Актуальные вопросы повышения результативности и воспроизводимости конечных этапов клонального микроразмножения сахарной свёклы Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»



УДК 633.63: 58.085

doi.org/10.24412/2413-5518-2024-6-45-50

Акту

альные вопросы повышения результативности и воспроизводимости конечных этапов клонального

микроразмножения сахарной свеклы

S

С.А. КОРНАЦКИЙ, канд. с/х наук (e-mail: [email protected]) М.В. КУЗЬМИНА, магистрант (e-mail: [email protected]) Российский университет дружбы народов

2 га 3

% к

о

С VO V ГС

I S

31 ° гс т I

гс

гс

о s

5 я

О I-

с га

о I-

а £ о

VO со

з о

Введение

Ввиду высокой экономической и технологической значимости сахарной свёклы ей уделяется повышенное внимание российских учёных и специалистов аграрного сектора. Стало очевидным, что последние десятилетия оказались весьма разрушительными для отечественного семеноводства этой культуры, поставив её промышленное производство в очень сильную зависимость от импорта семян. При определённых обстоятельствах это может привести к крайне негативному эффекту, и, безусловно, сложившаяся ситуация требует соответствующего реагирования, включая активизацию развития селекционных и биотехнологических программ, расширение технических и технологических возможностей учреждений данного профиля. Только в таком случае возможно наращивание объёмов семенного материала отечественного происхождения и укрепление стабильности производства сахара.

Семеноводство сахарной свёклы — процесс сложный, многовекторный, многоуровневый, подразумевающий высокую преемственность в работе селекционеров, а с учётом уникальных схем гибридизации и особых условий содержания маточников в естественных условиях — тем более. Восстановление всех этих, в значи-

тельнои мере утраченных, связей представляет собой важную и масштабную задачу, решение которой в полевых условиях может занять весьма продолжительное время.

В данной ситуации большую значимость в вопросах тиражирования генетически однородного селекционного материала, наращивания объёмов фондов гибридных генотипов могут приобрести методы in vitro, в частности метод клонального микроразмножения [1, 3]. Основные принципы метода уже несколько десятилетий известны как зарубежной, так и отечественной практике и находят применение в отношении многих сельскохозяйственных культур, в том числе сахарной свёклы. Однако в научной литературе преимущественно и подробно освещаются вопросы, связанные с инициацией стерильных культур сахарной свёклы и особенностями пролиферации конгломератов, что сопряжено с обширным опытом гормональной коррекции ростовых процессов [6, 8]. В то же время недостаточно информации о конечных этапах микроразмножения, при реализации которых обычно прибегают к общепринятым подходам для укоренения микрочеренков и адаптации микрорастений [2, 5]. Эффективность происходящих процессов весьма неубедительно подтверждается иллюстративным и табличным ма-

териалом о массовости происходящего и качественных показателях полученных растений. Возможно, это свидетельствует о недостаточной отработке этапов и плохой воспроизводимости результатов, что препятствует разработке полноценной технологии, итогом которой должны были бы стать или адаптированная рассада сахарной свёклы в паллетах с субстратом, или штеклинги — в современных условиях основной материал для закладки семенных насаждений.

Целью настоящего исследования было повышение эффективности получения и доращивания адаптированных микрорастений сахарной свёклы с использованием проточной гидропоники и за-щищённого грунта.

Материалы и методы

Работа выполнена в биотехнологической лаборатории агробио-технологического департамента Аграрно-технологического института Российского университета дружбы народов.

Объектами исследования и материалом для отработки элементов технологии служили гибридные родительские формы сахарной свёклы зарубежного происхождения, предоставленные ГК «Продимекс» (Россия) в виде образцов семян под условными индексами BV1, BV2, BV3, BV4. Для реализации метода in vitro ис-

пользовали питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга. На этапе введения в культуру среда не содержала регуляторов роста и сахарозы, на этапе пролиферации со второго пассажа к составу добавляли 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрации 0,5 мг/л. Перед посадкой на питательную среду семена промывали проточной водой в течение 1 часа, после чего проводили их поверхностную стерилизацию 1%-ным раствором азотнокислого серебра в течение 12 мин. При введении в культуру использовали биологические пробирки ПБ-16х150, для пролиферации — ПБ-22х200 при посадке 1 экспланта или колбы КН-2 объёмом 250 мл — при посадке 3—5 экс-плантов. Длительность очередного пассажа составила один месяц. Материал in vitro культивировали в светокомнате при освещённости 5 тыс. лк, световом дне 16 час и температуре 22—24 °С. В целях адаптации микрорастений использовали специально подготовленные для гидропонной системы пластиковые ящики размером 0,6x0,4x0,04 м (объём 9 л). Сверху

на них устанавливали пластиковые рамки, затянутые нетканым полимерным материалом (лутрасил, 17 г/м2). Перед посадкой растений поверхность материала перфорировали посадочными отверстиями диаметром 3—4 мм. После адаптации микрорастения высадили в паллеты для рассады (мультипла-ты) с ячейками объёмом 0,475 дм3 в увлажнённый субстрат на основе торфа и в первую неделю после посадки в зоне стеблевой части поддерживали влажность воздуха на уровне 90—95 % за счёт увлажняемого тента из лутрасила. При выращивании штеклингов изучали три варианта подкормок адаптированных микрорастений: 1) / минеральных солей по Мурасиге-Скугу — два раза в месяц, 2) нитрофоска 16:16:16 NPK — два раза в месяц, 3) нитрофоска 16:16:16 NPK — один раз в месяц.

Результаты и обсуждение

Прорастание семян различных форм в условиях in vitro выявило определённые различия, по-видимому, обусловленные ге-нотипическими особенностями,

календарными сроками заготовки семян, условиями их хранения и прочими причинами. Различия были отмечены как по динамике прорастания, так и по конечному результату. Наибольшая активность прорастания отмечена у формы BV2 — 70 % (через неделю) и 85 % (через две недели). Формы BV1 и BV4 имели сходный результат прорастания 25—28 % с преимущественным ростом показателя на второй неделе. У формы BV3 в итоге проросло 50 % семян. Полученный материал в виде микрочеренков, у которых была отсечена корневая система вместе с гипоко-тилем, был высажен на среду для размножения с 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л (рис. 1). Данная концентрация ранее нами была признана оптимальной в отношении количества и качества микропобегов.

После двух-трёх пассажей с увеличением количества материала размножение было переведено в колбы объёмом 250 мл, что облегчило работу с конгломератами ввиду их достаточно крупных размеров. Собственно микро-

Рис. 2. Пролиферация материала сахарной свёклы: а — некротизация конгломератов, Ь — нормализация размножения формы BV2 после коррекции состава питательной среды

размножение также выявило очевидные различия в реакции растительного материала на условия культивирования. Негативные эффекты, которые наблюдались на данном этапе, проявились в массовой некротизации культур ближе к окончанию очередного пассажа, а также в их гипергидратации примерно в тот же временной отрезок, причём независимо от изучаемой формы. Установить какую-либо связь между этими явлениями достаточно сложно без дополнительного изучения. Предположительно, некротизация тканей и последующее их почернение могли быть вызваны окислением фенолов. От данного эффекта практически получилось уйти после начала добавления в питательную среду аскорбиновой кислоты в концентрации 10 мг/л. Гипергидратация также в значительной мере была устранена после удвоения дозы хелата железа в составе среды и использования для размещения культур «холодных» полок, т. е. тех, на которых отсутствовало подогревающее светооборудование. Это явление неизбежно имеет место в стеллажных светокомнатах.

В дальнейшем наиболее очевидно проявились уже генотипи-

ческие особенности изучаемых форм. Более всего минеральный состав питательной среды Мура-сиге-Скуга подошёл для формы BV2, конгломераты которой имели стабильный средний коэффициент размножения за пассаж в пределах 6—8 к 1, хорошо развитые листья нормальной формы и цвета (рис. 2).

Материал остальных форм, несмотря на принятые меры, не удалось размножить до объёмов, достаточных для полноценного опыта, и в дальнейшем он был прогрессивно утерян в течение нескольких пассажей. Соответственно, для продолжения их изучения потребуется коррекция состава питательной среды и гормонального фона на стадии размножения.

Первоначальные опыты по укоренению микрочеренков формы BV2 показали их низкую уко-реняемость при неудовлетворительном качестве корней, поскольку они имели нитевидную структуру и недостаточную

механическую прочность. Использование в качестве индукторов ризогенеза индолилмасляной кислоты (ИМК) и нафтилуксус-ной кислоты (НУК) в диапазоне концентраций 0,1—1,0 мг/л не позволило достичь укореняемости более 24%.

Пересадка полученных микрорастений для адаптации к нестерильным условиям была очень трудоёмкой и малоэффективной. В первую очередь проблема была в том, что они имели розеточ-ный вид, а это препятствовало их полноценной фиксации на почвенном субстрате. В связи с этим нами была предпринята попытка дополнить цикл размножения стадией элонгации побегов, для чего в очередном пассаже среду дополнили гиббереллином в концентрации 1,0 мг/л. Очевидного непосредственного эффекта при этом установлено не было, однако влияние регулятора сказалось как последействие в следующем пассаже при посадке микрочеренков на безгормональную среду. Явление оказалось стабильным и позднее неоднократно воспроизводилось при повторах, причём на уровне 85-95 % (рис. 3).

У пересаженных микрочеренков в течение месяца происходило формирование структуры, по на-

Рис. 3. Эффект последействия гиббереллина при посадке микрочеренков на безгормональную среду

№ 6 . 2024 САХАР 47

СПОНСОР НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

ВМА

Рис. 4. Адаптация микрорастений сахарной свёклы на проточной гидропонике: а — растения при посадке, Ь — растения через месяц после посадки

шему мнению и пониманию, равнозначной гипокотилю сеянцево-го растения. Розетки листьев приподнимались над поверхностью питательной среды на 0,5—2,0 см, а к концу второго месяца в базаль-ной части в 70—75 случаях отмечалось ещё и формирование корневой системы, хотя её качество было неравнозначным. Таким образом, нам удалось получить пересадочный материал принципиально иного качества, который гораздо более технологичен на этапе адаптации микрорастений даже с использованием почвенных субстратов. Однако для адаптации нами был опробован ранее хорошо зарекомендовавший себя способ с такими розеточными растениями, как земляника и ананас, и использованием проточной гидропоники [4, 7] (рис. 4).

Как видно на рис. 5, адаптированные микрорастения находятся в хорошей кондиции по степени развития стеблевой части и корневой системы. После высадки их на нестерильный почвенный субстрат потери материала в повторениях составили не более 3—4 %. Тепличный цикл доращивания адаптированных микрорастений иллюстрирует рис. 6.

Результаты опыта по установлению возможности повышения качественных параметров штеклин-гов за счёт использования минеральных подкормок в ходе дора-щивания адаптированных микрорастений представлены в таблице.

По качественным показателям наилучший результат был достиг-

нут в варианте 2. По весу штек-линга и его длине окружности в срединной части различия в сравнении с другими вариантами оказались существенными. Штеклин-ги оказались наиболее выровнены по длине в диапазоне 6,0—8,0 см, колебания веса отмечались в пределах 36,2-84,8 г.

Рис. 5. Внешний вид растений после адаптации на гидропонике

Влияние минеральной подкормки на особенности формирования штеклингов в условиях защищенного грунта

Варианты подкормки микрорастений сахарной свёклы Морфометрический показатель штеклинга

Вес, г Длина, см Окружность, см

1 '/2 МС, два раза в месяц 24,2 5,8 8,9

2 Нитрофоска 16:16:16 ОТК два раза в месяц 54,3 6,8 13,6

3 Нитрофоска 16:16:16 ОТК один раз в месяц 30,2 5,4 9,6

НСР 05 11,3 Fa < F факт теор 2,5

Заключение

В ходе изучения особенностей развития пролиферирующих культур сахарной свёклы удалось получить принципиально новый тип пересадочной единицы, у которой наблюдается морфологическое восстановление утраченного в ходе размножения гипокотиля. Нали-

чие его в совокупности с главным корнем чрезвычайно важно при формировании корнеплода правильной формы. Таким образом, в значительной степени удалось сгладить биологическое противоречие между процессом жизнедеятельности двудольного растения со стержневой корневой системой и

схемой его вегетативного размножения, что позволит существенно повысить качество и однородность получаемых штеклингов для семеноводства. Эффективность адаптации микрорастений в пределах 96—100 % была достигнута на проточной гидропонике.

Список литературы

1. Технология создания реституционных линий сахарной свёклы / Е.Н. Васильченко, Т.П. Жужжа-лова, Т.Г. Ващенко, Е.О. Колесникова // Вестник Воронежского гос. аграрн. ун-та. — 2018. — № 1. — С. 56-64.

2. Васильченко, Е.Н. Вегетативное размножение сахарной свёклы in vitro / Е.Н. Васильченко, Е.О. Колесникова // Сахар. -2019. - № 10. - С. 36-38.

3. Перспективные технологии изолированных тканей в селекци-

№ 6 . 2024 САХАР 49

СПОНСОР НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ

BMA

1

I

ТЕХТКАНЬСЕРВИС

ИМПОРТОЗАМЕЩЕНИЕ: °-

РОССИЙСКИЕ КОМПЛЕКТУЮЩИЕ ДЛЯ ИМПОРТНОЙ ТЕХНИКИ

Мы предлагаем высококачественные

российские комплектующие, полностью совместимые

с оборудованием таких мировых гигантов, как

Putsch Glaß& Wolff Maguin

vi

Специализируемся на капитальном ремонте редукторов и поставке высококачественных комплектующих для жомовых прессов ведущих мировых производителей, таких как

Babbini И MERCIER И Stord

. . . . Компания TTC — ваш идеальным партнер! °-

305023, РФ, г. Курск, ул. Литовская, здание 12 Д, помещение 3 | +7 4712 39 96 17 | [email protected]

онном процессе сахарной свёклы / Т.П. Жужжалова, Е.О. Колесникова, Н.Н. Черкасова, Е.Н. Ва-сильченко // Российская сельскохозяйственная наука. — 2018. — № 6. - С. 13-17.

4. Патент № 2762979 C1, Российская Федерация, МПК A01H 4/00(2006.01). Способ выращивания растений земляники с использованием метода in vitro: за-явл. 16.04.2021 : опубл. 24.12.2021 / Корнацкий С.А., Кузьмина М.В., Голощапова Л.С. ; ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» (РУДН).

5. Федоренко, В.Ф. Современные технологии и оборудование в селекции и семеноводстве отечественных сортов сахарной свёклы / В.Ф. Федоренко, Н.П. Мишу-ров, Т.А. Щеголихина : научный аналитический обзор. - М. : Ро-синформагротех, 2018. — 88 с.

6. Ткаченко, О.В. Эффективность стерилизующих агентов при введении семян сахарной свёклы в условиях in vitro / О.В. Ткаченко // Сахар. - 2023. - № 10. -С. 33-35.

7. Kornatskiy, S.A. Pineapple micropropagation (ananas comosus l. Smooth Cayenne) and plant growth features in the process of adaptation

in hydropoics Pineapple microplants adaptation in hydroponics / S.A. Kornatskiy // Journal of Critical Reviews. - 2020. - № 7 (8). -Pp. 3228-3234.

8. Mezei, S. Sugar Beet Micropropagation / S. Mezei, L. Kovacev, N. Nagl // Biotechnology & Biotechnological Equipment. -2006. - № 20:1. - P. 9-14.

Аннотация. Экспериментально разработаны подходы к получению принципиально нового типа пересадочного материала сахарной свёклы in vitro, обеспечивающие формирование у растений «условного гипокотиля» на уровне 85-95 %. Предложен принцип адаптации микрорастений сахарной свёклы к нестерильным условиям с использованием проточной гидропоники с эффективностью 96-100 %. Ключевые слова: сахарная свёкла, клональное микроразмножение, адаптация, проточная гидропоника, штеклинг.

Summary. Experimentally developed approaches to obtaining a fundamentally new type of sugar beet transplant material in vitro, providing the formation of their «conditional hypocotyl» at a level of 85-95 %. A principle of adaptation of sugar beet microplants to non-sterile conditions using flow hydroponics with an efficiency of 96-100 % is proposed.

Keywords: sugar beet, clonal micropropagation, adaptation, flow hydroponics, steckling.