Видна чёткая граница лакуны, цитоплазма остеоцита вакуолизирована, большинство органелл разрушено. В ядре виден эу- и гетерох-роматин. Р.-Г.-Х., губчатая кость, традиционная декальцинация. в) Остеоцит в лакуне. Видна чёткая граница края лакуны, плазмалемма клетки сохранена, клетка сжимается, уплотняются цитоплазма и органеллы. В ядре виден эу- и гетерохроматин. 5% -АК, компактная кость, традиционная проводка. г) Мембранные органеллы частично разрушены, цитоплазма не вакуолизирована, в ядре чётко выявляется эу- и гетерохроматин, ЭДТА, губчатая кость, традиционная декальцинация.

Рис. 2. Состояние лакун, каналов, отростков остеоцитов и исчерченности коллагеновых фибрилл. а) Каналы отростка остеоцита. Чётко видна поверхность канала. ЭДТА, губчатая кость, традиционная декальцинация, увел. 6300. б) Нечёткая граница лакуны. Цитоплазма остеоцита отошла от края лакуны, видны расщеплённые коллагеновые протофибриллы и многочисленные плотные гранулы. К.-С., губчатая ткань, традиционная проводка, увел. 4000. в) Коллагеновые фибриллы с сохранённой исчерчен-ностью, хорошо видны светлые и тёмные полосы. К.-С., губчатая кость, традиционная декальцинация, увел. 10000. г) Лакуна. Видна чёткая граница края лакуны, плазмалемма клетки сохранена, цитоплазма слегка вакуолизирована. ЭДТА, компактная кость, традиционная проводка, увел. 4000. д) Исчезновение исчерченности коллагеновых фибрилл. Р.-Г.-Х., компактная кость, гистиопроцессор, увел. 4000. е) Чёткий контур лакуны, цитоплазма остеоцита частично разрушена. С^., компактная кость, гистиопро-

цессор, увел. 4000.

структуры кости нами была исследована целост-

каналах и целостность стенки костного канала. Нами показано, что отростки не сохраняются во всех декальцинаторах, тогда как контуры каналов чётко обнаруживаются только при декальцинации в ЭДТА и Р.-Г.-Х. Для оценки степени разрушения

ность лакун. При декальцинации К.-С. чёткой границы края лакуны нет. При декальцинации в Р.-Г.-Х., 5% МК и 5% -АК видны на периферии лакуны имеют чёткую, контурированную границу.

Как известно, исчерченность коллагеновых фи- которая опосредует чередование светлых и тёмных брилл определяется их молекулярной структурой, полос при контрастировании срезов.

Таблица 1

Сравнение сохранности структур костной ткани височной кости при влиянии различных

декальцинаторов

Каллиса-Стерчи 5% - муравьиная кислота ЭДТА. 5% -азотная кислота Смесь Рих-мана-Голь-дфельда-Хилла

Губчатая кость Т ГП Т ГП Т ГП Т ГП Т ГП

Целостность плазмалеммы 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1

Вакуализация цитоплазмы 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1

Сохранность мембранных 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1

органелл

Состояние хроматина 1 2 1 1 1 2 1 0 2 2

Сохранность границы лакуны 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1

Сохранность отростков, чёткость границы каналов 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2

Исчерченность коллагеновых 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1

фибрилл

Компактная кость Т ГП Т ГП Т ГП Т ГП Т ГП

Гистология

Выраженность спайной линии. 0 1 1 0 2 1 2 1 0 1

Выраженность Гаверсова канала. 0 2 2 2 2 2 2 2 2 1

Четкость концентрических пластинок. 0 1 2 0 2 2 0 2 0 2

Четкость вставочных пласти- 0 0 2 0 2 0 2 0 2 2

нок.

Сохранность ядра. 2 2 2 2 2 2 0 2 0 2

Отростки остеоцитов. 2 2 0 1 2 1 2 0 0 2

Реакция Фельгена. 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Компактная кость Т ГП Т ГП Т ГП Т ГП Т ГП

Электронная микроскопия

Целостность плазмалеммы 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1

Отсутствие вакуализации 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1

цитоплазмы

Сохранность мембранных 0 0 1 0 0 1 1 1 1

органелл

Состояние хроматина 1 0 0 0 1 1 2 0 1

Сохранность границы лакуны 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0

Сохранность отростков, 2 2 1 2 1 1 1 1 1 1

чёткость границы каналов

Исчерченность коллагеновых 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

фибрилл

Итог: 15 21 18 16 27 19 22 12 21 26

Примечание: Т- традиционная проводка, ГП — проводка в гистиопроцессоре.

Изменение тинкториальных свойств коллагена отражает изменение его химической структуры. Нами было показано, что при декальцинации в К.-С. коллагеновые фибриллы чётко видны. При декальцинации в ЭДТА и Р.-Г.-Х. исчерченность части коллагеновых фибрилл исчезает, другие де-кальцинаторы приводят к исчезновению исчерчен-ности всех коллагеновых фибрилл.

В отличие от губчатой костной ткани, компактная костная ткань aditus ad antrum требует более длительного периода декальцинации, в связи с этим и морфологические изменения на клеточном уровне могут быть иными. Целостность плазма-леммы остеоцитов сохранена при декальцинации в ЭДТА и частично сохранена при декальцинации в Р.-Г.-Х. и 5% -АК. Цитоплазма вакуолизирована и мембранные органеллы частично разрушены после 5% МК, ЭДТА и К.-С. При анализе сохранности ядра в остеоцитах компактной кости было показано, что при декальцинировании в Р.-Г.-Х., 5% -АК и ЭДТА в ядре сохраняется гетеро- и эухроматин. Отростки остеоцитов, проходящие в костных каналах, сохранились при декальцинации в К.-С., 5% -АК и 5% МК. Каналы с чёткими контурами обнаруживаются при декальцинации в К.-С., 5% -АК, 5% МК и Р.-Г.-Х. Стенка лакун в компактной кости оказалась разрушена при декальцинации 5%-АК, остальные декальцинаторы сохранили чёткую выраженную границу лакуны. Лучшая сохранность стенки лакуны обнаруживается в материале после декальцинации в ЭДТА. В компактной костной ткани после декальцинации в 5% МК отмечается сохранение тинкториальных свойств коллагена, в остальных декальцинаторах исчерченность колла-геновых фибрилл исчезает.

Во второй части исследования был использован аппарат для ускоренной декальцинации материала под действием микроволнового излучения HISTOS REM, (Milestone, Италия). Показано, что микроволновое излучение формирует неионизи-рующую радиацию, вызывающую изменяющееся электромагнитное поле, что приводит к вращению диполярных молекул, таких как вода, и полярных боковых цепей белков на 180° с частотой 2.45 миллиардов циклов в секунду. Движение молекул приводит к образованию потоков энергии и ускорению обмена реактивами в клетке [7]. В связи с этим была предложена идея использовать микроволны для уменьшения времени декальцинации костей [4, 7, 9,10 ]. Pitol D.L. и соавт. (2007) показали 30-кратное увеличение скорости декальцинации в 8,5% ЭДТА относительно традиционных методов под действием микроволнового излучения (с 45 дней до 48 часов) [5]. Sangeetha R. и соавт. показали, что воздействие микроволн ускоряет процесс декальцинации 14% раствором ЭДТА с 57 дней до 9 дней [10]. В то же время ком-

плексная морфологическая оценка сохранности костной ткани не производилась.

В результате декальцинации под действием микроволнового излучения нами была обнаружена следующая картина. В декальцинаторах К.-С. и 5% МК спайная линия губчатой костной ткани выражена слабо, во всех остальных она фрагментирована. Концентрические пластинки после гистиопроцессора не видны после декальцинации 5% МК и К.С., в остальных декальцина-торах отчетливо видны. В гистиопроцесоре все декальцинаторы, кроме смеси Р.-Е-Х., показали одинаково плохую выраженность вставочных пластинок. После использования смеси Р.-Г.-Х. Гаверсовы каналы имеют неоднородную окраску, просвет канала имеет нечёткую границу. Остальные декальцинаторы показали достаточно хорошую сохранность Гаверсова канала. Отмечается нарушение целостности плазмалеммы остеоцитов и вакуолизация цитоплазмы под действием 5% - АК, в то время как остальные декальцинаторы не нарушают целостность мембраны и не приводят к вакуолизации цитоплазмы. Мембранные органеллы сохраняются при декальцинации в К.-С. и Р.-Г.-Х., а в ЭДТА, 5% МК и 5% -АК наблюдается разрушение орга-нелл. После гистиопроцессора все ядра сохранили окраску по Фельгену. При оценке состояния хроматина было показано, что под влиянием 5% МК и 5% -АК происходит разрушение хроматина, хроматин светлый и неструктурированный, встречаются конденсированные ядра. Чётко выраженный хроматин обнаруживается при декальцинации в Р.-Г.-Х., ЭДТА и особенно в К.-С. Стенка лакун в губчатой кости оказалась разрушена при декальцинации 5% -АК, 5% МК и ЭДТА, остальные декальцинаторы сохранили чёткую выраженную границу лакуны (лучшая сохранность обнаруживается после декальцинации в К.-С). В губчатой костной ткани после декальцинации в 5% МК и Р.-Г.-Х. отмечается сохранение тинкториальных свойств коллагена, в остальных декальцинаторах исчерченность коллагеновых фибрилл исчезает. В компактной ткани целостность мембраны была сохранена после декальцинации в Р.-Г.-Х., цитоплазма не вакуолизирована после декальцинации в 5% -АК, ЭДТА и Р.-Г.-Х. Мембранные органеллы оказались сохранены после декальцинации в ЭДТА и Р.-Г.-Х. Хроматин структурирован в части ядер после декальцинации в ЭДТА и Р.-Г.-Х. Чёткая граница лакуны и контуры каналов обнаруживаются после декальцинации в К.-С. и 5% муравьиной кислоте. Отростки клеток сохранены после всех декальцинаторов. Исчерченность коллагеновых фибрилл сохранена после 5% муравьиной кислоты.

ОБСУЖДЕНИЕ

После декальцинации костей традиционным методом наилучшую сохранность структур клеток и межклеточного вещества показал реагент ЭДТА. Результаты, полученные при декальцинации в гистопроцессоре, оказались принципиально отличными от результатов традиционной проводки. После микроволновой декальцинации компактной костной ткани были показаны наиболее сильные нарушения структуры клеток и межклеточного вещества. ЭДТА и 5% МК показали самые плохие результаты сохранности тинкториальных свойств и морфологии. Ухудшение результатов при декальцинации в ЭДТА может быть связано с малой диффузионной способностью молекул ЭДТА и длительным воздействием микроволнового излучения, вследствие чего разрушается структура костной ткани. Лучшие результаты были показаны после декальцинации в смеси Р.-Г.-Х., что определяется быстрой скоростью декальцинации и сохранением основных морфологических структур.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, для ускоренной декальцинации костной ткани представляется оправданным использовать микроволновый гистопроцессор и смесь муравьиной и соляной кислот Рихмана-Гель-фанда-Хилла, а при необходимости максимально сохранить целостность, тинкториальные свойства и антигенные детерминанты ткани - использовать традиционную бескислотную декальцинацию солями этилендиаминтетрауксусной кислоты.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Крюков А. И., Гаров Е. В. О классификации операций при хроническом гнойном среднем отите. Российская оториноларингология. 2016; 3:181182.

2. Дубинец И. Д. Современные тенденции и возможности при хирургическом лечении хронического среднего отита. Российская оториноларингология. 2006;1:83-85.

3. Коркмазов М. Ю., Молдован И. И., Данилен-ко М. А., Устинов Н. А., Агапитова М. Е., Корнова Н. В., Кофанов Р. В., Казачков Е. Л., Коркмазов А. М., Павлов А. Б. Выкусыватель // Патент РФ на изобретение № 90317. Опубликовано 10.01.2010. Бюллетень № 1. http://www1.fips.ru/fips_servl/fips_servlet

4. Keithley E. M., Truong T., Chandranait B., Billings P.B. Using the microwave oven for decalcification of human temporal bones. Newsletter of the NIDCD National Temporal Bone, Hea Balance Pathol Res Registry. 2001. 1-5. doi: 10.1097/00005537200102000-00017

5. Pitol D. L., Caetano F. H., Lunardi L. O. Microwave induced fast decalcification of rat bone for electron microscopic analysis: An ultrastructural and cytochemical study. Braz Dent J. 2007. 18. 153-7. doi: 10.1590/S0103-64402007000200013

6. Callis G., Sterchi D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents. Methods, and Their Effects on Bone Histology. Journal of Histotechnology. 1998. 21(1). 49-58. doi: 10.1179/his.1998.21.1.49

7. Yuehuei H. A., Martin K. L. Handbook of histology methods for bone and cartilage. Totowa, New Jersy. 2003.

8. Mathai A. M., Naik R., Pai M.R., et al. Microwave histoprocessing versus conventional histoprocessing. Indian J. Pathol. Microbiol. 2008. 51(1). 12-6. doi: 10.4103/0377-4929.40383

9. Roncaroli F., Mussa B., Bussolati G. Microwave oven for improved tissue fixation and decalcification. Pathologica. 1991. P. 307-10. doi: 10.1111/j.0022-2720.2004.01382

10. Sangeetha R., Uma K., and Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J. Oral Maxillofac Pathol. 2013. 17(3). 386-391. doi: 10.4103/0973-029X.125204

REFERENCE

1. Kryukov A. I., Garov E. V. The classification of operations in chronic suppurative otitis media. Rossiiskaya otorinolaringologiya. 2016;3:181-182. (In Russ)

2. Dubinets I D Modern trends and opportunities in the surgical treatment of chronic otitis media // Ros. otorinolar. 2006. 1. S. 83-85. (In Russ)

3. Korkmazov M.Y., Moldovan I.I., Danilenko M.A., Ustinov N.A., Agapitova M.E., Kornova N.V., Kofanov R.V., Kazatchkov E.L., Korkmazov A.M., Pavlov A.B., Vykusyvatel RF patent for the invention № 90317. Published on 10.01.2010. Bulletin № 1

4. Keithley E. M., Truong T., Chandranait B., Billings P.B. Using the microwave oven for decalcification of human temporal bones. Newsletter of the NIDCD National Temporal Bone, Hea Balance Pathol Res Registry. 2001. 9. 1-5. doi: 10.1097/00005537200102000-00017

5. Pitol D. L., Caetano F. H., Lunardi L. O. Microwave induced fast decalcification of rat bone for electron microscopic analysis: An ultrastructural and cytochemical study. Braz Dent J. 2007. 18. 153-7. doi: 10.1590/S0103-64402007000200013

6. Callis G., Sterchi D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents. Methods, and Their Effects on Bone Histology. Journal of Histotechnology. 1998. 21(1). 49-58. doi: 10.1179/his.1998.21.1.49

7. Yuehuei H.A., Martin K.L. Handbook of histology methods for bone and cartilage. Totowa, New Jersy. 2003.

8. Mathai A.M., Naik R., Pai M.R., et al. Microwave histoprocessing versus conventional histoprocessing. Indian J. Pathol. Microbiol. 2008. 51(1). 12-16. doi: 10.4103/0377-4929.40383

9. Roncaroli F., Mussa B., Bussolati G. Microwave oven for improved tissue fixation and decalcification.

Pathologica. 1991. 83. 307-10. doi: 10.1111/j.0022-2720.2004.01382

10. Sangeetha R., Uma K., and Chandavarkar V. Comparison of routine decalcification methods with microwave decalcification of bone and teeth. J. Oral Maxillofac Pathol. 2013. 17(3). 386-391. doi: 10.4103/0973-029X.125204