CC BY
58
УДК 577.57.044 : 577.152.1
Г. В. Ганусова
Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина
АКТИВНОСТЬ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ NADP-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ И СОДЕРЖАНИЕ ЦИТОХРОМОВ Р-450 И В5 В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ ХЛОРИДА КОБАЛЬТА И ХЛОРИДА РТУТИ
Вивчено вплив хлориду кобальту та хлориду ртуті на активність цитоплазматичних NADP-залежних дегідрогеназ і вміст мікросомальних цитохромів у печінці щурів на різні терміни після введення солей (0,5, 2 і 14 годин). Хлорид кобальту та хлорид ртуті призводять до зниження вмісту мікросомальних цитохромів Р-450 і b5 через 14 годин. Встановлено зниження глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної та малатдегідрогеназної активностей через півгодини після введення хлориду кобальту. Хлорид ртуті не впливав на активність NADP-залежних дегідрогеназ.
Influence of the cobalt chloride and mercury chloride on the activity of cytoplasmic NADP-dependent dehydrogenases and cytochromes level in a rat’s liver was studied after 0.5, 2 and 14 hours of introduction. Cobalt chloride and mercury chloride result in decrease of the microsomal cytochromes P-450 and b5 contents in 14 hours. Reduction of the glucose 6-phosphate dehydrogenase and malate dehydrogenase activities in half an hour after cobalt chloride introduction is ascertained. The mercury chloride did not influence on the activity of NADP-dependent dehydrogenases.
Введение
Соли кобальта и ртути - широко распространенные загрязнители окружающей среды. Несмотря на то, что кобальт относится к эссенциальным, а ртуть - к токсическим микроэлементам, при избыточном поступлении в организм они активируют процессы перекисного окисления липидов [22; 24], вызывают индукцию белков острой фазы и других стрессорных белков. Индукция гемоксигеназы, одного из стрессорных белков, сопровождается изменениями активности ферментов метаболизма гема, снижением концентрации свободного гема и микросомальных цитохромов Р-450 и b5 в печени [2; 9; 12]. Цитохром Р-450 является терминальной оксидазой микросомальной монооксигеназной системы гидроксилирования ксенобиотиков, ряда лекарственных средств, стероидов [20]. Уровень цитохрома Р-450 и активность цитохром Р-450-редуктазы лимитируют скорость реакций гидроксилирования в процессе биотрансформации ксенобиотиков в печени [10]. Перенос второго электрона в реакции биотрансформации ксенобиотиков может осуществляться при участии как цитохром Р-450-редуктазы, так и цитохрома b5 [25]. Поставщиками NADPH для цитохром Р-450-редуктазной реакции служат ферменты, катализирующие NADP--зависимое дегидрирование субстратов. Взаимодействие механизмов регуляции содержания микросомальных цитохромов и активности цитоплазматических NADP-дегидрогеназ после введения солей кобальта и ртути на этапе формирования защитных реакций организма изучены недостаточно.
В связи с этим в настоящей работе изучено влияние СоС12 и Hgd2 на активность NADPH-генерирующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
(КФ 1.1.1.49), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.44), цитоплазматической малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.40) и цитоплазматической изоцитратдегидрогеназы
© Г. В. Ганусова, 2006 54
(КФ 1.1.1.42) и содержание микросомальных цитохромов Р-450 и b5 в печени крыс через 0,5, 2 и 14 часов после введения солей.
Материал и методы исследований
В работе использовали крыс-самок линии Вистар массой 150-200 г. СоС12 ■ 6(Н2О) или НgС12 растворяли в 0,9 % ^С1 и вводили внутрибрюшинно из расчета 3,0 и 0,7 мг/100 г массы, соответственно. Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора.
Животных декапитировали под легким эфирным наркозом через 0,5, 2 и 14 часов после введения соли. Печень перфузировали холодным физиологическим раствором in situ и микросомы выделяли методом дифференциального центрифугирования гомогенатов, приготовленных в среде: сахароза - 0,25 М, трис-НО буфер -
0,01 М, ЭДТА - 0,001 М, рН = 7,4.
Содержание микросомальных цитохромов определяли методом дифференциальной спектрофотометрии по Омура и Сато [18], используя коэффициент молярной экстинции для цитохрома b5 164 ■ 10- М_1 см-1, для цитохрома Р-450 -91 ■ 10-3 М_1 см_1 и для цитохрома Р-420 - 110 ■ 10-3 М_1 см_1и выражали в нмоль на 1 мг микросомального белка. Цитозоль, полученный центрифугированием постмитохон-дриальной фракции при 105000 g в течение 1 часа на центрифуге VAC-601, использовали как ферментный препарат для определения активности NADP-зависимых дегидрогеназ.
Активности глюкозо-6-фосфат- и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы определили по методу Глок и Мак-Лин в модификации Боттомли [15], малатдегидрогеназы -по методу Очоа в модификации Цончевой [4], а изоцитратдегидрогеназы - по методу Плаут и Санг [5]. Скорость образования NADPH регистрировали на спектрофотометре СФ-46 при 340 нм, активность ферментов выражали в нмоль NADPH / мин. на 1 мг белка. Концентрацию белка определяли по методу Лоури в модификации Миллера [16].
Результаты и их обсуждение
Содержание микросомальных цитохромов Р-450 и b5 (табл. 1) не изменялось в ранние сроки (0,5 и 2 часа) после введения СоС12 и Hgd2. Снижение содержания цитохромов Р-450 и b5 отмечено только через 14 часов, причем более выраженное при введении хлорида ртути.
Таблица 1
Содержание микросомальных цитохромов (нмоль/мг белка) в печени крыс в разные сроки после введения СоС12 или ^С12 (М ± т, п = 6-9)
Цитохромы Контроль Время после введения соли, часы
0,5 2 14
CoCl2
Р-450 0,82 ± 0,03 0,78 ± 0,04 0,74 ± 0,05 0,63 ± 0,05*
bs 0,57 ± 0,03 0,54 ± 0,04 0,53 ± 0,05 0,44 ± 0,04*
HgCl2
Р-450 0,82 ± 0,03 0,76 ± 0,03 0,73 ± 0,05 0,59 ± 0,06*
bs 0,57 ± 0,03 0,55 ± 0,03 0,53 ± 0,02 0,38 ± 0,04*
Примечание: * -р < 0,05 по отношению к контролю.
При изучении влияния введения солей на активность NADР-зависимых дегидрогеназ (табл. 2) установлено снижение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной и
малатдегидрогеназной активностей и некоторое снижение изоцитратдегидрогеназной активности через 0,5 часа после введения СоС12 с нормализацией в последующие 1,5 часа. НgС12 не оказывал влияния на активность ЫЛВР--зависимых дегидрогеназ.
Снижение содержания микросомальных цитохромов Р-450 и Ь5 после введения солей тяжелых металлов обычно связывают с индукцией гемоксигеназы [9; 13]. Однако гем в составе цитохрома Р-450 не атакуется гемоксигеназой и необходима предварительная дестабилизация гемопротеина. В литературе обсуждается несколько механизмов инактивации цитохрома Р-450. При фосфорилировании апоцитохрома Р-450 сАМР'-зависимой протеинкиназой наблюдается ингибирование каталитической активности Р-450, снижение его содержания и частичное превращение Р-450 в Р-420 [23; 21].
Таблица 2
Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл-6-ФДГ), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-ФГлДГ), малатдегидрогеназы (МДГ) и изоцитратдегидрогеназы (ИцДГ) (нмоль МАБРИ / мг белка за мин.) в печени крыс в разные сроки после введения СоС12 или ^С12 (М ± т, п = 6-9)
Ферменты Контроль Время после введения соли, ч.
0,5 2 14
CoCl2
Гл-6-ФДГ 23,6 ± 2,1 16,7 ± 1,7* 20,3 ± 2,0 20,9 ± 1,8
6-ФГлДГ 35,5 ± 2,6 36,6 ± 2,5 35,7 ± 2,4 32,3 ± 2,6
МДГ 21,4 ± 1,6 15,3 ± 1,5* 17,9 ± 1,9 19,4 ± 1,8
ИцДГ 197,5 ± 11,2 171,7 ± 9,6 183,3 ± 9,8 196,4 ± 11,6
HgCl2
Гл-6-ФДГ 23,6 ± 2,1 24,9 ± 2,7 31,2 ± 3,9 23,3 ± 2,2
6-ФГлДГ 32,0 ± 2,4 32,4 ± 2,6 33,7 ± 2,5 30,7 ± 1,8
МДГ 21,4 ± 1,6 23,0 ± 2,7 24,1 ± 2,5 24,3 ± 2,8
ИцДГ 197,5 ± 11,2 201,7 ± 11,0 171,3 ± 9,4 205,3 ± 10,3
Примечание: * -р < 0,05 по отношению к контролю.
Другой путь ингибирования каталитической активности и денатурации Р-450 осуществляется за счет окисления и связывания с HgCl2 «SH-групп активного центра цитохрома Р-450, а также продуктов перекисного окисления липидов как in vitro, так и in vivo [6; 17]. Продукты перекисного окисления липидов взаимодействуют со свободными аминоногруппами апобелка, что сопровождается снижением каталитической активности и содержания цитохрома Р-450; образования Р-420 в этих условиях не отмечено. Поскольку в наших опытах не зафиксировано появления Р-420 после введения изучаемых солей животным, мы полагаем, что снижение содержания цитохрома Р-450 происходит за счет действия HgCl2 и продуктов перекисного окисления липидов. Согласно современным представлениям [6], для частичной инактивации и денатурации цитохрома Р-450 достаточно тех концентраций альдегидных продуктов перекисного окисления липидов, которые образуются в микросомальных мембранах при окислительном стрессе.
Появление активных форм кислорода после введения животным CoCl2 можно объяснить тем, что ионы Со2+ являются субстратом феррохелатазы, которая катализирует замещение Fe2+ в свободном геме [13]. При этом образуются Co2+-протопорфирин и свободные ионы Fe2+. В свою очередь, ионы Fe2+ инициируют одноэлектронное восстановление кислорода, что приводит к образованию супероксид-радикала и перекиси водорода. Из перекиси водорода в присутствии ионов металлов с переменной
валентностью, в том числе и Fe2+, может спонтанно образовываться высокореакционноспособный и долгоживущий гидроксил-радикал OH' [3; 19].
Активация свободнорадикального окисления в печени после введения HgCl2, как и других солей, ионы которых не являются субстратом для феррохелатазы, может осуществляться посредством других механизмов, связанных со снижением содержания восстановленного глутатиона. Так, в работе [8] показано, что после внут-рибрюшинного введения мышам лактата алюминия уже через два часа резко снижается содержание восстановленного глутатиона и в последующем развивается окислительный стресс с индукцией гемоксигеназы и снижением цитохрома Р-450.
Появлением активных форм кислорода в ранние сроки после введения CoCl2 (0,5 часа), по-видимому, можно объяснить и снижение глюкозо-6-фосфат- и малатдегидрогеназной активностей. В литературе имеются данные о снижении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы активными формами кислорода [7; 11]. Поскольку активные формы кислорода инактивируются как ферментативным, так и неферментативным путем, в последующие 1,5 часа активность дегидрогеназ возвращается к исходному уровню.
Выводы
Влияние СоС12 и HgCl2 на содержание микросомальных цитохромов и активность NADP-зависимых дегидрогеназ осуществляется путем формирования защитных реакций в ответ на появление активных форм кислорода и активацию перекисного окисления липидов. В результате индукции гемоксигеназы образуются внутриклеточные мессенджеры, которые участвуют в регуляции антиоксидантной системы клетки [14]. Снижение содержания цитохромов Р-450 и b5 не сопровождалось снижением активности NADP--зависимых дегидрогеназ, а значит, только индукция микросомальных цитохромов функционально связана с активацией образования NADPH [1].
Библиографические ссылки
1. Активность цитоплазматических NADP-зависимых дегидрогеназ в печени крыс в процессе индукции фенобарбиталом цитохрома Р-450 / П. А. Калиман, В. В. Петренко, С. П. Манандхар, Т. В. Бомко // Укр. биохим. журн. - 1991. - Т. 63, № 2. - С. 52-58.
2. Калиман П. А. Влияние хлорида кобальта на активность ключевых ферментов метаболизма гема в печени крыс / П. А. Калиман, И. В. Беловецкая // Биохимия. - 1986. -Т. 51, № 8. - С. 1302-1307.
3. Осипов А. Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А. Н. Осипов, О. А. Азизова, Ю. А. Владимиров // Усп. биол. хим. - М.: Наука, 1990. - Вып. 31. -
C. 180-208.
4. Усатенко М. С. Влияние инсулиновой недостаточности и гидрокортизона на активность НАДФ- и НАД-зависимых малатдегидрогеназ в печени и коре почек крыс / М. С. Усатенко, А. В. Цончева // Вопр. мед. химии. - 1974. - Т. 20, № 4. - С. 401-406.
5. Bauman D. E. Pathways of fatty acid synthesis in mammary gland of rat, sow and cow /
D. E. Bauman, R. E. Brown, C. L. Davis // Arch. Biochem. Biophys. - 1970. - Vol. 140, N 1. -P. 237-244.
6. Bestervelt L. L. Inactivation of etanol-inducible cytochrome P-450 and other microsomal P-450 isozimes by trans-4-hydroxy-2-nonenal, a major product of membrane lipid peroxidation / L. L. Bestervelt, A. D. V. Vaz, M. J. Coon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1995. - Vol. 92, N 9. - P. 3764-3768.
7. Dumitru I. F. Decrease in yast glucose-6-phosphate dehydrogenase activity due oxygen free radicals / I. F. Dumitru, M. T. Nechifor // Intern. J. Biochem. - 1994. - Vol. 26, N 2. -P. 1632-1635.
8. Fulton B. The temporal relationship between hepatic GSH loss, heme oxygenase induction, and cytochrome P-450 loss following intraperitonal aluminium administration to mice / B. Fulton,
E. N. Jeffery // Toxycol. Appl. Pharmacol. - 1994. - Vol. 127, N 2. - P. 291-297.
9. Heme oxygenase activity and cytochrome P-450 content associated with induced metal-lothionein in the liver of rats treated with various metals / K. Arizono, E. Okanari, K. Ueno, T. Ariyoshi // J. Environ. Sci. Heals. - 1991. - Vol. 26, N 6. - P. 941-951.
10. Imai Y. Rate-limiting step in the reconstituted microsomal drug hydroxelase system / Y. Imai, R. Sato, T. Ieanagi // J. Biochem. - 1977. - Vol. 82, N 4. - P. 1237-1246.
11. Inactivation of glucose-6-phosphate dehydrogenase by 4-hydroxy-2-nonenal. Selective modification of an active-site lysine / L. I. Szweda, K. Uchida, L. Tsai, E. R. Stadtman // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol. 268, N 5. - P. 3342-3347.
12. Lesuy S. F. Heme oxygenase and oxidative strees. Evidense of involvement of bilirubin as physiological protector against oxidative damage / S. F. Lesuy, M. L. Tomaro // Biochim. Bio-phys. Acta - Mol. Cell Res. - 1994. - Vol. 1223, N 1. - P. 9-14.
13. Maines M. D. Metals as regulators of heme metabolism / M. D. Maines, A. Kappas // Science. -1977. - Vol. 198, N 4323. - P. 1215-1221.
14. Marks G. S. Heme oxygenase: the physiological role of one of its metabolites, carbon monoxyde and interactions with zinc protoporphyrin, cobalt protoporphyrin and other metallo-porphyrins // Cell. and Mol. Biol. - 1994. - Vol. 40, N 7. - P. 863-870.
15. Metabolic adaptations in rat hepatomomas. Reciprocal relationship between threonine dehy-drase and glucose-6-phosphate dehydrogenase / R. H. Bottomley, H. C. Pilot, V. R. Potter, H. P. Morris // Canc. Res. - 1963. - Vol. 23, N 1. - P. 400-409.
16. Miller G. L. Protein determination for large number of samples //Anal. Chem. - 1959. -Vol. 31, N 5. - P. 964-966.
17. Obrebska M. J. The effects of carbon disulphide on rat liver microsomal mixed-function oxydases iv vivo and in vitro / M. J. Obrebska, P. A. Kentish, D. V. Parke // Biochem. J. - 1980. -Vol. 188, N 1. - P. 107-112.
18. Omura T. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsom / T. Omura, R. Sato // J. Biol. Chem. - 1964. - Vol. 239, N 7. - P. 2379-2385.
19. Pincus R. Role quinone-mediated generation of hydroxyl radicals in the induction of glutation of glutatttion S-transferase gene expression / R. Pincus, L. M. Weiner, V. Daniel // Biochemistry. - 1995. - Vol. 34, N 1. - P. 81-88.
20. Porter T. D. Cytochrome P-450. Multiplicity of isoforms, substrates, and catalitic and regulatory mechanisms / T. D. Porter, M. J. Coon // J. Biol. Chem. - 1991. - Vol. 266, N 21. -P. 13469-13472.
21. Relationship between phosphorilation and cytochrome P-450 destruction / J. Jansson, M. Curti, P. M. Epstein et al. // Arch. Biochem. Biophys. - 1990. - Vol. 283, N 2. - P. 285-292.
22. Stasey N. H. Cellular toxicity and lipid peroxidation in responce to mercury / N. H. Stasey, H. Kappas // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1982. - Vol. 63, N 1. - P. 29-35.
23. Substrat-regulated, cAMP-dependent phosphorilation, denaturation, and degradation of gluco-corticoid-inducible rat liver cytochrome P-450 3A1 / E. Elliason, S. Mkrtchan, J. R. Halpert, M. Ingelmansundberg // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269, N 28. - P. 18378-18383.
24. Sunderman F. W. Metals and lipid peroxidation // Acta Pharmacol. Toxicol. - 1986. - Vol. 59, N 7. - P. 248-255.
25. The stoichiometry of the cytochrome P-450-catalized metabolism of methoxyflurane and benzphetamine in the presence and absenct of cytochtome b5 / L. D. Gruenko, K. Konopka, M. CaLien, L. Waskell // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270, N 42. - P. 24707-24718.
Надійшла до редколегії 01.03.06.
