CC BY
43
УДК: 574.594.32 Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2006, вып. 4
Е. В. Ганжа, А. И. Гранович, Ю. А. Петрова, Н. А. Михайлова
АНАЛИЗ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ СТРОЕНИЯ ПЕНИАЛЬНЫХ ЖЕЛЕЗ МОЛЛЮСКОВ РОДА LITTORINA СЕВЕРНОЙ АТЛАНТИКИ
Комплексы видов-двойников широко распространены в различных группах беспозвоночных. Характеризуясь значительной морфо-анатомической близостью, такие виды, тем не менее, остаются репродуктивно изолированными [2]. При сравнительном описании видов-двойников часто отмечают различия по строению половой системы и, в частности, копулятивных органов самцов [2, 4, 9].
Среди североатлантических моллюсков p. Littorina можно выделить два комплекса видов-двойников: 1) группа «saxatilis», которая включает в себя 3 вида литторин -Littorina saxatilis (Olivi, 1792), L. arcana Hannaford Ellis, 1978 и L. compressa Jeffreys, 1865; 2) группа «obtusata», состоящая из видов L. obtusata (Linnaeus, 1758) и L. fabalis Turton, 1825. Для разделения видов литторинид широко применяются морфо-анатомические критерии, основанные на внешних (форма и цвет раковины) и внутренних (строения половой системы) признаках моллюсков [1]. Так, по данным морфометрического анализа раковины, различаются L. obtusata и L. fabalis, хотя для группы видов «saxatilis» конхиологические признаки в значительной степени перекрываются. Пожалуй, лишь раковину L. compressa можно надежно идентифицировать, в то время как раковины L. saxatilis и L. arcana практически невозможно разделить по внешним признакам [1,6].
Большинство видов отличаются по строению половой системы [1], исключение составляют самцы L. saxatilis и L. arcana, видоспецифичные признаки которых не были обнаружены до настоящего времени. Самцы этих видов идентичны. Данное обстоятельство потребовало привлечения дополнительных методов исследования, с целью обнаружить морфологические диагностические характеристики видов-двойников. Гистологический анализ строения копулятивных органов до сих пор не проводился, хотя логично предположить, что именно здесь можно найти видоспецифичные признаки, функционально связанные с репродуктивной изоляцией этих видов. В настоящей статье приводятся новые данные по строению железистого аппарата копулятивного органа моллюсков p. Littorina
Материал и методы исследования. Сбор материала проводили в июле-сентябре 2004 и 2005 гг,, в период сезона размножения моллюсков. Литторин собирали вручную с поверхности субстратов. Представители видов L. saxatilis, L. obtusata, L. fabalis, L. littorea были собраны на Белом море (губа Чупа, на базе МБС СПбГУ). Представители видов L. arcana и L. compressa были привезены с побережий Баренцева (бухта Оскара, пос. Дальние Зеленцы) и Северного (Slapton Ley Field Centre, Devon, Англия) морей. Места сбора моллюсков и индивидуальные характеристики каждой особи, использованной для гистологического анализа, представлены в таблице. Возраст моллюсков определяли по годичным кольцам остановки роста раковины. Измерение ширины и высоты раковины проводили штангенциркулем с точностью до 0,1 мм. После проведения измерений моллюсков вскрывали, определяли пол особи и наличие заражения. Для исследования использовали только незаряженных половозрелых самцов.
Копулятивный орган самца фиксировали в жидкости Буэна. Гистологические препараты были изготовлены по стандартной методике, толщина серийных срезов - 10-11 мкм, окраску производили гематоксилин-эозином.
© Е. В. Ганжа, А. И. Гранович, Ю. А. Петрова, Н. А. Михайлова, 2006
Характеристика исследованного материала
Вид моллюска Место сбора Дата сбора Ширина/ высота раковины, мм Возраст моллюска (кол-во лет) Кол-во пениальных желез
L. saxatilis Корга у Левин наволока, Белое море июль 2004 6,0 / 6,3 5,0/5,4 3 3 7 8
Юшковская губа, о. Средний Июль 2005 6/7 6,3/8 7,3 /8,2 6/6,4 6,2 /7 3 4 4 3 3 6 7 8 9 6
L. obtusata Там же июль 2004 8,0 / 8,4 7,9/8,1 8,0 / 8,7 3 3 4 -
июль 2005 8,2/8,5 6,4 / 6,5 5 4 _
июль 2005 7,4 / 7,9 8,9/9,4 7,7/7,6 5 6 4 -
L.fabalis Корга у Левин наволока, Белое море июль 2004 9,0/8,8 9,1 /8,0 4 4 6 7
июль 2005 7,5/7,5 3 6
L. littorea Там же июль 2004 25/20 30/25 — —
июль 2005 22,4/24,3 - -
L. arcana Бухта Оскара, Баренцево море август 2004 — — 7 8
Slapton Ley Field Centre, Devon, Англия, Северное море сентябрь 2005 - - 10
L. compressa Бухта Оскара, Баренцево море август 2004 _ — 4 5
Примечание.«-»- параметр не измерялся.
Препараты изучали под микроскопом «Люмам» при увеличении 10х и 40х. Для каждого вида отмечали высоту кластера железистых клеток; форму, высоту и ширину мышечной капсулы, толщину слоя мышечных клеток в капсуле и толщину общей мышечной оболочки кластеров. Все измерения делали с помощью объект- и окуляр-микрометров, с точностью до 1 мкм.
Фотографии пениальных желез были сделаны при увеличении 3,2х, 12,5х, 25х, 40х с помощью цифрового фотоаппарата Nikon Coolpix 4500. Рисунки, приведенные в статье, сделаны на основе цифровых снимков.
Поскольку самцов L. saxatilis и L. arcana невозможно определить по морфологическим признаками, нами была проведена их идентификация при помощи амплификации ДНК со специфическими для L. arcana праймерами. Была проделана следующая работа: отпрепарированный пенис анонимного самца фиксировали в жидкости Буэна и одновременно брали небольшие кусочки ткани головы этого же моллюска для выделения геномной ДНК. В дальнейшем, по наличию амплифицированного фрагмента ДНК, размером 280 пн, определяли видовую принадлежность самцов: у особей L. arcana этот фрагмент амплифицируется, у L. saxatilis - отсутствует [3].
Экстракцию ДНК проводили методом СТАВ [8]. Ткани моллюсков измельчали, добавляли СТАВ-буфер (2% СТАВ, 1/4 М NaCl, 0,2% В-меркаптоэтанола, 20 мМ ЭДТА , 100 мМ Трис-НС1 (рН = 8,0)), 100 мкг/мл протеиназы К и инкубировали при температуре 60 °С. После полного растворения тканей лизат дважды экстрагировали смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). Осаждение ДНК проводили 96 °-ным этанолом, а дальнейшую отмывку - 70 °-ным этанолом. Полученные образцы ДНК высушивали на воздухе и растворяли в стерильной дистиллированной воде, доводя концентрации до 10 нг/мкл'1
Амплификацию ДНК моллюсков двух видов (I. saxatilis и L. arcana) проводили со специфическими для L. arcana праймерами A2.8F и A2,8R. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл: 2 мкл ДНК («20 нг), по 25 мкМ праймеров, 200 мкМ dNTP, 2,5 ед Taq-полимерэзы (Amersham Pharmacia), 1х буфер (100 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 15м М MgCl2; 500 мМ КС1). Реакцию проводили с использованием следующей программы: начальная денатурация 95 °С - 5 мин, далее 30 циклов: 95 °С - 30 с; 57 °С - 30 с; 72 °С - 45 с; конечная элонгация 72 °С - 5 мин. Продукты амплификации разделяли в 2,0%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.
Результаты исследования и их обсуждение. Представители p. Littorina (Gastropoda: Caenogastropoda: Littorinidae) раздельнополы, характеризуются внутренним оплодотворением и имеют одиночную гонаду. Мужская половая система представителей p. Littorina устроена сравнительно просто. Семенник расположен во внутренностном мешке, прилегая непосредственно к печени, имеет дольчатую структуру и отличается желтоватым цветом. Он представляет собой совокупность многочисленных пузырьков, которые своими семявыносящими каналами открываются в семенной проток. В области желудка семенной проток расширяется и образует множество складок, которые используются для длительного хранения спермы. Дистальная часть семенного протока превращена в простатическую железу. Далее семенной проток проходит через копулятивный орган моллюсков (пенис), где формируется семяизвергательный канал. Последний открывается наружу вторичным половым отверстием.
Копулятивный орган литторинид расположен на правой стороне головы моллюска, позади щупальца, и в неактивном состоянии спрятан в мантийной полости. Пенис -сравнительно крупное мускулистое тело, конической формы, слегка уплощенное с боков. В строении пениса можно выделить основание, мышечное тело и концевой филамент (рис. 1). Основание пениса у представителей литторинид обычно складчатое, что позволяет пенису свободно выходить наружу перед спариванием. Концевой филамент может быть разной формы и длины, изрядно вытягиваясь в момент копуляции моллюсков.
основание
тело
пениальные железы
филамент
Рис. 1. Строение копулятивного органа Littorina saxatilis (по: [10]).
На вентральной стороне мышечного тела располагаются пениальные железы (см. рис. 1). Они имеют округлую форму, а их расположение и количество различается у разных видов. У L. saxatilis, L. arcana, L. compressa, L.fabalis пениальные железы располагаются в один ряд, тогда как у L. obtusata и L. littorea - в несколько рядов, формируя так называемую «подушку».
У представителей шести изученных видов пениальные железы имеют сходное строение (рис. 2). В каждой пениальной железе можно выделить две части: секреторную часть и резервуар. Секреторная часть пениальной железы представляет собой секреторные клетки, объединенные в кластеры. Каждый кластер ограничен индивидуальной тонкой мышечной оболочкой. Кроме того, совокупность кластеров окружена общей, более толстой, мышечной оболочкой. Эта оболочка может быть выражена отчетливо (L. saxatilis, L. arcana, L, compressa, L. fabalis) или практически не выражена (L. littorea и L. obtusata) (см. рис. 2). В работе Л. Хайман, на рисунке пениальной железы L. littorea, общая мышечная оболочка кластеров железистых клеток также не отмечена [7].
Присутствие или отсутствие общей оболочки кластеров, по-видимому, можно связать с рядностью желез: оболочка есть у видов, пениальные железы которых, расположены в один ряд (L. saxatilis, L. arcana, L. fabalis, L. compressa) и ее нет y видов, железы которых расположенны в несколько рядов (L. obtusata, L. littorea). В данном контексте особый интерес вызывает L. arcana, для представителей которого описано расположение пениальных желез как в один, так и в несколько рядов [10, наши данные]. Для уточнения строения мышечной оболочки кластеров L. arcana необходимо получить гистологические препараты многорядного пениса самцов этого вида.
Межвидовые различия наблюдаются в высоте кластеров железистых клеток, которая у L.fabalis намного больше, чем у L. obtusata (1/2 и 1/5 высоты мышечной капсулы соответственно). У трех других видов (L. saxatilis, L. arcana, L. compressa) высота кластеров железистых клеток также различается относительно высоты мышечной капсулы (больше 1/2 - L. saxatilis, 1/3 - L. arcana, 1/4-1. compressa). У L. saxatilis, в отличие от двух других видов, в одной железе насчитывается больше кластеров. Расположение кластеров на дистальной части мышечной капсулы одинаково у L. saxatilis и L. arcana и отличается от их расположения у L. compressa (по окружности капсулы).
5
6
Рис. 2. Схемы строения пениальных желез.
1 - L. saxatilis, 2 - L. obtusata, 3 - L. arcana, 4 ~ L.fabalis, 5 - L. compressa, 6 - L. littorea. a - секреторная
часть, б - резервуар, в - железистая клетка, г - мышечная обкладка кластера, д - общая мышечная оболочка кластеров, е - продольные мышцы, ж - кольцевые мышцы, з - внутренний эпителий капсулы.
Количество железистых клеток внутри кластера различно. Протоки идут от каждой клетки и, объединяясь, пронизывают мышечную капсулу. Если плоскость среза прошла в месте впадения протоков, то на поперечном срезе капсулы можно видеть отверстия. Клетки в кластере располагаются в большинстве случаев упорядоченно. Ядра лежат на одном уровне, в расширенной части клеток.
Резервуар пениальной железы представлен капсулой, стенка которой состоит из мышечных волокон разной направленности (продольные и кольцевые), и внутренней полостью, заполненной секретом. Форма мышечной капсулы и толщина мышечных волокон одинакова у L. obtusata и L.fabalis. Среди видов группы «saxatilis» она практически одинакова у L. агсапа и L. saxatilis (вытянутый овал), но отличается у L. compressa (округлая). Расположение кольцевых мышечных пучков различается: они могут располагаться равномерно по всей капсуле (L. saxatilis, L. агсапа, L. compressa, L. littorea) или формировать скопления из нескольких десятков мышечных пучков (L. obtusata, L.fabalis), при этом отдельные волокна могут располагаться и вне этих скоплений.
Изнутри капсула выстлана ресничным эпителием (см. рис. 2). Клетки эпителия прозрачные, между ними располагаются протоки железистых клеток, заполненные мелкозернистым секретом. У L. obtusata и L.fabalis эпителиальные клетки цилиндрические, ядра располагаются в их базальных частях приблизительно на одном уровне. Сходное строение имеет эпителий капсулы L. saxatilis, L. агсапа, L. compressa и L. littorea, выстилающий дистальную часть резервуара. В других отделах резервуара клетки эпителия крупнее, и упорядоченности в расположении ядер не наблюдается.
Иллюстрация строения сложной пениальной железы литторин была представлена в работе Л. Хайман (рис. 131, с. 290 [7]). Полученные нами данные лишь частично подтверждают приведенную схему, и только в части общего плана строения пениальной железы. Ни в одном случае нам не удалось наблюдать просветы внутри кластеров секреторных клеток и их эпителизацию, обозначенные на схеме. Кроме того, к сожалению, в цитируемой работе не указан конкретный вид рода Littorina, для которого приводится иллюстрация.
В целом все шесть изученных нами видов литторин характеризуются единым планом строения пениальных желез. И это, безусловно, определяется единством их функции - пениальные железы выделяют секрет, необходимый для успешного спаривания моллюсков. Одни авторы полагают, что секрет способствует удержанию пениса в копу-лятивной бурсе самки в момент передачи спермы, другие утверждают, что секрет облегчает механическое проникновение пениса [5, 10]. Механизм работы пениальных желез может быть следующим: секрет, производимый железистыми клетками, мышечным сокращением оболочки кластера и обкладки кластеров выводится в резервуар железы, а затем, сокращением мышечной капсулы, выводится наружу, на поверхность копулятив-ного органа, через проток капсулы.
Суммируя полученные предварительные данные можно сделать вывод, что по строению пениальных желез группы видов-двойников имеют свои специфические особенности: группа видов «obtusata» характеризуется цилиндрическим внутренним эпителием со строгим расположением ядер и четкими границами между клеток, у представителей группы «saxatilis» цилиндрический внутренний эпителий наблюдается только в дистальной части железы. Можно предположить, что также имеются особенности строения пениальных желез, характеризующие группы видов-двойников и отдельные виды, которые суммированы ниже.
1) Группа видов «obtusata». Форма мышечной капсулы и толщина мышечных волокон одинаковая. Различия наблюдаются в высоте кластеров железистых клеток, которая у L. fabalis намного больше, чем у L. obtusata (1/2 и 1/5 высоты мышечной капсулы соответственно). Различается и расположение кластеров относительно мышечной капсулы: у L. fabalis они примыкают только к дистальной части капсулы, а у L. obtusata область примыкания шире. У L. obtusata нет общей оболочки кластеров, КЗ. 1С у L. fabalis.
2) Группа видов «saxatilis». Форма мышечной капсулы практически одинакова у L. arcana и L. saxatilis (вытянутый овал), но отличается у L. compressa (округлая). У всех трех видов различается высота кластеров железистых клеток относительно высоты мышечной капсулы (больше 1/2 - L. saxatilis, 1/3 - L. arcana, 1/4 - L. compressa). У L. saxatilis, в отличие от двух других видов, в одной железе насчитывается больше кластеров. Расположение кластеров на дистальной части мышечной капсулы одинаково у L. saxatilis и L. arcana, и отличается от их расположения по большей части окружности капсулы у L. compressa. Общая мышечная оболочка всех кластеров присутствует у всех видов. Она по толщине примерно одинакова у L. arcana и L. compressa (1/5 ширины мышечного слоя), а у L. saxatilis значительно толще (1/3 ширины мышечного слоя).
Необходимо отметить, что представленный материал позволяет сделать лишь предварительные выводы о разнообразии строения пениальных желез литторинид. Вместе с тем полученные данные являются новыми и крайне перспективными для дальнейшего детального описания морфологии видов-двойников.
Авторы благодарят А. С. Черкасова за помощь в сборе материала в районе пос. Дальние Зеленцы (Баренцево море).
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Санкт-Петербургского Научного Центра (Комплексный междисциплинарный проект).
Summary
Ganja Е. V., Granovich А. /., Petrova. Yu. A., Mikhailova N. A. Histological analysis of the penial glands structure of North Atlantic periwinkles genus Littorina.
Histological analysis of the penial glands of six North Atlantic periwinkles (Littorina saxatilis (Olivi, 1792), L. arcana Hannaford Ellis, 1978, L. compressa Jeffreys, 1865, L. obtusata (Linnaeus, 1758), L.fabalis Turton, 1825 and L.littorea (L.)) reveal an interspecific differences between them according to the organization of secretory part and penial gland cavity. Each species and the groups of sibling species are characterized by specific histological peculiarities.
Литература
1. Гранович А. И., Михайлова H. А., Знаменская О., Петрова Ю. А. Видовой состав моллюсков рода Littorina (Gastropoda, Prosobranchia) Восточного Мурмана // Зоол. журн. 2004. Т. 83. № 11. С. 1305-1317. 2. Майр Э. Популяции, виды и эволюция. М., 1974. 3. Петрова Ю. А., Гранович А. И., Михайлова Н. А. Молекулярные маркеры для идентификации близких видов литторинид Баренцева моря // Морская флора и фауна северных широт. Механизмы адаптации и регуляции роста организмов. Апатиты, 2004. С. 149-156.4. Freeman Т. П., MacKay М. R., Campbell I. М. On coniferophagous species of Choristoneura (Lepidoptera, Tortricidae) in north America // Can. Enthomol. 1967. Vol. 99. P. 449-506. 5. Fretter V., Graham A. British Prosobranch Molluscs. London, 1994. 6. Granovitch A. I., Sokolova I. M. Littorina arcana Hannaford Ellis, 1978 - a new record from the eastern Barents Sea // Sarsia. 2001. Vol. 86. P. 241-243. 7. Hyman L. H. The Invertebrates. Vol. IV. Mollusca I. Mebraw-Hill, 1967. 8. Mikhailova N. A.Johannesson K. A comparison of different protocols for RAPD analysis of Littorina // Hydrobiologia. 1998. Vol. 378. P. 33-42. 9. Rau P. The nests and the adults of colonies of Polistes wasps // Ann. Enthomol. Soc. Amer. 1946. Vol. 39. P. 11-27,10. ReidD. G. Systematics and evolution of Littorina. London, 1996.
Статья поступила в редакцию 6 апреля 2006 г.
