CC BY
63
ZAF. Renal Fail. — 1995, V.17, № 2, — P.147-153.
40. Rathgeber J., Rath W., Wieding J.U. Anasthesi-ologishe und intensivmedizinische Aspecte der schweren Praeklampsie mit HELLP-Syndrom /An-asth. Intensivther. Notfalemed. — 1990, Bd. 25, № 3, — P.206-211.
41. Samuels Ph., Main E.K., Tomaski A. et al. Abnormalities in platelet antiglobulin tests in preeclamptic mothers and their neonates /Am. J. Obstet. Gv-nec. — 1987, V.157, № 1, — P.109-113.
42. Slianklin D.R., Sibai B.M. Ultrastructual aspects of preeclampsia /Am. J. Obstet. Gynec. — 1990, V.163, № 3, — P.943-953.
43. Sibai B.M., Ramadan M.K., Chari R.S. et al. Pregnancies complicated by HELLP-Syndrome (hemolisis, elevated liver enzymes and low platelets) sub-siquent pregnancy outcome and long-term prognosis /Am. J.Obstet. Gynec. — 1995, V.172, № 1, — P.125-129.
44. Steck T., Würfel W. Die Bedeutung immunolo-gisher faktoren bei der Ätiologie der Schwailger-schaftsinduzirten hypertonie /Zent. bl. Gynak. — 1995, Bd. 117, № 1, — P.3-10.
45. Sullivan C.A., Magann E.F., Perry K.G. et al. The recurrence risk of the syndrome of hemolisis, elevated enzymes, and low platelet (HELLP1 in sub-siquent gestosis /Am. J. Obstet. Gynec. — 1994, V.171, № 4, — *>.940-943.
46. Tai C., Urciuhart R. Grandmultiparity in Mala-sian women /Asia-Oceania. J. Obstet. Gynec. — 1991, V.17, I'M, — P.327-334.
47. Wane Y.P., Walsh S.W., Kay H.H. Placental lipid peroxides and thromboxane are increased and prostacyclin is decreased in women with preeclampsia / Am. J. Obstet. Gynec. — 1992, V.167, № 4,
— P.946-949.
48. Wang Y.P., Walsh S.W., Parnell R. et al. Placental production of nitric oxide and endothelin in normal and preeclamptic pregnancies /Hyperens. Pregnancy. — 1994, V.13, № 2, — P.171-178.
49. Weiner C.P. The role of serotonin in the genesis of hypertension in preeclampsia /Am. J. Obstet. Gynec. — 1987, V.156, № 4, — P.885-888.
50. Welsch H., Krone H.A Mütterliche mortalitat bei HELLP-Syndrom in Bayern 1983-1992 /Zent. bl. Gynäk. — 1994, Bd.116, № 4, — P.202-206.
Summary
The article contains a review of recent data and different viewpoints concerning rehabilitation of women who have experienced EPH-gestosis namely: investigations and clinical outlooks; mechanisms of regression in clinical and laboratorial indexes; the principles and metnods of pathogenetic treatment and rena-bilitation.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616.362:615.9
АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССАХ БИОТРАНСФОРМАЦИИ ДИМЕТИЛНИТРОЗАМИНА И НЕКРОТИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ
Б. Г. Оашгнко
Иркутский государственный медицинский
Резюме. Изучали микросомальныи метаболиям диметилншпрозамина (ДМНА) до формальдегида в условиях воздействия тушителей синглет нога кислорода, ловушек супероксид анион и гидроксил -радикалов.
Метаболиям ДМНА в микросомальных мелібра-нах блокировался ловушками супрроксид-анион-радикалов. Частично он угнетался ловушками гидроксил-радикалов. Результаты обсуждаются в плане участия суперокиси кислорода и гидроксил-радикалов в метаболизме ДМНА и токсическом повреждении печени.
•. і
Повреждения печени при действии гепатот-ропных ядов органической природы связывают с их метаболизмом в монооксигеназной системе, локализованной в микросомальных мембранах гепатоцитов [13-19]. Природа агентов,
университет
повреждающих структурные компоненты клеток, еще дискутируется. Ряд авторов полагает, что ими являются нуклеофильные метаболиты, образующиеся в ходе Ьиотрансформации ядов [12]. Вместе е тем экспериментальные данные убедительно связывают деградацию мемо-ранных структур гепатоцитов с процессами пе-рекисного окисления липидов, активацию которого в клетках наблюдают при развитии токсического гепатита [7-11]. Оба процесса: метаболизм ксенобиотиков в монооксигеназной системе и перекисное окисление липидов, сопряжены с потреблением кислорода, активация которого в микросомах осуществляется цитохромом Р-450 [21]. Такая особенность делала логичным предположение, что гепатонекроген-ное действие ксенобиотиков различной химической природы может реализоваться путем по-
вреждения функций монооксигеназной системы при метаболизме ядов и нарушения процессов утилизации кислорода на уровне его свободно-радикальных, форм.
Образование свободных радикалов кислорода при метаболизме ксенобиотиков неоднократно дискутировалось в литературе [5,10]. С ним же ряд авторов связывал необратимое повреждение внутриклеточных мембран гепатоцитов при воздействии токсических веществ [20]. Вместе с тем вопрос о формах активного кислорода, участвующих в названных процессах, оставался открытым. В качестве интермедиатов в микросомальных процессах оксигенирования в настоящее время рассматривают три претендента: супероксид-анион-радикал (О*), гидроксил-радикал ( ОН) и синглетный кислород ('О,). Ранее на примере интоксикации одним из сильнейших гепатотропных ядов диметил-нитрозамином нами были получены данные, указывающие в пользу предположения о том, что в метаболизме яда и в реакциях, повреждающих мембранные структуры гепатоцитов, кислород может участвовать в форме суперок-сид-анион-радикала [17,18].
В свете сказанного для выявления активных форм кислорода, участвующих в метаболизме ядов и могущих играть ключевую роль в механизме повреждения мембранных структур гепатоцитов, мы исследовали скорость биотрансформации ДМНА в НАДФН-зависимой системе монооксигеназ печени крыс в присутствии веществ, служащих тушителями синглетного кислорода, ловушками гидроксил- или суперок-сид-анион-радикалов и ингибиторами суперок-сиддисмутазы.
Методы и материалы
В работе использовали печень беспородных белых крыс-самцов массой 180-200 граммов. Микросомальные мембраны клеток печени получали с помощью дифференциального ультрацентрифугирования на центрифуге УАС-601 [6]. Инкубацию микросом с ДМНА проводили при 37°С в течение 20 минут. Инкубационная среда содержала 1,5 мг • мл 'белка, 3 мМ НАДФН, 16 мМ М£С1„ и 40 мМ трис • НС1 буфер pH 7,6 [3]. Начальная концентрация ДМНА составляла 6 мМ. Реагенты, участвующие в инактивации или в биохимической утилизации кислорода, вводили в инкубационную среду в концентрациях, указанных в таблице 1. Реакции метаболизма ДМНА запускали введением в инкубационную среду НАДФН. Скорость метаболизма ДМНА в микросомальной системе монооксигеназ оценивали по образующемуся из него в ходе биотрансформации формальдегиду [14]. В эксперименте использовали супероксид-дисмутазу, выделенную из печени интактных крыс [4].
Результаты и обсуждение
При постановке эксперимента мы исходили из положения, согласно которому угнетение метаболизма ДМНА при удалении какого-либо
компонента из инкубационной системы могло быть доказательством участия этого компонента в процессах биотрансформации вещества. Результаты исследования, представленные в таблице 1, показали, что среди кислородмодифи-цирующих веществ способностью угнетать метаболизм ДМНА до формальдегида обладали ловушки супероксид-анион-радикалов адреналин, норадреналин и викасол. Из этого следовало, что метаболизм ДМНА в микросомах печени сопряжен с утилизацией суперокиси кислорода и процесс окислительного деметилирования яда лимитируется концентрацией супероксид-анион-радикалов. В цепи микросомаль-ного окисления НАДФН супероксид-анион-ра-дикалы могут продуцироваться на цитохром Р-450: редуктазе и, по-видимому, на самом цитохроме Р-450. Полагают, что супероксид, образующийся на редуктазе, участвует в реакциях окисления адреналина в адренохром, а супероксид, возникающий на гемопротеиде, может вовлекаться в реакции гидроксилирования [8,10].
Проведенные нами ранее исследования позволили выявить, что при метаболизме ДМНА в микросомальных мембранах активировался процесс транспорта электронов от НАДФН до цитохром Р-450: редуктазы. Электрондонорная активность этого флавопротеида соответственно увеличивалась. Восстановление же цитохрома Р-450 и его электрондонорные свойства резко снижались [2]. Такие результаты указывали на то, что генерация супероксид-анион-радикалов при метаболизме ДМНА происходила на цитохром Р-450: редуктазе. Вместе й тем данные, полученные в эксперименте с суперок-сиддисмутазой и ее низкомолекулярным аналогом Си(Нз)2, позволяет считать, что в реакциях окислительного деметилирования ДМНА супероксид-анион-радикал непосредственно не используется. Метаболизм ДМНА угнетался только при удалении суперокиси из среды адреналином, норадреналином и викасолом, но не супероксиддисмутазой и Си(Нз),. Напротив, дисмутация суперокиси до перекиси водорода, осуществляемая этими катализаторами, приводила к активации процессов биотрансформации ДМНА. В то же время блокирование супе-роксиддисмутазы с помощью ее ингибитора диэтилдитиокарбамата натрия вызывало прекращение Ы-деметилирующих функций микросом в отношении ДМНА. В совокупности такие результаты давали основания считать, что в процессы микросомальной биотрансформации ДМНА вовлекалась образующаяся из супероксид-анион-радикалов перекись водорода. Экспериментально это положение подтверждалось активацией метаболизма ДМНА после введения гидроперекиси в инкубационную среду (табл.1). Изложенные данные существенно изменяли представления о функционировании >шкросемальной системы монооксигеназ и путях утилизации кислорода при метаболизме ДМНА.
В биологических системах последовательное
пероксидаза
Н202 + АН----------------^ 2Н20 + А,
(где А - субстрат)
В мембранах же гладкого эндоплазматичес-кого ретикулума в процессах утилизации продуктов восстановления кислорода реально могут участвовать цитохром Р-450 и супероксид-дисмутаза. Цитохром Р-450 в этом случае выполняет функции пероксидазы [16].
Биологическая роль функционирования этого гемопротеида в качестве пероксидазы недостаточно ясна. Однако значимость такого процесса для механизма молекулярных структур клетки чрезвычайно велика. Взаимодействие
Таблица 1
Метаболизм ДМНА до формальдегида в НАДФ-зависимой системе микросомальных мембран клеток печени крыс в условиях воздействия кислородмодифицирующих средств, перекиси водорода и диэтилди гиокарбамината натрия
Реагент Характеристика Концентрация Метаболизм ДМНА Эффект
реагента реагента мкМ/мл нмоль НСОН/мг белка-мин V мкГ НСОН/мл (Я±БЯ() С воздействия о/ /0
а-токоферол ацетат Контроль тушитель '02 6,0 5,25 4,8 4,7±0,36 Р<0,1 4,3+0,2 +4
Ретинол ацетат Контроль п 6,0 5,4 4,7 4,9+0,1 Р<0,01 4,2+0,16 + 11
Этанол Контроль Ловушка ‘ОН 6,0 3.4 5.5 3,0+0,2 Р<0,001 4,8±0,14 +38
Бутанол Контроль 6,0 4,2 5,25 3,8±0,16 Р<0,001 4,7±0,13 +20
Метанол Контроль _п 6,0 2,45 4,8 2,25±0,03 Р<0,001 4,4±0,4 -49
Адреналин Контроль ловушка Гг 0,25 0 5,3 0 4,8+0,85 -100
Норадреналин Контроль п 0,25 1,74 4,5 1,57+0,22 Р<0,001 3,71+0,94 -69
Викасол Контроль п 6,0 0 5,54 0 4,9±0,2 -100
Викасол Контроль и 0,6 0 4,7 0 4,25±0,3 -100
Викасол Контроль ■ 0,06 і,о 4,9 1,62+0,07 Р<0,01 4,31±0,7 -63
Супероксиддисмутаза (СОД) Контроль катализатор реакции 1мкГ/мл 4Н 20;+->2Н,0, 4,7 4,1 4,23±0,42 Р<0,01 3,71±0,24 + 14
С и(11 5)2 Контроль низкомолекулярный 1мкМ/мл аналог СОД 6,15 4,75 5,5±0,23 Р<0,001 4,25±0,14 +29
Диэтилдитиокарбамат натрия Контроль ингибитор СОД 60,0 0 4,66 0 5,12±0,24 -100
п Контроль п 6,0 1,1 6,0 1,0±0,12 Р<0,001 5,4±0,4 -84
» Контроль п 0,6 1,11 3,34 1,0±0,05 Р<0,001 3,05±0,2 -67
п Контроль п 0,06 3,49 5,55 3,14±0,17 Р<0,001 5,0±0,19 -37
Перекись водорода Контроль продукт дисмутации 5,58 4,44 5,02±0,29 Р<0,001 4,0±0,26 +26
восстановление кислорода может приводить к образованию нескольких его высокореакционных форм:
+е- +е~ +Н +е~ +Н
°2 —* °2 —► °2 —► Н202 ------------5- ОН + Н20.
В системах с развитой ферментной антиок-сидантной активностью (цитозол, митохондрии, пероксисомы) инактивация этих форм осуществляется рядом энзимов:
супероксиддисмутаза
о; + о; + 2Н------------------------ н2о2 + о2.
катализа
Н202 + Н202 ---------------------»- 2Н20 + Ог
перекиси водорода с цитохромом Р-450 приводит к необратимой деструкции его молекулы и к образованию неактивной в отношении метаболизма ксенобиотиков формы - цитохрома Р-420 [15]. Таким образом, полученные в настоящем эксперименте данные раскрывают молекулярные механизмы конверсии цитохрома Р-450 до цитохрома Р-420, что было выявлено нами ранее при воздействии ДМНА [1]. Представляется вероятным, что биотрансформация вещества и дезорганизация биохимических систем гепатоцитов оказываются сопряженными процессами и протекают они следующим образом:
ДМНА, достигая цитохрома Р-450 микросо-мальных мембран печени, связывается с ним как субстрат первого типа [17]. Блокирование прямого переноса электронов в монооксигеназ-ной системе от НАДФН до цитохрома Р-450 не позволяет этому энзиму функционировать обычным путем [18]. В реакции окислительного деметилирования ДМНА вовлекается система, генерирующая супероксид-анион-радикалы и дисмутирующая их до перекиси водорода. Последний процесс может происходить и спонтанно [8]. Гидроперекись утилизируется цитохромом Р-450, который в ходе процесса инактивируется [1Д5].
Конверсия цитохрома Р-450 в Р-420-форму влечет за собой значительное усиление его пе-роксидазной активности и в этом качестве фермент, по-видимому, участвует в реакциях биотрансформации ДМНА. То есть метаболизм вещества идет по пероксидазному пути. Этот путь, однако, связан с образованием большого количества свободных радикалов [5,9,16]. Схематично изложенный процесс представляется так:
ОХ
НАДФН
\( ЦитохромЛ
блок
НАДФ+
)| Р-450:
J \ редуктаза J +S ^ псп
RED
Г~\ сод о, OS-J4
д+к
г
ДМНА и-450 ч-
ДМНА - Р-450
ДМНА Р-450 -
-► Р-420
НМ
'ОН метаболиты ОН ДМНА
Процесс метаболизма ксенобиотиков в мо-нооксигеназной системе печени заканчивается, как правило, их оксигенированием. Предполагают, что оксигенирующим интермедиатом может быть атомарный кислород, супероксид-анион-радикал, гидроксил-радикалг гицроксил-ион, а также синглетный кислород. Данные, полученные в настоящем эксперименте, дают основание отдать предпочтение гидроксил-ра-дикалу. поскольку введение в систему, мета-болизирующую ДМНА, ловушек Т’ИДРОКСИЛ-радикалов существенно замедляло реакции биотрансформации яда. Процессы метаболизма ксенобиотика и повреждения мембранных структур клетки в этом случае оказываются сопряженными. Гидроксил-радикал является не только гидроксилирующим агентом, но и одним из наиболее активных инициаторов цеп-
ных свободно-радикальных реакций, разрушающих мембранные структуры клеток печени.
ЛИТЕРАТУРА
1. Осипенко Б.Г. Цитохром Р-450 в проблеме токсического повреждения печени /Сибирский медицинский журнал. — 1994, № 1-2, — С. 16-18.
2. Осипенко Б.Г. Мькросомальный транспорт электронов в механизме некротического повреждения печени диметилнитрозамином /Сибирский медицинский журнал. — 1996, № 2, — С.8-11.
3. Портяная Н.И., Осипенко Б.Г.. Москадынова Г.А.,
Новохатский Н.К., Гущина А. Биохимические исследования в токсикологическом эксперименте — Иркутск, 1991, — С. 216.
4. Boiinenkaamp W., Weser U. Си, Zn-superoxide dis-mutase in copper depleted /Superoxside and su-peroxide dismutases. /Acad. Pres. —London, N.Y., San-Fraco, 1977, — P.387-394.
5. Cheessemann K., Slater I. An introduction to free radical biochemistry /Brit. Med. Bui. — 1993, 49, 3, — P.481-493.
6. Dalner G., Ernster L. Subfrectionation and composition of microsoval membnes: a review / J.Histoclim. and cytochem. — 1968, 16, 5,
P.611-632.
7. Erbas D., EkmeKci A., Aricioglu A. Effect of dieth-ylnitrosamine on prostaglandine E and lipid peroxidation levels in rat’s liver, lung and renal tissue /Prostogiand., Leucotrienes and essent. Fatty Acids. — 1993, 49, 4. — P.805-808.
8. Fridovich I. The biology of oxygen radicals. The superoxide -radicals is an of oxygen toxicity; superoxide dismutases provide an important defense /Science. — 1978, V.201, № 4359, — P.875-880.
9. Griffin B., Ting P. Mechanism of N-demetliylation of aminopyrine by hydrog peroxide catalyzed by horseradish peroxide, metmyoglobin, and protohe-min /Biochemistry: — 1978, 17, 11, — P.2206-2211.
10. Hallinell B. Free radicals and antrioxidants /Acta physiol, scand. Suppl. — 1992, 146, 608, — P.12.
11. Jahn F., Reuter A., Korge E. Age dependent different influence of carbon tetrachloride on biotransformation of xenobiotics glutathione content /Exp. and TOXICOL. pATHOL. — 1993, 45, 2-3, — P.101-107.
12. Magee P. Evidence for the formation of electro-philic metabolites from N-nitroso compounds / Origis Hum. Cancer. Book B. /Cold Spring Harbor. —1977, — P.637.
13. Moody D. Effect of phenobarbital treatment of carbon tetrachloride mediated cytochrome P-450 loss and diene conjugate formation /Toxicol. Lett.
— 1992, 61, 2-3, — P.213-224.
14. Nash T. The calorimetric estimation of formaldehyde by means of the hant reaction /Biochem. J.
— 1953, 55, 3, — P.416-421.
15. Nordblom G., White R., Coon M. Studies on hydroperoxide dependet substrate hydroxilation by purified liver microsomes cytochrome P-450 /Arch. Bioc and Biophys. — 1976, 175, 2, — P.524-533.
16. O’Brien P., Rahimtula A. The peroxidase function of cytochrome P-450 with possible implications for carcinogenesis /Biochemistry, Biophysics and Rlgulation of Cytochrome P-450. — Eisevi-er/North-Holland Biomedical Press. /Eds. Gustafson et al. — 1980, — P.273-281.
17. Osipenko B.G. New aspect of metabolism of dime-thylnitrosamine in the hepatic monooxigenase system /Annual Meeting of the European Evironmen-tal muoagen Society. — 1984, — P.358-359.
18. Osipenco B.G., Ischenko E.D., Cheryak J.I. Cytochrome P-450 end effect of biologically active compounds on cytochrome P-450-dependent dimethylni-trosamine metabolism in rat liver microsomes / Cytochrome P-450 and Environment. — Novosy-birsk, 1967, — P.131-132.
19. Quan Zliu, Khan Susmsullah, O’Brien P. Role of cytochrome P-450 in N-nitrose-N-methylaniline inducer hepatocyte /Chem.-Biol. Interact. — 1992, 83, 3, — P.221-233.
20. Sies H., Groot H. de Role of reactive oxygen species in cell toxicity /Toxicol. Lett. — 1992, 64-65, Spec. Issue. — P.547-551.
21. Werringloer J., Estabrook R. The formation of hydrogen peroxide during microsomal electron transport reactions /Hoppe-Seyler. Z. Physiol. Chem. — 1976, 8, — P. 1063-1064.
Summary
Dimethyliiitrosamine (DMNA) metabolism in the microsomes to formaldehyde under conditions of exposure to singiet oxigen guenclies, superoxside anion and hydroxyl radical traps were studied in vivo. DMNA metabolism in the microsomal membranes was blocked by superoxide anion radical traps. It was partly suppressed with hydroxyl radical traps. The findings are discussed with reference to the involment of superoxide anion and hydroxil radicals in DMNA metabolism and toxic liver damage.
УДК 577.
ВЛИЯНИЕ ФАЗОВОГО СОСТОЯНИЯ ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ МЕМБРАН
Е.В. Шевченко
Иркутский государственный медицинский университет
Резюме. Обобщены результаты работ автора по исследованию фазовых переходов мембранных липидов из жидкокристаллического состояния (ЖКС) в гель. Показано, что в точке фазового перехода происходит образование пор, время жизни которых зависит от фазового состояния липидов. Оценены параметры этих пор. Суммированы данные о размерах пор, возникающих в мембране при электрическом пробое, осмотическом гемолизе и фазовом переходе. Показана возможность регулирования стабильности мембран изменением фазового состояния.
Биологические мембраны состоят из белков, липидов, воды и неорганических компонентов. Относительное содержание этих составных частей и их природа могут существенно различаться.
Основой биологических мембран является бимолекулярный слой, сформированный молекулами липидов [4]. Стабильность и непрерывность липидного бислоя имеют важное значение для выполнения мембранами одной из основных функций — барьерной.' В последнее время стало очевидно, что такие биологические явления, как эндо- и экзоцитоз, лизис клеток и гемолиз, электропорация и криоконсервация, обусловлены изменениями в липидном бислое мембран. При этом происходит дестабилизация структуры бислоя. Жидкокристаллическая природа бислоя подразумевает существование в нем дефектов, развитие которых приводит к формированию зародыша, далее гидрофобной поры, эволюционирующей в гидрофильную сквозную пору [2]. Поры могут затекать, что приводит к стабилизации мембраны, либо увеличиваться в размерах, что в конечном итоге приводит к разрыву пленки. Когда пора образовалась, ее дальнейшее развитие будет зависеть от целого ряда факторов и прежде
всего от высоты энергетического барьера и критического радиуса [-1].
Определение критических параметров образующихся пор представляет важную задачу биофизики мембран. Наиболее изучены в настоящее время бислойные мембраны в условиях электрического пробоя и действия детергентов [3]. Общая теория дестабилизации мембран была разработана в свое время Дерягиным [2].
Общим недостатком этих исследований, отличающим их от исследования белковых каналов, являются трудности визуализации пор в силу их быстрого затекания или разрушения вместе с мембраной в жидкокристаллическом состоянии.
В начале 80-х годов в лаборатории ионного транспорта МГМУ им.Н.И.Пирогова (научный руководитель — проф.Антонов В.Ф.) при изучении фазовых переходов липидов были обнаружены долгоживущие поры, легко регистрируемые по флуктуациям тока при соответствующей температуре фазового перехода липидов [!]• Одной из очевидных причин длительного существования пор является замедление диффузии липидов при переходе в гель состояние. Дальнейшие исследования были сосредоточены поэтому на изучении бислойных липидных мембран в условиях фазового перехода ЖКС
— гель. Такие исследования позволяют, во-первых, резко замедлить диффузионные процессы, определяющие время жизни мембран с порами, во-вторых, сам процесс фазового перехода, сопровождающийся стрессовыми состояниями, является источником дефектов типа сквозных пор, и, наконец, в отличие от электрического пробоя, поры могут регистрироваться по флуктуациям тока при физиологических напряжениях (0-100 мВ), много меньших напряжения пробоя (-400 мВ).
В основу экспериментальных исследований
