CC BY
85
УДК 579.62: 579.63
АНАЛИЗ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ STAPHYLOCOCCUS SPP., ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ОБЪЕКТОВ МОЛОЧНЫХ ФЕРМ
1 А. Н. БЕРГИЛЕВИЧ, 2 И. Н. ЛОЦКИН, 1 П. А. ШУБИН, 1И. В. ВОРОБЕЙ, 1 А. В. СТЕБЛЕВСКАЯ
1Сумской государственный университет, г. Сумы, Украина, 40018
2Сумской национальный аграрный университет, г. Сумы, Украина, 40021
(Поступила в редакцию 17.02.2017)
Резюме. В статье представлены результаты распространения антибиотико-устойчивых Staphylococcus spp. в объектах окружающей среды молочных ферм в Сумской области (Украина).
Установлено, что в таких объектах молочных ферм, как навоз и подстилка находятся антибиотикорезистентные Staphylococcus spp., которые проявляют высокую резистентность к пенициллину, олеандомицину, неомицину, левомицетину, стрептомицину, гентамицину, тетрациклину. Среднюю степень устойчивости изоляты проявляли к эритромицину, оксациллину, рифимпицину, ванкомицину, амоксициллину, малую устойчивость или неустойчивость — к энрофлоксацину, линкомицину, цефазолину. В почве окружающей среды молочных ферм антибиотикорезистентные Staphylococcus spp. в большем количестве находятся на расстоянии 5—10 м от фермы и в меньшем количестве на расстоянии 50 м. Результаты этих исследований будут способствовать эффективной разработке новых подходов к лечению животных, внедрению строгого учета применяемых антибиотиков и применению новых методов борьбы с антибиоти-корезистентными бактериями.
Ключевые слова: антибиотикорезистентность, Staphylococcus spp., объекты молочных ферм, антибиотики.
Summary. The article examines the impact of the spread of antibiotic-resistant Staphylococcus spp. in the environment of dairy farms in Sumy region (Ukraine).
Set that in such objects of dairy farm as animal dung and feases antibiotic-resistant Staphylococcus spp. were presented, which had a high resistance to penicillin, oleandomycin, neomycin, chloramphenicol, streptomycin, gentamicin, tetracycline. All this isolates had average degree of resistance to erythromycin, oxacillin, rifimpitsinu, vancomycin, amoxicillin, and low stability or instability - to enrofloxacin, lincomycin, cefazolin. In the samples of surrounding soil medium from dairy farms the antibiotic-resistant isolates of Staphylococcus spp. were presented in greater numbers in samples at a distance of 5—10 m from the farm and to a lesser extent at a distance of 50 m. The results of these studies will contribute to the effective development of new approaches to the treatment of animals, implementation of strict accounting used antibiotics and the use of new methods to combat antibiotic-resistant bacteria.
Key words: antibiotic resistance, Staphylococcus spp., objects of dairy farms, antibiotics.
Введение. В Украине сектор производства молока и молочных продуктов является одним из важных в структуре экономики, который
обеспечивает существенные поступления в бюджет страны и имеет большую перспективу в международной торговле.
Общепризнано, что аграрный сектор и, в том числе, производство животноводческой продукции имеют существенные отрицательные воздействия на состояние окружающей среды в течение всего жизненного цикла продукции. Среди негативных факторов, влияющих на окружающую среду, важное место занимают такие биологические загрязнители, как микроорганизмы, которые могут вызвать заболевания у людей. К основным отходам животноводческих ферм, которые потенциально содержат патогенные бактерии, относятся фекалии, моча животных, молоко маститных коров, навоз, вода, используемая в технологическом процессе. Стоки в молочном скотоводстве включают в себя сырой навоз, необработанную суспензию (смесь навоза, мочи, кала и воды) в которых содержится много бактерий. В отходах животноводческих ферм могут быть патогенные стафилококки, стрептококки, листерии, кампилобактерии, иерсинии, клостридии и др. Патогенные микроорганизмы из животноводческих ферм могут вместе со стоками попасть в местное водоснабжение во время дождей. Кроме того, указанные микроорганизмы с грунтовой пылью и осадками загрязняют воздух и грунтовые воды. Ситуация осложняется тем, что в результате широкого использования антибиотиков в животноводстве, появились антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов.
По данным ВОЗ, ежегодно в странах ЕС более 25000 человек умирают от инфекций, вызванных антибиотикорезистентными бактериями. Поскольку эта устойчивость не имеет экологических, отраслевых или географических границ, ее появление в одной отрасли или в одной стране приводит к формированию резистентности бактерий в других отраслях и в других странах [4]. Поэтому проблема распространения антибиотико резистентных штаммов микроорганизмов в последнее десятилетие приобрела особую остроту, и ее решение очень актуально. Одним из путей решения этой проблемы является изучение распространения этих микроорганизмов в окружающей среде, и особенно в животноводстве, где уровень применения антибиотиков особенно высок.
Анализ источников. Антибиотики произвели революцию в лечении инфекционных болезней у людей. Однако, их широкое и не всегда правильное применение привело к возникновению и распространению устойчивости к антибиотикам. Человечество впервые столкнулось с проблемой резистентности бактерий к антимикробным средствам практически одновременно с открытием антибиотиков. В первые годы после открытия пенициллина около 99 % патогенных стафилококков
были чувствительны к этому антибиотику, а в шестидесятые к пенициллину остались чувствительны уже не более 20-30 % [1, 4, 5, 7]. Учеными было доказано, что генетические детерминанты устойчивости в таких обычных для организма животных микроорганизмов, как кишечная палочка, энтерококки могут быть переданы путем обмена плазмид, через транспозоны патогенных микроорганизмов, последние из воздуха, воду и пищу попадают в организм человека и вызывают заболевание [4, 9].
В развитых странах большую обеспокоенность вызывает негативное влияние применения антибиотиков в животноводстве на здоровье человека. В США, странах ЕС, Канаде разработаны государственные программы по изучению антибиотикорезистентных микроорганизмов окружающей среды и разработке соответствующих предупреждающих мероприятий. Ученые акцентируют большое внимание на том, что лечение многих болезней людей осложняется из-за приобретенной анти-биотикоустойчивости бактерий [1, 2, 4, 10].
Одним из основных загрязнителей окружающей среды антибиоти-корезистентными микроорганизмами являются отходы животноводческих ферм, которые могут нести биологическую опасность как для окружающей среды, так и для здоровья людей. В результате производства животноводческой продукции в окружающую среду попадает большое количество микроорганизмов, в том числе патогенных, что способствует распространению и циркуляции их антибиотикорези-стентных видов, которые в свою очередь могут быть угрозой для здоровья человека. Антибиотики для животных, в том числе молочных коров, применяются для лечения и профилактики болезней, а также с кормами, что способствует развитию антибиотикорезистентности у микроорганизмов и передачи генов резистентности через пищевую цепь (с сырьем или продуктами животного происхождения) как от сельскохозяйственных животных, так и с объектов окружающей среды (вода, почва) к людям [4, 7, 9].
Наиболее распространенными микроорганизмами на молочных фермах являются стафилококки, которые поступают в окружающую среду от больных маститом коров. Стафилококки устойчивы в окружающей среде, хорошо переносят высушивание. Основные пути передачи возбудителя - воздушно-капельный, контактный и пищевой. Загрязнение стафилококками является главной причиной заболеваний, вызванных потреблением пищевых продуктов в мире. При пищевом пути заражения важными факторами передачи являются молоко и молочные продукты. К настоящему времени описано 19 видов стафило-
кокков, изолированных от животных и человека [3, 5]. Основная роль в инфекционной патологии животных и человека принадлежит S. aureus. Возбудителями стафилококковых инфекций могут быть также S. epidermidis и S. saprophyticus. Стафилококки характеризуются множественной лекарственной устойчивостью, среди них много штаммов резистентных к антибиотикам [8].
ВОЗ на основе научных данных по антибиотикорезистентности с целью охраны здоровья и окружающей среды разработаны рекомендации по организации исследований для изучения уровня распространения стойких к антибиотикам бактерий в окружающей среде, в том числе в объектах животноводческих ферм для того, чтобы эффективно разрабатывать профилактические меры [10, 11].
В Украине проблему антибиотикорезистентности бактерий только недавно обратили внимание на государственном уровне, как на важную и широкомасштабную, что характеризуется разработкой проектов законодательных документов по мониторингу антибиотикорезистент-ных микроорганизмов как у животных, так и у людей. Такие исследования должны проводится регулярно, чтобы иметь возможность анализировать тенденции и своевременно разрабатывать соответствующие мероприятия. Вышеуказанное свидетельствует о важности и актуальности проведения исследований устойчивости к антибиотикам микроорганизмов и, в том числе Staphylococcus spp., которые распространяются от животноводческих ферм. В связи с широким распространением стафилококков, резистентных к лекарственным препаратам, и относительно небольшим количеством научных данных по этой проблеме в Украине, считаем важным изучение этого вопроса
Цель работы - изучить распространение антибиотикоустойчивых Staphylococcus spp. в объектах окружающей среды молочных ферм в Сумской области.
Материал и методика исследований. Материалом для исследований были пробы навоза (18), почвы (22) с и пробы подстилки (12) с 4-х молочных ферм Сумской области. Навоз отбирали в коровниках. Пробы почвы отбирали на разном расстоянии от зданий ферм (5 м, 10 м и 50 м). Пробы навоза и подстилки отбирали непосредственно на ферме. Для выделения стафилококков использовали желточно-солевой агар. Для определения антибиотикочувствительности бактерий использовали диско-диффузный метод по МУ 9.9.5-143-2007 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». При проведении анализа степени антибикоустойчивисти выделенных изолятов микроорганизмов использовали критерии, которые приведены в табл. 1.
Т а б л и ц а 1. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к антибиотикам Staphylococcus spp. Пограничные значения диаметров зон подавления роста (мм)
Антибиотики Содержание антибиотика в диске Диаметр зоны задержки роста, мм
резистентный умеренный чувствительный
Пенициллины
Бензилпенициллин 10 Ед <27 - >29
Aмоксициллин, AMX10 10 мкг
Цефалоспорины
Цефазолин, CZ 30 30 мкг <13 14-17 >18
Аминогликозиды
Канамицин, 30 мкг <13 14-17 >18
Гентамицин, GEN10 10 мкг <12 13-14 >15
Гликопептиды
Ванкомицин, VA 30 30 мкг >15
Тетрациклины
Тетрациклин, TE30 30 мкг <14 15-18 >19
Линкозамиды
Линкомицин L15 15 мкг <17 16-20 >21
Макролиды
Эритромицин E15 13 мкг <17 16-23 >21
Другие препараты
Рифампицин 15 мкг <16 17-19 >20
Было подобрано 90 изолятов Staphylococcus spp. для определения чувствительности к 17-ти антибиотикам.
Результаты исследований и их обсуждение. Для исследований было сформировано 3 группы изолятов Staphylococcus spp.: из почвы, из навоза и с подстилки. В каждой группе было по 30 изолятов. Результаты исследований антибиотикорезистентности изолятов Staphylococcus spp. представлены в нижеприведенной табл. 2.
Т а б л и ц а 2. Результаты исследований антибиотикорезистентности изолятов
Staphylococcus spp.
Антибиотики Грунт Навоз Подстилка
количество чувствительных изолятов/% количество нечувствительных изолятов /% количество чувствительных изолятов / % количество нечувствительных изолятов /% количество чувствительных изолятов /% количество нечувствительных изолятов /%
Эритромицин 9/ 30,0 21/70,0 7/ 23,3 23/76,7 8/ 26,7 22/73,3
Оксациллин 8/ 26,7 22/73,3 6/ 20,0 24/80,0 7/ 23,3 23/76,7
Энрофлоксацин 25/83,3 5/ 16,7 20/ 6,7 10/33,3 24/80,0 6/ 20,0
Линкомицин 22/73,3 8/ 26,7 20/66,7 10/33,3 9/ 30,0 21/30,0
Рифимпицин 12/40,0 18/60,0 10/33,3 20/66,7 10/33,3 20/66,7
Ванкомицин 24/80,0 6/ 20,0 22/73,3 8/ 26,7 9/ 30,0 21/30,0
Энрофлоксацин 29/96,7 1/3,33 28/93,3 2/6,7 28/93,3 2/6,7
Тетрациклин 5/ 16,7 25/83,3 3/ 10,0 27/90,0 4/ 13,3 26/86,7
Гентамицин 5/ 16,7 25/83,3 3/ 10,0 27/90,0 4/ 13,3 26/86,7
Стрептомицин 6/ 20,0 24/80,0 4/ 13,3 26/86,7 5/ 16,7 25/83,3
Амоксициллин 19/63,3 11/36,7 16/53,3 14/46,7 18/60,0 12/40,0
Цефазолин 30/100 0 29/96,7 1/3,33 29/96,7 1/3,33
Энроксил 29/96,7 1/3,33 28/93,3 2/6,7 29/96,7 1/3,33
Левомицетин 7/ 23,3 23/76,7 4/ 13,3 26/86,7 4/ 13,3 26/86,7
Пеницилин 3/ 10,0 27/90,0 2/ 6,7 28/93,3 2/ 6,7 28/93,3
Неомицин 5/ 16,7 25/83,3 3/ 10,0 27/90,0 3/10,0 27/90,0
Олеандомицин 6/ 20,0 24/80,0 4/ 13,3 26/86,7 4/ 13,3 26/86,7
Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что большая часть изолятов Staphylococcus spp. проявляли высокую устойчивость к таким антибиотикам: пенициллин, олеандомицин, неомицин, левомицетин, стрептомицин, гентамицин, тетрациклин. Эти антибиотики чаще всего используются для лечения коров. Среднюю степень устойчивости изоляты Staphylococcus spp. проявляли к следующим антибиотикам: эритромицин, оксациллин, рифимпицин, ванкомицин, амоксициллин. Малоустойчивыми или неустойчивыми были изоляты к энрофлоксацин, линкомицин, цефазолин. Больше устойчивых изолятов Staphylococcus spp. мы обнаружили в пробах из навоза и подстилки. Из почвы устойчивые изоляты выделялись чаще из проб, отобранных на расстоянии, близком к ферме. Необходимо отметить, что все исследуемые штаммы были нечувствительны к пенициллину, поскольку зона задержки роста к этому антибиотику была наименьшей среди всех исследуемых антибиотиков, и в среднем ее диаметр составлял 8 ± 2 мм.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в таких объектах молочной фермы, как почва, навоз, подстилка содержатся антибиоти-корезистентные штаммы Staphylococcus spp., которые проявляют устойчивость к тем антибиотикам, которые часто применяются для лечения животных. Наши исследования согласуются с выводами большинства зарубежных ученых [2, 4, 7, 9], которые утверждают, что большое количество бактерий попадает в окружающую среду с отходами от животных к людям: E. coli, Salmonella spp., L. monocytogenes, Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica, B. cereus, S. aureus и др. Среди этих бактерий особо важное значение имеют Staphylococcus spp., поскольку среди них есть патогенные [9]. Антибиотикорези-стентные бактерии являются серьезной проблемой для охраны здоровья людей, так как инфекции, вызванные этими организмами, трудно поддаются лечению. Поэтому важной проблемой для решения является изучение уровня контаминации окружающей среды животноводческих ферм антибиотикорезистеными бактериями и в том числе Staphylococcus spp.
В большинстве развитых стран подтверждено негативное влияние применения антибиотиков в животноводстве на здоровье человека в результате появление антибиотикорезистентных бактерий. Невозможно противостоять угрозе от антибиотикорезистентности микроорганизмов без знания характеристик устойчивых к антибиотикам бактерий. Для развития таких знаний крайне важно проводить целевые исследования, чтобы лучше понять эпидемиологию резистентности к противомикробным препаратам у людей и животных. К сожалению, в настоящее время в Украине исследований по устойчивости к антибио-
тикам микроорганизмов в животноводстве очень мало и поэтому выбранное нами научное направление актуально. Результаты таких исследований будут способствовать эффективной разработке новых подходов к лечению животных, внедрению строгого учета применяемых антибиотиков и применению новых методов борьбы с антибиотикоре-зистентными бактериями.
Заключение. Определено, что в таких объектах молочных ферм как навоз и подстилка находятся антибиотикорезистентные Staphylococcus spp., которые проявляют высокую резистентность к таким антибиотикам, как пенициллин, олеандомицин, неомицин, ле-вомицетин, стрептомицин, гентамицин, тетрациклин. В почве окружающей среды молочных ферм антибиотикорезистентные Staphylococcus spp. в большем количестве находятся на расстоянии 5-10 м от фермы и в меньшем количестве на расстоянии 50 м.
ЛИТЕРАТУРА
1. Борьба с устойчивостью к антибиотикам с позиций безопасности пищевых продуктов в Европе // Европейское региональное бюро ВОЗ. - 2011. - 106 p.
2. Andersen, J. K. New strategies for the use of microbiological examination in food control in Denmark / J. K.Andersen, T. Hald, N. L. Nielsen, C. S. Fiedler, B. Nrrung// Food Control. - 2007. - №18 (3). - Р. 273-277.
3. Anderson, K. L. Persistence and differential survival of fecal indicator bacteria in subtropical waters and sediments / K. L. Anderson, J. E. Whitlock, H. V. Jarwood // Appl. and Environ. Microbiol. - 2005. - №71(6). - P. 3041-3048.
4. Costa, E. O. Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus spp. isolated from mammary parenchymas of slaughtered dairy cows / E. O.Costa, N. R. Benites, J. L. Guerra, P. A. Melville // Zentbl. Veterinarmed. - 2000. - № 47. - P. 99-103.
5. Quinn, P. J. Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Staphylococcus species. / P. J. Quinn, B. K. Markey, F. C. Leonard, E. S. Fitzpatrik, S. Fanning, P. J. Hartigan // 2d ed., Willey-Blackwell, West Sussex. UK. - 2013. - P. 179-187.
6. Regecovâ, I. Determination of sensitivity of Staphylococcal isolates from fish meat against selected antibiotics / I. Regecovâ, M. Pipovâ, P. Jevinovâ, P. Popelka, I. Kozârovâ. // Folia Veterinaria. - 2009. - № 53. - P. 37-39.
7. Schwarz, S. Use of antimicrobials in veterinary medicine and mechanism if resistance / S. Schwarz, D. E. Chaslus // Vet. Res. - 2001. - № 32. - P. 201-225.
8. Sergelidis, D. Isolation of methicillin-resistant Staphylococcus spp. from ready-to-eat fish products / D. Sergelidis, A. Abrahim, T. Papadopoulos // J. Appl. Microbiol. -2014. -№ 59 (5). - P. 500-506.
9. Tebbutt, G. M. Does microbiological testing of foods and the food environment have a role in the control of foodborne disease in England and Wales? / G. M. Tebbutt // J. Appl. Microbiol. - 2007. - № 102 (4). - P. 883-891.
10. WHO. 2009. Food safety and food borne illness. Factsheets of the Programmes and Projects of WHO. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs237/en/.
11. WHO Global Principles for the Containment of Antimicrobial Resistance in Animals Intended for Food. Report of a WHO Consultation with the participation of the Food and Agriculture Organization of the United Nations and the Office International des Epizooties, Geneva, Switzerland, 5-9 June 2000. Geneva, WHO, 2000. - 120 p.
