CC BY
10
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
ингибиторами контрольных точек. Для первичной медиасти-нальной B-клеточной крупноклеточной лимфомы (ПМВКЛ) исследование этих молекулярных факторов для определения прогноза заболевания и выбора терапии практически не проводилось. В нашем пилотном исследовании было показано, что стандартный набор из пяти маркеров мононуклеотидных микросателлитных повторов BAT-25, BAT-26, NR21, NR-24 и NR-27, традиционно используемый для анализа MSI в солидных опухолях, не информативен при ПМВКЛ из-за низкой встречаемости MSI при данной патологии (до 5%). Также в половине случаев MSI второй аллель выявляется как в опухоли, так и в контрольном материале, что объясняется наличием у больного редкого герминального варианта микросателлита, а не особенностью опухолевых клеток. Перекрывающиеся комбинации ферментов комплекса репарации ДНК ответственны как за восстановление неспаренных оснований, так и за удаление вставок петель олигонуклеотидов. Несостоятельность ферментов комплекса репарации ДНК может привести как к MSI, так и к EMAST. Возможно, исследование EMAST при ПМВКЛ будет более информативным, чем исследование MSI.
Цель. Проанализировать частоту LOH и EMAST в опухолевых клетках пациентов с ПМВКЛ в дебюте заболевания и проверить возможную ассоциацию с гиперэкспрессией мРНК PD-L1 (лиганда белка программируемой клеточной смерти).
Материалы и методы. STR-профили ДНК опухолевых клеток были проанализированы для когорты из 72 пациентов (медиана возраста 32 года, 23 мужчины,49 женщин) с диагнозом ПМВКЛ de novo, получавших терапию по протоколу R-DA-EPOCH (n=62) или R-NHL-BFM-90 (n = 10) в Национальном медицинском исследовательском центре гематологии (Москва, Россия). ДНК была выделена из архивных образцов биоптатов опухоли, взятых при установлении диагноза. Контрольные образцы ДНК выделяли из крови пациентов в ремиссии или из буккального эпителия. STR-профили для анализа LOH и
EMAST оценивали с помощью STR-ПЦР, используя мультиплексный набор для амплификации 19 STR-маркеров и ло-кусов амелогенина COrDIS Plus (ООО «Гордиз», Россия). Фраг-ментный анализ был выполнен на генетическом анализаторе ABI3130. Для 15 пациентов статус LOH и EMAST сравнивали с уровнем экспрессии мРНК PD-L1, определенного ранее, непосредственно в дебюте заболевания, но на тех же образцах.
Результаты. Потеря гетерозиготности выявлена у 37 из 72 пациентов (51,4%). EMAST обнаружили у 40 пациентов (55,5%); у 24 из них в комбинации с LOH. Для всех EMAST-положительных пациентов количество вовлеченных локусов было не более 4 из 19 (EMAST-low, менее трети панели микро-сателлитных маркеров). Показано, что общая и бессобытийная выживаемость были самыми высокими у пациентов со стабильным STR-профилем опухоли. Среди 15 пациентов с известным уровнем экспрессии мРНК PD-L1 у шести пациентов не было выявлено ни EMAST, ни гиперэкспрессии PD-L1. У трех пациентов EMAST с 2-3 вовлеченными STR-локусами сочетался с гиперэкспрессией PD-L1. Для 4 пациентов была выявлена комбинация EMAST и нормальной экспрессии PD-L1, и для двух пациентов гиперэкспрессия PD-L1 была выявлена при стабильном STR-профиле опухоли. Несмотря на малый объем выборки и невозможность достоверной статистической оценки связи неэффективности стандартной терапии и комбинации EMAST и гиперэкспрессии PD-L1, необходимо отметить, что у всех пациентов этой группы (3 человека) стандартная терапия была неэффективна.
Выводы. LOH и EMAST при ПМВКЛ, возможно, ассоциированы с меньшей эффективностью стандартной терапии у пациентов. Исследование EMAST как варианта микросател-литной нестабильности, особенно в сочетании с оценкой экспрессии PD-L1, может быть важно для прогнозирования ответа на терапию ингибиторами контрольных точек. Работа поддержана грантом Ракфонда 2/2020.
Н.Р. Рябчиковаг, Г.Ш. Сафуанова Ь4, И.Р. Минниахметов 2;3, Э.К. Хуснутдинова2, Д.Р. Сафуанова5, А.А. Латыпова4
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ОНКОСУПРЕССОРОВ PTPN1 И NF1 В КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ К562 В ЛЕЙКОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ
1Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Башкирский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России, г. Уфа 2Институт биохимии и генетики - обособленное структурное подразделение Федерального государственного
бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук, г. Уфа
3Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Республиканский медико-генетический центр, г. Уфа 4Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Республиканская клиническая больница им Г.Г. Куватова, Уфа 5Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва
Введение. Ключевую роль в возникновении онкологических заболеваний играют нарушения функции протоонкоге-нов, опухолевых супрессоров и так называемых мутаторных генов (Копнин Б.П., 2004). В настоящем исследовании проведен анализ уровня экспрессии генов тирозиновой фосфатазы первого типа PTPN1 и нейрофиброматоза первого типа №1, предположительно являющихся супрессорами опухолевого роста в развитии многих онкологических заболеваний.
Цель. Провести анализ экспрессии генов онкосупрессоров PTPN1 и №1 в клеточной ливни ХМЛ К562, в лейкоцитах периферической крови больных хронического миелолекоза (ХМЛ) и индивидов контрольной группы
Материал и методы. Генетические исследования проводились у 114 пациентов с клинически и цитогенетически установленным диагнозом ХМЛ в хронической стадии, находившихся под наблюдением гематологов Республиканской клинической больницы. Мужчин было 55, женщин 59, медиана
возраста составила 43 года (от 14 до 76 лет). Все больные получали лечение ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) (согласно национальным клиническим рекомендациям и ELN). Сравниваемые группы были рандомизированы и сопоставимы по полу и возрасту. Определение уровня экспрессии генов PTPN1 и NF1 проводилось методом ПЦР, а также в клеточной линии ХМЛ К562, при анализе использовали соответствующие праймеры RT2 gPSR Hrimer Assays, RT2 SYBR Green/Fluorescein gPSR Master Mix (Super Ату Bioscience,USA). Статистическая обработка полученных данных проводились на персональном компьютере типа IBM PC/AT с использованием стандартной программы «Microsoft Office Excel» и пакета прикладных программ статистической программы «Statistica 6.0 for Windows», SAS v.9.3.
Результаты. При анализе уровня экспрессии гена PTPN1 в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия между контрольной группой и больными, резистентными к терапии НТК. В клеточной линии К562
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
наблюдался довольно низкий уровень экспрессии гена PTPN1 по сравнению со всеми исследованными выборками. При анализе уровня экспрессии гена NF1 в лейкоцитах периферической крови выявлены статистически значимые различия в уровне экспрессии между контрольной группой и больными ХМЛ, резистентными к терапии ИТК, а также между контрольной группой и больными с полным молекулярным ответом. В клеточной линии К562 наблюдалось статистически значимое снижение уровня экспрессии гена NF1 по сравнению со всеми исследованными выборками, кроме группы контроля. Ген NF1 действует как негативный регулятор активности Ras белков, и тем самым, проявляет себя в роли онкосупрессора Повышение уровня экспрессии гена NF1 у больных онкологическими заболеваниями ранее было обнаружено только в исследовании Cacev и соавт. (2005) при развитии рака толстого кишечника (Cacev Т. et al., 2005). Увеличение уровня экспрессии данного
гена у больных ХМЛ свидетельствует о важности изучения именно тканеспецифичной экспрессии гена №1 и необходимости дальнейшего изучения профиля экспрессии данного гена.
Выводы. Таким образом, мутации в киназном домене БCR-ABL являются одной из основных причин резистентности к терапии иматинибом у некоторых пациентов с ХМЛ. Тем не менее, очевидно, что в развитии резистентности к лечению препаратами ИТК и прогрессировании ХМЛ в сторону акселерации и властного криза могут играть важную роль множество других клеточных, генетических и эпигенетических факторов, которые в совокупности определяют индивидуальное развитие болезни у больных ХМЛ. Полученные нами данные о роли онкосупрессоров раскрывают некоторые патогенетические аспекты ХМЛ и вносят вклад в общее представление о молеку-лярно-генетических основах развития данного заболевания.
Л.В. Сандакова, Л.Р .Ахметова, Э.Г. Багаутдинова, Р.И. Хусаинова, И.Р. Минниахметов
ВЫЯВЛЕНИЕ ВАРИАНТНОЙ ТРАНСЛОКАЦИИ С ОБРАЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО ОНКОГЕНА BCR-ABL МЕТОДОМ FISH У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Республиканский медико-генетический центр», г. Уфа
Введение. FISH-метод (метод флуоресцентной in situ гибридизации) широко используется в дифференциальной диагностике злокачественных заболеваний. Хромосомные аномалии, выявляемые при FISH, в сочетании с клинической картиной и данными иммуногистохимии являются основой классификации, определения тактики лечения и прогноза лимфо- и миелопроли-феративных заболеваний. В 2020 году в Медико-генетическом центре Республики Башкортостан (ГБУЗ РМГЦ) впервые в регионе был внедрен метод флуоресцентной гибридизации для исследования костного мозга у пациентов с гемобластозами.
Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) - клональное ми-елопролиферативное заболевание, особенностью которого является наличие приобретенной генетической аномалии -«филадельфийской хромосомы» (Ph). В большинстве случаев «филадельфийская хромосома» образуется в результате классической реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11.2) и в некоторых случаях в результате криптической инсерции ABL в район гена BCR, либо вариантной транслокации. Простые вариантные транслокации возникают в результате вовлечения в перестройку хромосомы 22 и любой другой, кроме хромосомы 9. В образовании сложных вариантных транслокаций участвуют не менее трех хромосом, две из которых хромосомы 9 и 22. При этом формируется химерный онкоген BCR-ABL, чаще всего кодирующий белок р210, обладающий тирозинкиназной активностью. Вследствие появления BCR-ABL-тирозинкиназы происходит нарушение нормального функционирования клетки, что приводит к злокачественной трансформации и вытеснению нормальных стволовых клеток. В работе представлены обобщенные результаты первого года диагностики ХМЛ в Республике Башкортостан с применением FISH-технологии.
Цель. Определить частоту встречаемости вариантной транслокации с образованием химерного онкогена BCR-ABL у пациентов с хроническим миелоидным лейкозом в Республике Башкортостан.
Материалы и методы. Материалом для исследования послужили образцы костного мозга 83 пациентов с диагнозом ХМЛ на различных фазах заболевания. В работе использовались локус-специфичные ДНК- зонды фирмы «Kreatech». Зонд ON BCR/ABL t(9;22) Fusion оптимизирован для детекции реципрокной транслокации t(9;22)(q34;ql1.2) по двойному слиянию сигналов, в двух цветах, на метафазных и интерфазных клетках мазков крови или костного мозга. Этот набор выявляет и криптическую инсерцию ABL в район гена BCR. Зонд ON BCR/ABL t(9;22), DC, S-Fusion, ES применяется для первичного скрининга пациентов
с ХМЛ. За счет дополнительного зонда, проксимального по отношению к точке разрыва на хромосоме 9q34, набор обеспечивает дополнительный сигнал на аберрантной хромосоме der(9q34) в случае транслокации ^9;22). «Филадельфийская хромосома», der(22q) идентифицируется по слитному сигналу. Р^Н-анализ проводили согласно протоколу производителя на цитогенети-ческих препаратах, содержащих интерфазные ядра. Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа фирмы «Zess» Ахю Imager.A2. В каждом случае было проанализировано от 200 до 400 интерфазных ядер. Интерпретация полученных результатов осуществлялась в соответствии с международной цитогеномной номенклатурой хромосом человека (^СЫ, 2016).
Результаты. Диагностика хронического миелоидного лейкоза проводилась с помощью Р^Н-анализа костного мозга в сочетании с молекулярно-генетическим исследованием периферической крови (определением экспрессии химерного транскрипта БСЯ-АБЬ р210 методом качественной и количественной ПЦР в реальном времени) и стандартным цитогенетическим исследованием (СЦИ) костного мозга. У 42 (50,6%) пациентов выявлена стандартная Р^хромосома, образованная в результате классической реципрокной транслокации ^9;22)^34^11.2). У 7 (8,4%) пациентов выявлено атипичное распределение флуоресцентных сигналов, что соответствует наличию различных вариантных транслокаций ^9;22). У 34 (41%) пациентов химерный онкоген БСЯ-АБЬ не выявлен.
Выводы. Таким образом, в Республике Башкортостан у большинства (50,6%) пациентов с хроническим миелоидным лейкозом при помощи Р^Н-анализа выявляется классическая реципрокная транслокация ^9;22)^34^11.2). Частота встречаемости вариантной транслокации, приводящей к образованию химерного онкогена БСЯ-АБЬ составляет 8,4%. У 41% пациентов в результате лечения достигнут полный цитогенетический ответ (ПЦО).
