CC BY
31Фізика живого, Т. 17, Nol, 2009. С.72-75.
©Цимбалюк О.В., РадченкоН.В., Давидовська Т.Л., МірошниченкоМ.С.
УДК 573.3
АНАЛІЗ ДИНАМІКИ ЗМІН НАПРУЖЕННЯ СКІНОВАНИХ ГЛАДЕНЬКИХ М’ЯЗІВ ПРИ ЇХ АКТИВАЦІЇ ІОНАМИ Са2+ ТА КОФЕЇНОМ
Цимбалюк О.В., Радченко Н.В., Давидовська Т.Л., Мірошниченко М.С.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка Надійшла до редакції 29.05.2009
В роботі здійснено аналіз динаміки механограм кумулятивних залежностей: напруження - [Ca2 ] та кофеїнової контрактури скінованих кільцевих гладеньких м’ язів caecum морських свинок. Показано, що подвійна нормалізація кривих зміни напруження гладеньком’ язових препаратів по амплітуді та по часу може бути використана для кількісної інтерпретації та співставлення даних.
Ключові слова: гладенький м’яз, скіновані смужки, залежність напруження-^a2], кофеїнова контрактура, нормалізація, кінетичний аналіз.
ВСТУП
Для коректного порівняння впливу різних факторів на біологічні об’єкти важливо застосовувати кількісний аналіз їх головних характеристик. Особливо вдалим можна вважати використання показників, які не залежать від суб’єктивних властивостей окремих сигналів, таких як амплітуда, час досягнення амплітудного значення та інші. Проблему об’єктивного порівняння числових даних, отриманих при реєстрації сигналів, наростання або спад яких можна описати сигмоїдою (спонтанних і викликаних скорочень гладеньких м’ язів, кальцієві транзієнти тощо) можна вважати насьогодні вирішеною [1-6]. Однак, залишається відкритим питання щодо аналізу головних кінетичних характеристик скоротливих відповідей
мультиклітинних препаратів скінованих гладеньких м’язів. Скорочення скінованих препаратів у переважній більшості можна розглядати як показникову функцію залежності напруження від часу, однак, деякі скоротливі відповідні мають невиражений характер сигмоїди. Зазвичай при описуванні таких даних дослідники користуються показником максимального напруження препаратів, тоді як характер досягнення цього показника у часі залишається поза увагою [7] або він порівнюється у некількісній описовій формі [8-9]. Перенесення методів кінетичного аналізу, які добре спрацьовують у випадку інтактних (нескінованих) гладеньком’ язових препаратів, унеможливлюється принциповою відмінністю (у переважній кількості випадків) характеру зміни напруження в часі у випадку скінованих препаратів. Таким чином,
насьогодні існує проблема порівняння скорочень, отриманих для різних гладеньком’ язових препаратів (варіювання за розміром та за походженням від різних тварин) та зареєстрованих за умови дії різних факторів.
У нашій роботі зроблено спробу кількісного кінетичного аналізу скоротливих відповідей скінованих багатоклітинних препаратів на прикладі скорочень кільцевих гладеньких м’ язів caecum морських свинок.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Скінування кільцевих гладеньком’язових смужок (ГМС) сліпої кишки здійснювали методом Koaichi Saida [10]. Препарат виділяли зі стінки кишечника морських свинок і поміщали у нормальний розчин Кребса наступного складу (у мМ/л бідистильованої води): NaCl - 120,4; NaHCO3 - 15,5; NH2PO4 - 1,2; KCl - 5,9; CaCh -2,5; MgCl2 - 1,2; глюкоза -11,5; рН 1,4, на 40 хвилин. Далі, нормальний розчин Кребса заміняли на релаксуючий розчин (у мМ/л літр деіонізованої води): К+пропіонат - 130; трис-малат
- 20; MgCl2 - 4; АТФ - 4; ЕГТА - 4; АТФ-регенеруюча система (креатинфосфат динатрієва сіль - 10; креатинфосфокіназа - 10 Од/мл), рН б,8, температура 20 оС. Під контролем довгофокусного мікроскопу за допомогою спеціально виготовлених технічних інструментів препарати усікали до розміру у поперечнику 100-250 мкм. На гладеньком’ язову смужку накладали лігатури так, що довжина препарата становила 3-4 мм. Кінці лігатур прив’язували до вольфрамових дротиків діаметром 150 мкм та довжиною 10 мм, покритих
тефлоновим воском. Один із дротиків фіксували жорстко у робочій камері, а другий - приєднували до штока електромеханічного перетворювача МХ-1С. Далі сигнал подавався на каскад підсилення підсилювача. Реєстрацію напруження-розслаблення гладеньком’язових смужок проводили в ізометричному режимі за допомогою електричного потенціометра КСП-4. До робочої камери підводились два перистальтичні насоси.
Скінування гладеньком’язових смужок здійснювали сапоніном з рослин родини Rosaceae (“Sigma”) (протягом 20-30 хв), який у концентрації 40-б0 мкг/мл додавали до релаксуючого розчину. Після завершення скінування, ГМС протягом 15-20хв промивали релаксуючим розчином. Тестом на завершення скінування ГМ було напруження, яке розвивали ГМС у відповідь на аплікацію активуючого розчину, до складу якого входили іони кальцію в концентраціях 10-6 -10-3 М, а також реакція розслаблення, яка супроводжувала скорочення після заміни цього розчину на
релаксуючий. Концентрацію вільних Са2+ розраховували за допомогою програми “МахсИеГ. Також скоротливу відповідь ініціювали кофеїном (25 мМ).
Нормалізацію та аналіз скоротливих відповідей проводили в програмі ОгідіиРго8.0. У всіх випадках апроксимації кривих коефіцієнт Я2 становив не менше 0,99.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Як було вказано вище, у всіх випадках скоротливі відповіді нескінованих гладеньких м’язів (окремо фази наростання та спаду напруження) описуються 8-подібними
залежностями зміни напруження в часі. Таким чином, крім амплітуди їх важливою
характеристикою є максимальна швидкість зміни напруження, яка знаходиться у точці перегину сигмоїди.
Рис. 1. Са2+-залежне (1) та кофеїн (КФ) (25 мМ) (2) - викликане напруження сканованої сапоніном
гладеньком’язової смужки (ГМС) caecum. RX - релаксуючий розчин з вмістом ЕГТА (4 мМ)
10'” м 10'f м 11Т4 м ю'3 м
t. ХЕ
Рис. 2.
А - приведені до спільного початку криві Са2+-залежного напруження; Б - ці ж криві, нормалізовані за амплітудою та за часом
Цимбалюк О.В., Радченко Н.В., Давидовська Т.Л., Мірошниченко М.С.
і '■* 5
К 1,0 І О)
£ 0,8 і 0,6 0.4
0,2
0,0
.-■“4
Рис. 3.
А - приведені до спільного початку криві кофеїнової контрактури та Са -залежного напруження; Б ці ж криві, нормалізовані за амплітудою та за часом
У скінованих препаратів крива наростання напруження переважно має характер експоненти, а максимальна швидкість зміни напруження співпадає з початковою швидкістю. Разом з тим, у більшості випадків дослідник може чітко ідентифікувати час початку розвитку скоротливої відповіді та час досягнення нею максимуму. Тоді для кількісного опису і порівняння таких даних можна спробувати застосувати процес нормалізації. Варто зазначити, що попередньо академіком П. Богачем були зроблені спроби кінетичного аналізу скоротливих відповідей інтактних м’язових препаратів шляхом їх нормалізації [6], які, однак мали задовільний результат тільки у випадку спонтанних скорочень.
Вважатимемо за доцільне одночасно здійснювати нормалізацію скорочень за величиною максимального напруження препарату (fm) та за часом досягення величини fm (позначимо tm). Це дасть можливість, по-перше, візуально порівнювати динаміку розвитку різних скоротливих відповідей,
і, по-друге, кількісно характеризувати відносні зміни між ними. У цьому випадку для аналізу пропонується використовувати коефіцієнти
рівняння регресії (у = У о + A ■ e1 r), яке
апроксимує експоненційне зростання сигналу, та значення часу досягнення напівмаксимуму нормованого напруження (tn, 1/2).
Застосуємо запропонований аналіз до скорочень, одержаних при прикладанні до скінованих препаратів caecum морських свинок активаційного розчину з різними концентраціями іонів кальцію (10-6 - 10-3 М). Як видно, первинний запис механограми не дозволяє адекватно оцінити кінетичні характеристики зміни напруження препаратів у кожному випадку кумулятивного прикладання збільшеної концентрації Са2+ (Рис. 1, механограма 1). У випадку, коли усі скоротливі відповіді розташувати так, щоб усі вони мали
спільну точку початку зміни напруження (Рис. 2а), також важко співставляти їх кінетику. У випадку нормалізації кривих (Рис. 2б), як запропоновано вище, стає зрозумілим, що у випадку аплікації початкової концентрації Са2+ (10-6 М)
спостерігається наростання напруження, яке добре апроксимується сигмоїдою (Я2 = 0.999); ^, % становив 0.51. Нормалізація кривих зміни напруження скінованих препаратів під впливом кумулятивного збільшення концентрації іонів кальцію в активуючому розчині (10 5 - 10-3 М) виявила, що не існує принципових кінетичних відмінностей між усіма скоротливими відповідями. Проведення регресійного аналізу кривих показало, що апроксимація нормалізваних кривих саме експонентою вдале (величина Я2 не нижче 0.993). ^ % варіював в межах 0.21-0.225.
У випадку активації скорочення кофеїном (рис. 1, механограма 2), фаза наростання
напруження мала характер сигмоїди (Рис. 3 а). При співставленні нормованих кривих змін напруження при початковій активації препаратів іонами Са2+ (10-6 М) та кофеїнової контрактури (Рис. 3б) показовим є їх накладання.
ВИСНОВКИ
Таким чином, застосовуючи нормалізацію до аналізу скоротливих відповідей скінованих гладеньком’язових препаратів, можна отримати ряд переваг. По-перше, можна кількісно
характеризувати динаміку зміни напруження (коефіцієнтами рівняння регресії у0, А, г та значенням ^ 1/2), по-друге, наочно представляти кінетичні залежності зміни напруження. Також можна висунути припущення, що у випадку ідентичних нормалізованих кривих не існує відмінностей у механізмах, які реалізують активацію скорочення.
Література
1. Изаков В.Я. Биомеханика сердечной мышцы. -Москва.: Наука, 1981. - 325 c.
2. Давидовська Т.Л., Цимбалюк О.В., Давидовська
Н.В., Мірошниченко М.С., Костерін С.О. Кінетична характеристика кофеїнової контрактури гладеньких м'язів caecum // Вісник Київського нац. ун-ту імені Тараса Шевченка. Біологія.-2001. Вип. 33.-С. 13-1б.
3. Burdyga Th.V., Kosterin S.A. Kinetic analisis of smooth muscle relaxation. // Gen. Physiol. Biophys.
- 1991. №10. - P. 589-598.
4. Костерін С.О., Мірошниченко М.С., Давидовська Т. Л., Цимбалюк О. В., Прилуцький Ю. І. Феноменологічна механокінетична модель скорочення-розслаблення гладенького м’ язу // Укр. біохім. журн. - 2001. Т. 13, №б. - С. 139143.
5. Онуфрийчук О.В., Цимбалюк О.В., Мірошниченко М.С., Костерін С.О. Механокінетика “скорочення-розслаблення” кільцевого м’язу сліпої кишки (caecum) щурів // Фізика живого. -200б. - Т.14, № 3. - С. б3-15
б. Богач П.Г., Підгорна Л.А. Аналітичний опис
скорочень гладеньком’ язових клітин // Доп. Акад. наук Української РСР. - 1981. - Серія Б, №12. - С. 55-58.
1. Bialojan C., Ruegg J., Takai A. Effects of okadaic
acid on isometric tension and myosin phosphorylation of chemically skinned guinea-pig taenia coli. // J. Physiol. - 1988. - V. 398. - P. 8195.
8. Kuhn H., Tewes A., Gagelmann M., Guth K., Arner A., Ruegg J.C. Temporal relationship between force, ATPase activity, and myosin phosphorylation during a contraction/relaxation cycle in a skinned smooth muscle // Pflugers Arch. - 1990. - V^^, № 5. - P. 512-518.
9. Malmqvist U., Arner A. Regulation of force and shortening velocity by calcium and myosin phosphorylation in chemically skinned smooth muscle // Pflugers Arch. - 199б. - V. 433, № 1-2. -Р.42-48.
10. .Saida K. Intracellular Ca2+ release in skinned smooth muscle // J. Gen. Physiol. - 1982. - V.80, № 1. - P. 191-202.
АНАЛИЗ ДИНАМИКИ ИЗМЕНЕНИЯ НАПРЯЖЕНИЯ СКИНИРОВАННЫХ ГЛАДКИХ МЫШЦ ПРИ ИХ АКТИВАЦИИ Са2+ И КОФЕИНОМ
Цимбалюк О.В., Радченко Н.В., Давидовска Т.Л., Мирошниченко М.С.
В работе проведен анализ динамики механограмм кумулятивных зависимостей: напряжение -[Ca2] и кофеиновой контрактуры скинированых кольцевых гладких мышц caecum морских свинок. Показано, что двойная нормализация кривых изменения напряжения гладкомышечных препаратов по амплитуде и по времени может использоваться для количественной интерпретации и сопоставления данных.
Ключевые слова: гладкая мышца, скинированные полоски, зависимость напряжение - [Ca2+], кофеиновая контрактура, нормализация, кинетический анализ
АNALYSIS OF THE DYNAMICS OF A CHANGE IN THE TENSION OF CHEMICALLY SKINNED CAECUM SMOOTH MUSCLES WITH THEIR ACTIVATION BY Са2+ AND CAFFEINE
Tsimbalyuk O.V., Radchenko N.V., Davidovs’ka T.L., Miroshnichenko M.S.
The work presents the analysis of dynamics of mechanograms cumulative relationships of tension - [Ca2+] and caffeine-induced contractions of caecum smooth muscles skinned strips. It is shown that the dual normalization of the curves of a tension change of strips (in the amplitude and on the time) can be used for the quantitative interpretation and the comparison of data
Key words: smooth muscle, skinned strips, Ca2+, relationship tension - [Ca2+], caffeine-induced contraction, normalization, kinetic analysis.
