CC BY
63Фізика живого, Т. 16, Nol, 200S. С.56-61.
© Давидовська Т.Л., Мірошниченко М.С., Цимбалюк О.В., Іванов О.Я., Нурищенко Н.Є.
УДК 577.3
Са2+- ТА Са2+-КАЛЬМОДУЛІН ЗАЛЕЖНЕ СКОРОЧЕННЯ СКІНОВАНИХ ГЛАДЕНЬКИХ М’ЯЗІВ ТА ЙОГО МОДЕЛЮВАННЯ
Давидовська Т.Л., Мірошниченко М.С., Цимбалюк О.В., Іванов О.Я., Нурищенко Н.Є.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, вул. Володимирська 64, 01033 Київ
Надійшла до редакції 17.01.2008
Встановлено залежність величини напруження скінованих сапоніном тонких (100-150 мкм) гладеньком’язових смужок кільцевих гладеньких м’язів сліпої кишки морських свинок від концентрації іонів кальцію в активуючому розчині. З’ясовано, що кальмодулін підсилює чутливість скорочувального апарата м’язів caecum до цих катіонів. Побудовано математичну модель, що описує експериментальні результати по зміні сили м’ язового скорочення скінованих гладеньких м’ язів у часі.
Ключові слова: скіновані ГМК, кальмодулін, моделювання, Са2+.
ВСТУП
Однією з важливих функцій гладеньком’ язових клітин (ГМК) шлунково-кишкового тракта (ШКТ) є їх здатність генерувати силу [1-3]. На сьогоднішній день питання про механізми рухомості структурних елементів скорочувального апарата ГМК залишається відкритим, оскільки більшість з них не можуть бути віднесені до тих, які мають місце in vivo. Найбільш експериментально обґрунтованим (але не вільним від недоліків) є механізм фосфорилювання міозину. Аналіз основних
положень цього механізму в гладеньких м’ язах та перевірка його на моделях in vitro викладені у багатьох роботах [4-9]. Вони зводяться до наступного: фосфорилювання міозину
здійснюється кіназою легких ланцюгів міозину (КЛЛМ); КЛЛМ активується Са2-зв’язуючим білком кальмодуліном; кальмодулін, виступаючи посередником, забезпечує “чутливість” системи регуляції скорочувального апарата до зміни [Ca2+]b збільшення якої приводить до зв’язування цих катіонів з КЛЛМ, що супроводжується зміною конфірмаційного стану міозину. Ділянка
(“кишеня”), що утворилась внаслідок конформаційних перебудов КЛЛМ реагує з
апоензимом і набуває властивостей ферменту. Активована КЛЛМ каталізує фосфрилювання кожного з двох регуляторних легких ланцюгів міозину. Під дією актину відбувається активація АТФ-азної активності міозину. Ділянка взаємодії між актином та головкою міозину є ділянками для генерації сили. Ініціюється процес скорочення,
який підтримується до тих пір, поки [Са2] вища порогової. її зменшення, призводить до інактивації КЛЛМ. Актин-активована Мg2+-АТФ-азна активність міозину зменшується. Гладенькі м’язи релаксують.
Але добре відомо, що скорочення гладеньких м’ язів ШКТ не зводиться виключно до взаємодії скорочувальних фібрил. У цьому процесі трансформації вільної енергії ферментативного гідролізу АТФ за участі Мg2+, Са2-АТФ-ази у механічну роботу важливу роль належить також внутрішньоклітинним компартментам Са2+ [10-13]. Зручною експериментальною моделлю гладеньких м’язів, яка відкриває доступ до їх скорочувального апарата та середовища його інкубації, а також депо іонів кальцію є модель скінованих ГМ. Метою наших досліджень було отримати криві залежності: “напруження-[Са2]” та враховуючи ті обставини, що, згідно з даними літературних джерел [14], одержаними за допомогою Бига-2 про можливе зменшення за даних умов кількості білків і, зокрема Са2-зв’язуючого білка кальмодуліна, а також вкрай важливу його роль в активації скорочення ГМ іонами Са2+, отримати криві залежності “напруження-[Са2]” за присутності цього білка. Додаткову об’єктивну інформацію для передбачення механізмів, які реалізуються при розвитку скоротливої відповіді у роботі було одержано шляхом моделювання змін сили м’язового скорочення скінованих гладеньких м’язів у часі.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Скінування кільцевих гладеньком’язових смужок (ГМС) сліпої кишки здійснювали методом Koaichi Saida [15]. Препарат виділяли зі стінки кишечника морських свинок і поміщали у нормальний розчин Кребса наступного складу (у мМ/л бідистильованої води): NaCl - 120,4; NaHCO3
- 15,5; NH2PO4 - 1,2; KCl - 5,9; CaCh - 2,5; MgCh
- 1,2; глюкоза -11,5; рН 7,4. Далі, нормальний
розчин Кребса заміняли на релаксуючий розчин (у мМ на літр деіонізованої води): К+пропіонат - 130; MgCl2 - 1,2; АТФ - 4; ЕГТА - 2; АтФ-генеруюча система (креатинфосфат динатрієва сіль - 10; креатинфосфокіназа - 100 g/мл), рН 6,8,
температура 24-25 оС. Під контролем довгофокусного мікроскопу за допомогою спеціально виготовлених технічних інструментів препарати усікали до розміру у поперечнику 100250 мкм. Кінці лігатур прив’язували до вольфрамових дротиків діаметром 150 мкм та довжиною 10 мм, покритих тефлоновим воском. Один із дротиків фіксували жорстко у робочій камері, а другий - приєднували до штока електромеханічного перетворювача МХ-1С. Далі сигнал подавався на каскад підсилення підсилювача. Реєстрацію скорочення-розслаблення гладеньком’ язових смужок проводили в ізометричному режимі за допомогою електричного потенціометра КСП-4. До робочої камери підводились два перистальтичні насоси.
Скінування гладеньком’язових смужок здійснювали сапоніном з рослин родини Rosaceae (“Sigma”) (протягом 20 хв), який у концентрації 4060 мкг/мл додавали до релаксуючого розчину. Після завершення скінування, ГМС протягом 15-20хв промивали релаксуючим розчином. Тестом на завершення скінування ГМ було напруження, яке розвивали ГМС у відповідь на аплікацію активуючого розчину, до складу якого входили іони кальцію в концентрації 10-7 до 10-5 М/л, а також реакція розслаблення, яка супроводжувала скорочення після заміни цього розчину на релаксуючий. Концентрацію вільних Са2+
розраховували за допомогою програми “Maxchel”. Перші підходи до таких розрахунків у літературі було здійснено Бремель, Вебер (1975 р.) [16] та С.О. Костерін з співавт. (1984 р.) [17].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Оскільки іони кальцію є вторинним
посередником, що приймають участь у багатьох фізіологічних процесах, одним з яких є м’ язове скорочення, першим етапом у з’ ясуванні процесів рухомості тонких скінованих сапоніном кільцевих гладеньких м’ язів сліпої кишки морських свинок
було визначення залежності: [Са2]-напруження
ГМ. У наших дослідах, у відповідь на аплікацію гіперкалієвого розчину Кребса (130 мМ), до складу якого входили іони кальцію у концентрації 2.5 мМ розвивали ізометричне напруження. Зменшення концентрації цих катіонів до 10-5 М або внесення ЕГТА (4 мМ) з наступною аплікацією Са2+ (10-6 та 10-5 М) не супроводжувалось скороченням цих препаратів.
Досліджували кумулятивну дію на скіновані гладенькі м’ язи активуючого розчину з різним вмістом Са2+ (Рис. 1). У відповідь на внесення в активуючий розчин цих катіонів у концентрації 10-6 М, препарати на противагу інтактним м’ язам розвивали напруження. Активуючий розчин з концентрацією Са2+ 10-5, 10-4 М також активував
скорочувальний апарат скінованих гладеньких м’язів. Наступне збільшення концентрації іонів кальцію до 10-3 М не викликало змін максимального значення напруження
гладеньком’язових смужок. Заміна активуючого розчину на релаксуючий супроводжувалась розслабленням м’язових препаратів до базального рівня їх напруження. За величиною найбільше напруження розвивали скіновані гладеньком’ язові смужки при аплікації активуючого розчину з найменшою концентрацією іонів кальцію, що входили до його складу (10-6 М). Це склало майже половину максимального напруження, яке розвивали препарати у відповідь на аплікацію Са2+ в концентраціях 10-5, 10-4 М.
Рис. 1. Скорочувальна відповідь скінованої сапоніном гладеньком’язової смужки кільцевих гладеньких м’язів сліпої кишки на кумулятивну аплікацію активуючого розчину з вмістом Са2+ у концентраціях 10-6 - 10-3 М. Ях - релаксуючий розчин (4 мМ ЕГТА). Стрілками позначено заміну розчинів.
Давидовська Т.Л., Мірошниченко М.С., Цимбалюк О.В., Іванов О.Я., Нурищенко Н.Є.
Враховуючи вкрай важливу роль у регуляції внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію механізмів вивільнення та акумуляції цих катіонів з внутрішньоклітинних депо їх запасання (саркоплазматичний ретикулум, мітохондрії),
дослідили також напруження, що розвивали скіновані препарати у відповідь на аплікацію активуючого розчину з концентрацією Са2+ 10-5 М (Рис. 2). Одержані дані дозволяють зробити
припущення про те, що не існує принципових відмінностей між показниками сумарної амплітуди і часу розвитку напруження за умов кумулятивного збільшення концентрації іонізованого кальцію (10-6, 10-5 М) та при поодинокому внесенні у активуючий розчин цього катіону.
Рис. 2. Скорочувальна відповідь скінованої сапоніном гладеньком’язової смужки кільцевих гладеньких м’язів сліпої кишки на аплікацію активуючого розчину, який містив Са2+ у концентрації 10-5 М. Ях - релаксуючий розчин (4 мМ ЕГТА). Стрілками позначено заміну розчинів.
Згідно з механізмом “фосфорилювання”, вкрай необхідною умовою для розвитку напруження гладеньких м’язів є підвищення [Са2]і до мілімолярних рівнів. Розрахунок часу, необхідного для розвитку У максимального напруження тонких скінованих м’язових препаратів показав, що він більше, ніж у два рази перевищує час, необхідний для розвитку У скорочення, зумовленого гіперкалієвою деполяризацією плазматичної мембрани інтактних ГМ. Було зроблено припущення про часткове екстрагування з ГМС кальмодуліну. Як видно з Рис. 3, скіновані
сапоніном кільцеві ГМ сліпої кишки у відповідь на внесення в активуючий розчин Са2+ у концентраціях 10-6, 10-5 М (кумулятивна дія) за присутності кальмодуліну у концентрації 4,510" М відповідали розвитком напруження, максимальне
значення якого на противагу кумулятивній кривій (Рис. 1): [Са +]-напруження досягало свого
значення вже при концентрації цих катіонів 10-5 М. За присутності у активуючому розчині Са2+ у концентраціях 10- , 10- М та кальмодуліну
спостерігалось не подальше підвищення напруження, а навпаки їх часткове розслаблення. Заміна активуючого розчину на релаксуючий супроводжувалась розслабленням ГМС до базального рівня напруження.
____________________КМ_________________________
4 5-1П'7
Рис. 3. Скорочувальні відповіді скінованої сапоніном гладеньком’ язової смужки кільцевих гладеньких м’ язів сліпої кишки на кумулятивну аплікацію активуючого розчину у концентраціях 10-6 - 10-3 М за присутності кальмодуліну (КМ, 4.5* 10-7 М). Ях - релаксуючий розчин (4 мМ ЕГТА). Стрілками позначено заміну розчинів.
Цікавим також було розробити математичну модель скорочення скінованих гладеньких м’ язів, яка б базувалась на специфіці молекулярних процесів взаємодії скоротливих і регуляторних білків гладеньких м’ язів та впливу різних концентрацій іонів Са2+ в процесі розвитку скоротливої відповіді. Залежність сили скорочення непосмугованого м’язу від часу, згідно результатів дослідів на скінованих гладеньких м’ язах прямої кишки, має вигляд логістичної кривої. Очевидно, що сила скорочення м’ язу прямо пропорційна кількості актоміозинових комплексів. А зміна сили скорочення м’ язу в часі прямо пропорційна зміні кількості актоміозинових комплексів в часі. Тобто Б=к*у, де Б - сила м’язового скорочення, к -коефіцієнт пропорційності, який вказує яку силу в ньютонах розвиває один актоміозиновий комплекс, у - кількість актоміозинових комплексів (концентрація). Логістичний характер кривої сили скорочення говорить про кооперативний характер утворення актоміозинових комплексів. Тобто кожне
наступне приєднання міозину до актину відбувається легше, порівняно з попереднім. Концентрація актоміозинових комплексів обмежена концентрацією внутріклітинних іонів кальцію. Такий процес зміни концентрації цих комплексів у часі описуватиметься рівнянням Ферхюльста [18]: ау/Л=г*у*(1-у/Є/3), де dy/dt - зміна концентрації актоміозинового комплексу в часі, г - коефіцієнт приросту: г=(п-8)/у (п - кількість актоміозинових комплексів, які утворились за час ^ 8 - кількість актоміозинових комплексів, які розпались, у - кількість актоміозинових комплексів в момент часу і), С -концентрація кальцію в саркоплазмі. Але в процесі м’язового скорочення концентрація
внутрішньоклітинного кальцію змінюється, що необхідно враховувати в моделях скорочення гладеньких м’язів. Стосовно зміни концентрації необхідно враховувати надходження його із позаклітинного простору, надходження з ендоплазматичного ретикулуму внаслідок кальційіндукованого вивільнення кальцію та зменшення його концентрації внаслідок реакцій з білками скоротливого апарату. З урахуванням цих складових було отримане диференційне рівняння для зміни концентрації внутрішньоклітинного кальцію:
dС/dt= 0.25* С *(1- С/Стах) - г*у*(1-у/С/3), де Стах - максимальна концентрація кальцію в клітині (концентрація його в ЕПР). Тут доданок С *(1- С/Стах) відповідає за кальційіндуковане вивільнення кальцію і є логістичним рівнянням Ферхюльста. Доданок - г*у*(1-у/С/3) відповідає зміні концентрації актоміозинового комплексу, тобто припускається на основі експериментальних даних [19], що для утворення одного актоміозинового комплексу використовуються три молекули кальцію. Дана система диференційних рівнянь розв’язувалась в програмі МаШетайса 5.0 і на основі одержаних кількісних розрахунків будувались графіки залежності зміни концентрації актоміозинового комплексу та концентрації кальцію у часі.
Запис цієї системи рівнянь в програмі виглядає наступним чином:
8І=:Ш8оІуе[{у'Н==1*уН*(1-уМ/СМ/3),С'М== 0.25*уМ*(1-СМ/10л-6)-уИ*(1-уМ/СМ/3),у[0]= 10Л-7,С[0] == 10Л-7},{уМ,СМ},и,0,5000}];
й=Р1о^уак^е[{уМ }/.81],0,0,43 },РМ8їу1е=={Иие[0.99]}] ІІ=Р1о^Буа^е[{СМ }/.81],0,0,43 }№8їу1е=={Иие[0.7]}] jj=P1ot[Eva1uate[{y[t],C[t]}/.s1],{t,0,43},P1otSty1e== {Иие[0.99],Иие[0.7]}]
концентрація кальцію 10-7 М, початкова
концентрація актоміозинових комплексів 10-7 М. Отримані графіки добре описують експериментальні дані на скінованих м’ язах:
У
Рис. 4. Графік залежності зміни концентрації
актоміозинового комплексу у часі. У - концентрація актоміозинового комплексу, М; t - модельний час.
С
1ґ10-6 8ґ10-7 6ґ 10-7 4ґ10-7 2ґ10-7
10 20 30 40 і
Рис. 5. Графік залежності зміни концентрації
внутрішньоклітинного кальцію у часі. С - концентрація внутрішньоклітинного кальцію, М; t - модельний час.
У,с
Рис. 6. Графіки порівняння зміни концентрації
актоміозинового комплексу та концентрації внутрішньоклітинного кальцію у часі.
Початкові параметри моделі: максимальна
концентрація кальцію 10-6М, початкова
Давидовська Т.Л., Мірошниченко М.С., Цимбалюк О.В., Іванов О.Я., Нурищенко Н.Є.
З графіків видно, що концентрація актоміозинових комплексів зростає швидше, ніж концентрація внутрішньоклітинного кальцію. Крім того видно, що максимальна концентрація
актоміозинових комплексів в 3 рази вища, ніж концентрація внутрішньоклітинного кальцію.
Отже, дана математична модель описує експериментальні результати по зміні сили м’ язового скорочення від часу, тобто зміни концентрації актоміозинових комплексів в скінованих м’ язах. А саме відображає логістичну
залежність сили скорочення (концентрації
актоміозинових комплексів) від часу. Тобто кооперативні процеси утворення актоміозинових комплексів та збільшення концентрації
внутрішньоклітинного кальцію при м’ язовому скороченні. Також дана модель описує процеси зміни концентрації внутрішньоклітинного кальцію та залежність процесу скорочення від максимальної концентрації кальцію.
ВИСНОВКИ
Встановлено залежності процесу скорочення-розслаблення скінованих сапоніном гладеньких м’ язів caecum в залежності від концентрації іонів Са2+, а також іонів Са2+ та кальмодуліну. Встановлено, що кальмодулін підсилює чутливість скорочувального апарату ГМ до Са2+, модулюючи концентраційні умови виходу дозових кривих скорочення на плато.
У роботі приведено також математичну модель, що описує експериментальні результати по зміні сили м’язового скорочення скінованих гладеньких м’язів у часі. Ця модель відображає логістичну залежність сили скорочення (концентрація актоміозинового комплексу) від часу та описує процеси зміни концентрації внутрішньоклітинного Са2+ та залежність процесу скорочення від максимальної концентрації цих іонів.
Література
1. Shuba M.P., Vladimirova l.A. Effect of apamin on the electrical responses of smooth muscle to adenosine 5-’triphosphate and to non - adrenergic, non-cholinergic nerve stimulation // Neurosci. -1980. - Vol. 5, № 5. - P. 853-859.
2. BладимироваИЛ., ШубаМ.Ф. Синаптические процессы в гладких мышцах // Физиол. журн. - 1984. - Т. 16, № 3.
- С. 307-319.
3. Zholos A.V., Bolton T.B.// British J. Pharmacol. - 1997. -Vol. 122, № 5.- P. 885-893.
4. Bolton T.B., Prestwich SA., Zholos A.V., Gordienko D.V. Excitation -contraction coupling in gastrointestinal and other smooth muscles // Annu. Res. Physiol. - 1999. - Vol. б1. -P. 85-115.
5. Жолос A.B. Мембранные и внутриклеточные механизмы М-холинэргической активации гладкомышечных клеток тонкого кишечника: Дис... д-ра биол. наук: 03.00.02. -Киев, 1999. - 278 с.
6. Повстян O.B. Мембранні механізми дії апаніну на іонні струми гладеньком’язової клітини: Дис... канд. біол. наук: 03.00.02. -К., 2000. - 166 с.
7. Aminova G. G. The cecum lymphoid structure in preterm and full term newborns // Morfology. -2000. - Vol. 118, № 5. -P. 42-45.
8. Lawrence H.S. The cellular transfer of cataneous hypersensitivity to tuberculin in man // Proc. Soc. Exp. Biol. and Med.- 1949. - Vol. 71, № 2.-P. 516.
9. Burger D.R., Vandenbark A.A., Vetto R.M., Klesius P. Human Transfer Factor specificity and structural models // Immunobiology of Transfer Factor. - New York: Acad. press.- 1983.- P. 33-42.
10. Голєва О.Г., Любченко TA., Холодна Л.С., Bершигора
A. Ю. Одержання фактора переносу гіперчутливості сповільненого типу морських свинок до антигенних субстанцій Staphylococcus aureus // Фізіол. журн. - 1996.
- Т. 42, № 5-6. - С. 58-64.
11. Любченко TA. Імунобіологічна активність фактора переносу імунної реактивності, індукованого бактеріальними антигенами: Дис... канд. біол. наук: 14.03.08. -Київ, 1999. - 150 с.
12. Стафилококк /Смирнов B.B., Bершигора AM., Bасюренко З.П., Горшевикова ЄЛ., Дізик Г.М., Овод
B.B., Пастер Б. У., Позур B.K, Співак Н.Я., Черная Л.Н., Чеусова 3.B., Чуркина Л.Н.- К.: Наукова думка-, 1988.247 с.
13. Franklin D., Lowy M.D. Staphylococcus aureus infections // The New England J. Med.. -1998. -Vol. 339, № 8. -P. 520-532.
14. Kohda M., Komori S., Unno N., Ohashi H. Carbachol-induced oscillations in membrane potential and [Ca2+]i in guinea-pig ileal smooth muscle cells // J. Physiol. - 1998. -Vol. 511. - P. 559 - 571.
15. Saida K. Intracellular Ca2+ release in skinned smooth muscle // J. Gen. Physiol. - 1982. - Vol. 80, № 1. -P. 191 - 202.
16. Bremel R.D., Weber A. Calcium bilding to rabbit skeletal myosin under physiological conditions // BBA. - 1975. -Vol. 376, № 2. - P. 366 - 374.
17. Костерин CA., Курский М.Д., Зимина B.П., Браткова Н.Ф. Вклад систем Мg2+ и Са2+-зависимого транспорта Са2+ в регуляцию его концентрации в клетках миометрия // Биохим. журн. - 1984. - Т. 49, № 1. -
C. 12 - 19.
18. Ризниченко Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии . - В кн.: Регулярная и хаотическая динамика.
- Москва-Ижевск, 2002. - 220 c.
19. Костюк П.Г., Зима BM., Магура І.С., Мірошниченко М.С., Шуба М.Ф. Біофізика, Київ. Вища школа. 2001. -544 с.
Са2+- И Са2+-КАЛЬМОДУЛИН ЗАВИСИМОЕ СОКРАЩЕНИЕ СКИНИРОВАННЫХ ГЛАДКИХ МЫШЦ И ЕГО МОДЕЛИРОВАНИЕ
Давидовская Т.Л., Мирошниченко Н.С., Цимбалюк О.В., Иванов А.Я., Нурищенко Н.Е.
Установлена зависимость величины напряжения скинированных сапонином тонких (100-150 мкм) гладкомышечных полосок кольцевых гладких мышц слепой кишки морских свинок от концентрации ионов кальция в активирующем растворе. Показано, что кальмодулин усиливает чувствительность сократительного аппарата мышц caecum к этим катионам. Построена математическая модель, которая описывает экспериментальные результаты по изменению силы мышечного сокращения скинированных гладких мышц во времени.
Ключевые слова: скинированные ГМК, кальмодулин, моделирование, Са2+.
Са2+- AND Са2+-САЬМОБиЬШ DEPENDENT CONTRACTION OF SKINNED SMOOTH MUSCLES AND ITS MODELLING
Davidovska T.L., Miroshnichenko M.S., Tsymbalyuk O.V., Ivanov O.Ya., Nurishchenko N.Ye.
Dependence of contraction value of a saponine skinned thin (100-150 microns) smooth muscle strips of guinea pig caecum circular smooth muscles from concentration of calcium ions in an activating solution is established. It is shown, that calmodulin strengthens sensitivity of muscle contractive apparatus to these ions. The mathematical model which describes experimental results on change of force of skinned smooth muscles contraction in time is constructed.
Key words: skinned SMC, calmodulin, modelling, Ca2+
