CC BY
0INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
А-АМИЛАЗА ФЕРМЕНТИ ФАОЛЛИГИНИ ИНГИБИРЛОВЧИ ТАЪСИРГА ЭГА ПРОБИОТИКЛАРНИ
ТАНЛАШ
1Бекмуродова Гуллола Амировна, 2Амирсаидова Дилдора Аминжановна, 3Гайипов Улугбек, 4Гайипов Сабина, 5Миралимова Шахло Миржамаловна
1кичик илмий ходим, PhD, 2кичик илмий ходим,3катта илмий ходим, к.ф.н, 4катта илмий ходим, к.ф.н, 5етакчи илмий ходим, профессор https://doi.org/10.5281/zenodo.13832933
Аннотация. Кандли диабет гипергликемия билан характерланадиган метаболик касаллик булиб, у инсон саломатлиги ва ижтимоий ривожланишига катта таъсир курсатади. Кандли диабетда ичак микробиотасини меъёрлаштириш, диабетнинг олдини олиш ва тезкор даволаш учун мууимдир. а-амилаза ферментини ингибирлаш орцали асоратларини кечиктириш мумкин. Тадцицотда L. plantarum TK1, L. plantarum KA 3, L. plantarum mal, L. kunkeeil ва E. faeciuml сут ачитувчи бактерия штаммларининг цуритилган массаси
а-амилаза ферменти фаоллигига самарали ингибирловчи таъсир курсатди. Улар диабетга царши компанентларнинг потенциал манбаи булиб, келажакда антидиабетик хусусиятларга эга пробиотик сифатида ишлатилиши мумкинлиги аницланди.
Калит сузлар: диабет, гипергликемия, ичак микрбиотаси, сут ачитувчи бактерия, пробиотик, а-амилаза, ингибирловчи фаоллик.
^андли диабет гипергликемия билан характерланадиган метаболик касаллик булиб, у инсон саломатлиги ва ижтимоий ривожланишига катта таъсир курсатади [1]. Гипогликемик воситаларнинг ножуя таъсири, киммат дори воситалари билан диабетни даволашни янги усулларини ёки янги дори воситаларини ишлаб чикарилишини талаб килади. Сунгги йилларда гипогликемик таъсирга эга табиий мах,сулотларни топишга кизикиш ортиб бормокда. Олимларнинг таъкидлашича, 2-тоифа диабетни даволашнинг самарали усулларидан бири овкат хдзм килиш органларида а-глюкозидаза ва а-амилаза каби карбонгидрат гидролизловчи ферментларни ингибирлаш, глюкозанинг узлаштирилишини кечиктириш, 2-тоифа диабет ва кондаги канд микдорини бошкаришнинг мух,им стратегияси булиши мумкин [2]. In vitro ва in vivo тажрибаларда антрокинонол, докосанол, тетракосанол, рутин ва актинодафнинларнинг ферментлар фаоллигини ингибирлаш патенциалига эгалиги тасдикланган [3]. Ушбу воситалар кон глюкозасини сусайтиришда самарали булса-да, дорилардан доимий равишда фойдаланиш кутилмаган таъсирларни юзага келтириши мумкин. Шу сабабли, табиий а-глюкозидаза ва а-амилаза ингибиторларига эх,тиёж бор.
Сунгги тадцицотларда ичак микробиотасидаги аномалия диабетнинг ривожланишини рагбатлантириши аницланган. Кандли диабетда ичак микробиотасини меъёрлаштириш, диабетнинг олдини олиш ва тезкор даволаш учун мущмдир [4, 5, 6]. Ичак микробиотаси бактерияларидан Lacticaseibacillus paracasei а-амилаза, а-глюкосидаза ва дипептидил пептитаза 4 ферментларини самарали ингибирлаш хусусиятга эга [7].
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
Limosilactobacillus fermentum BGIT, Lactiplantibacillus plantarum BGIT ва Bifidobacterium asteroids штаммларида щм а-амилазани самарали ингибирловчи таъсири аницланган [8]. Бошца бир тадцицотда келтирилишича, Lactobacillus casei а-амилазани самарали ингибирловчи таъсири сабабли 2-тоифа диабетга царши антигипергликемик восита сифатида тавсия цилинган [9].
Алфа-амилаза ферменти (а-амилаза) диабет билан огриган беморларда диабетга чалинмаган инсонларга Караганда купайганлиги кузатилган ва диабетни ташхислаш учун ишлатилиши мумкин. а-амилаза ферменти таъсирида кондаги глюкоза концентрацияси кутарилади ва инсулин хужайраларга кушимча глюкозани хазм килиш ва энергия манбалари (яъни гликоген) сифатида саклаш учун сигнал бериши оркали жавоб беради. Бирок, баъзи холларда, хаддан ташкари а-амилаза ферменти фаоллигининг ортиши, инсулин ва глюкоза мувозанатини бузилишига олиб келади ва гипергликемияни келтириб чикаради [10]. Ичакдаги а-амилазани ингибирлаш постпрандиал гипергликемияни бошкаришга ва айланма глюкоза даражасини назорат килишга ёрдам беради. Шу муносабат билан диабетик асоратлар а-амилаза ферментини ингибирлаш оркали кечиктирилиши мумкин [11, 12].
Ушбу тадкикот максади сут ачитувчи бактерия пробиотик штаммларининг а-амилаза ферментини ингибирлаш фаоллигини аниклаш.
Тадкикотда антидиабетик таъсирга эга доривор усимликлардан ажратилган пробиотик бактерия штаммларидан фойдаланилди. Барча штаммлар УзРФА Микробиология институти "Пробиотиклар микробиологияси ва биотехнологияси" лабораторияси коллекциясида -800С да сакланади.
Тадкикот усуллари. Карбогидрат алмашинувининг асосий ферменти а-амилазани ингибирлаш фаоллиги пробиотик сут ачитувчи бактерия (ПСАБ) штаммларининг културал суюклиги ва лиофил куритилган массасида урганилди.
Бактерияларни културал суюк^икларини тайёрлаш. Музлатилган стокда сакланган бактериялар 10 мл МРС (де Ман Рогоза Шарпе) булонга 100 мкл инокуляция ва 24 соат 370С да инкубация килинди. Х,ар бир ПСАБ икки марта кайта тикланди, хужайралар центрифуга ёрдамида културал суюкликдан ажратилди (4°C да 10 дакика давомида 7500*g) ва стерил Рингер эритмаси
билан ювилди. Хужайралар кайта центрифугалаш оркали йигиб олинди (4°C да 15 дакика давомида 12000xg) ва 5 мл дистилланган сувда кайта суспензия килинди. Суспензиядаги ПСАБ сони McFarland стандарти буйича 6 log (КОЕ/мл) (108) га тенглаштирилди.
а-амилаза ферменти суспензиясини тайёрлаш. а-амилаза ферментини олиш учун катталиги 80-100 гр булган сичкон корин бушлигидан ажратилган ошкозон ости бези ёги тукимасидан тозаланди, массаси аникланди ва 400/дак айланиш тезлигидаги тефлон пестли шиша гомогенизаторида майдаланди. Олинган гомогенат 15 дакика 3000 rpm цетрифугаланди. а-амилаза саклаган суспензия тажрибалар учун олинди ва музда сакланди. Намуналарнинг ингибитор фаоллиги А.М. Уголев усули ошкозон ости бези ва ингичка ичак гомогенати а-амилазасига таъсири протоколи асосида аникланди [13]. Тукималардаги оксил микдори Лоури усулида текширилди [14].
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
САБ културал суюкликлари ва цуруц массасининг а-амилаза ферментинининг ингибирловчи фаоллигини аницлаш. ПСАБ нинг куритилган 1 гр массаси (109Х,БК/мл) массаси 10 мл дистилланган сувда эритиб тайёрлаб олинди. ПСАБ нинг културал суюклиги ва курук массанинг эритмасидан
100-400мкл/мл-1 га тенг турли микдорларига 1 мл крахмал эритмасига кушилди ва 10 дакикага хона хароратида тутиб турилиб, сунгра 500 мкл амилаза ферменти (а-амилаза саклаган суспензия) эритмаси, 1 мл Рингер эритмаси кушилиб 25оС да 10 дакика хона хдроратида, 5 дакика сув хаммомида инкубация килинди. Реакция аралашмаси хона хароратига кадар совитиб, 10 мл дистилланган сув кушилиб суюлтирилди. а-амилаза ингибитор фаоллиги 540 нм да спектрофотометр ёрдамида улчанди ва куйидаги формула буйича намуналарнинг ингибирловчи фаоллиги хисобланди: Ингибитор фаоллиги = (1-B/A)x100% Бу ерда: А = назоратнинг адсорбцияси,
В = реакция аралашмасининг адсорбцияси Назорат сифатида ошкозон ости бези гомогенезатидан фойдаланилган (крахмални парчалашига асосан фермент микдори хисобланган). Олинган натижалар ва уларнинг тахлили.
Ошкозон ости бези ва ингичка ичак гомогенати суспензиясида а-амилаза фермент микдори тахминан 80,1±2.4 мг/мин/мг/оксил га тенг.
ПСАБ штаммларининг лиофил куритилган массасида ва културал суюкликларида самарали ингибирланиши кузатилди (1-жадвал).
1-жадвал
ПСКБ ларнинг а-амилаза ферментини ингибирланиш фаоллиги
а- амилазани ингибирланиши, (%)
№ СКБ штаммлари Лиофил куритилган Културал суюклик
массаси
1 Назорат 100
2 L. plantarum TK1 33.33 83,3
3 L. plantarum KA 3 38.61 84,3
4 L. plantarum mal 11,34 83,8
5 А. kunkeeil 38,5 83,8
6 E. faeciuml 35,75 82,9
7 E. durans 25,07 -
8 L. rhamnosus 925 16,6 -
9 E. faecium R3 18,30 80,3
10 L.plantarum TK2 25.08 81,8
ПСАБ штаммларнинг углевод алмашинуви ферменти а-амилазани ингибирлаш салохияти куритилган масса эритмаларида L. plantarum TK1, L. plantarum KA 3, L. kunkeeil ва E. faeciuml штаммларида да 30% дан юкори (мос равишда 33.33%, 38.61%, 38,5% ва 35,75), E. durans ва L.plantarum TK2 штаммларида 25%дан юкори (мос равишда25,07% ва 25.08%), L. rhamnosus 925 ва E. faecium R3 штаммларида 15% дан
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" 25-26 SEPTEMBER, 2024
юкори (мос равишда 16,6% ва 18,30%) ва L. plantarum mal штаммида энг паст курсатгич (11,34%) кайд этилди.
Текширилган ПСАБ бактерияларнинг културал суюкликларида барча штаммларнинг а-амилаза ингибирлаш фаоллиги 80% дан юкори эканлиги аникланди.
САБ штаммлари томонидан а-амилаза фаоллигини ингибирлаш механизми бактерияларнинг узига хос штамми ва турларига караб фаркланиши мумкин. САБ ингибирловчи метоболитлари крахмат молекулаларини парчаланишига йул куймаслиги [15], САБ томонидан ишлаб чикарилган сут кислотаси [16], ошкозон ичак тракти мухитини рН даражасини пасайтириши (паст ишкорий мухитда оптимал ишлай) [17], САБ мавжуд крахмал субстратлари учун а-амилаза ферменти билан ракобатлашиши каби таъсир механизмлари асосида ферментга ингибирлаш фаоллигини курсатади [18]. Бизнинг тадкикотимизда текширилаётган пробиотик ПСАБ штаммлари мухитнинг рН курсатгичини кислотали килиши ва бу фермент фаоллигининг ингибирланиш таъсирига эга эканлигини курсатди. Ayyash ва унинг хамкасблари томонидан тасвирланган L. reuteri-KX881777, L. plantarum-KX881772 ва L. plantarum-KX881779 изолятлари ва уларнинг сувда эрувчан экстрактлари Huang Z., ва бошк. (2021) [19] тадкикотларидаги Lactobacillus H31 нинг тоза экзополисахарид экстрактига нисбатан а-амилазани ингибирлаш фаоллиги 34% дан баланд эканлигини курсатган [10] Уларнинг тадкикоти шуни курсатдики, ошкозон ости бези а-амилазаси иккита экстракт учун мос равишда тахминан 89,1 ± 2,59% ва 69,2 ± 8,95% га ингибир килган. Бизнинг тадкикотда лиофил куритилган ПСАБ штаммлари ва уларнинг културал суюкликлари
а-амилаза ферментини ингибирлаш юкори фаоллигини курсатди. Жумладан, хужайраларда фаоллик 16,6% дан 38,6% гача кузатилган булса, културал суюкликда эса 80,3% дан 84,3% гача кузатилди.
Хулоса. а-амилаза ферменти фаоллиги синовда фойдаланилган 10 та пробиотик бактерия штаммларининг барчасининг културал суюкликлари 80% дан юкори, куритилган масса холатда текширилганда эса, штаммларда фаркланиш кайд этилиб, L. plantarum TK1 -33,33%, L. plantarum KA3-38,61%,
А. kunkeei1-38,5% ва E. faecium1-35,75% ингибирланиш кузатилган. L. plantarum TK1, L. plantarum KA 3, А. kunkeei1 ва E. faeciuml бактерия штаммлари келажакда антидиабетик хусусиятларга эга пробиотик сифатида ишлатилишга тавсия этилади.
Фойдаланилган адабиётлар руйх,ати:
1. KullerL. H., Velentgas P., Barzilay J., Beauchamp N. J, O'Leary D. H, Savage P. J. Diabetes mellitus: subclinical cardiovascular disease and risk of incident cardiovascular disease and all-cause mortality // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000 Mar;20(3): p 823-9.
2. Tundis R., Loizzo M. R., Menichini F. Natural products as alpha-amylase and alpha-glucosidase inhibitors and their hypoglycaemic potential in the treatment of diabetes: an update // Mini Rev Med Chem 2010 Apr;10 (4): p 315-31.
3. Jirawat R., Chien-Hung Jh. , Lin Shian-Ren et al. Hypoglycemic Efficacy of Docking Selected Natural Compounds against а-Glucosidase and а-Amylase // Molecules. 2018 Sep 5;23(9):2260.
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" 25-26 SEPTEMBER, 2024
4. Heintz-Buschart A., May P., Laczny C. C., Lebrun L. A., Bellora C., Krishna A., et al. Integrated Multi-Omics of the Human Gut Microbiome in a Case Study of Familial Type 1. // Diabetes. Nat. Microbiol. 2016. 2, 16180.
5. Vadder F. De, Grasset E., Manneras Holm L., Karsenty G. et al. Gut Microbiota Regulates Maturation of the Adult Enteric Nervous System via Enteric Serotonin Networks. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018. 115, 6458-6463.
6. Riquelme E., Zhang Y., Zhang L., Montiel M., Zoltan M., Dong W., et al. Tumor Microbiome Diversity and Composition Influence Pancreatic Cancer Outcomes. // Cell 2019 178, 795-806.e712.
7. Wang H., Li L. Comprehensive Evaluation of Probiotic Property, Hypoglycemic Ability and Antioxidant Activity of Lactic Acid Bacteria. // Foods. 2022; 11(9):1363.
8. Ben-Miled H., Benoit-Biancamano M.O., Ben-Mahrez K., et al. Alpha-amylase and alphaglucosidase inhibitory properties, beta-galactosidase activity, and probiotic potential of lactic acid bacteria and bifidobacteria from Apis mellifera intermissa and its products. // World J MicrobiolBiotechnol 39, 2023.р. 205.
9. Obaroakpo J. U., Lu L., Shuwen Zh., Lu J., Zhang C. Potent а-amylase inhibitory activity of sprouted quinoa-based yoghurt beverages fermented with selected anti-diabetic strains of lactic acid bacteria // Food Chemistry, 2019, 299, 124985
10. Ayyash M., Al-Nuaimi A.K., Al-Mahadin S., Liu S.Q. In vitro investigation of anticancer and ACE-inhibiting activity, а-amylase and а-glucosidase inhibition, and antioxidant activity of camel milk fermented with camel milk probiotic: A comparative study with fermented bovine milk. // Food Chem. 2018 Jan 15;239: р. 588-597.
11. Ramu R., Shirahatti P. S., Zameer F., Ranganatha L. V., Nagendra Prasad M. N. (2014). Inhibitory effect of banana (Musa sp. var. Nanjangud rasa bale) flower extract and its constituents Umbelliferone and Lupeol on а-glucosidase, aldose reductase and glycation at multiple stages. S. Afr. J. Bot. 95, 54-63.
12. Ademiluyi A. O., Oboh G., Aragbaiye F. P., Oyeleye S. I., Ogunsuyi O. B. (2015). Antioxidant properties and in vitro а-amylase and а-glucosidase inhibitory properties of phenolics constituents from different varieties of Corchorus spp. J. Taibah Univ. Med. Sci. 10, 278-287.
13. А.М. Уголев. Определение амилолитичкой активности // Иследование пишиваретельного аппарата у человека - Л.: Наука, 1969: с 187-192.
14. Hartree E.F. Determination of protein: A modification of the lowry method that gives a linear photometric response // Analytical Biochemistry, Volume 48, Issue 2, 1972, Pages 422-427, ISSN р. 0003-2697.
15. Wang Y, Wu J, Lv M, Shao Z, Hungwe M, Wang J, Bai X, Xie J, Wang Y, Geng W. Metabolism Characteristics of Lactic Acid Bacteria and the Expanding Applications in Food Industry. Front Bioeng Biotechnol. 2021 May 12;9: 612285.
16. Eiteman M., Ramalingam S. (2015). Microbial production of lactic acid. Biotechnol. Lett. 37 955-972. 10.1007/s10529-015-1769-531. Souza P.M., 2010 Magalhaes P.O. Brazilian J Microbiol. 2010; 41:850-861.
