CC BY
129
577.15.156.001.4
АКТИВНОСТЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА И ХИМОТРИПСИНА В ВЫСШИХ ГРИБАХ
Л.А. ГЗОГЯН, М.Т. ПРОСКУРЯКОВ
Кубанский государственный университет
Дефицит животного сырья и несовершенство микробных препаратов стимулировали интерес к базиди-альным грибам как возможным продуцентам протео-литических ферментов [1]. Два обстоятельства оправ -дывают поиск ферментов пищевого назначения среди высших базидиомицетов: наличие среди них большого числа съедобных грибов и отсутствие спороношения в культуре, что уменьшает опасность профессиональных заболеваний в условиях производства [2]. Протео-литические ферменты широко применяются в пищевой промышленности. С увеличением выработки сыров возрос интерес к замене животного химозина ферментами другого происхождения. В результате исследований 44 штаммов базидиомицетов, способных синтезировать молокоствораживающие ферменты, установлено, что два вида базидиомицетов - Irpexlacteus и Fomitopsis pinícola образуют протеазы, являющиеся хорошими заменителями химозина [3].
Был проведен скрининг 400 естественных видов высших грибов с целью установления у них протеоли-тической активности [4]. Около 1/3 исследованных видов агариковых и болетовых грибов содержали про-теиназы, разжижающие фибрин и казеин.
Впервые ингибиторы трипсиноподобных ферментов в высших грибах обнаружены в 1985 г. в видах Armillaria mellea, Nematoda fasciculare и Tricholoma populinum [5]. Проведенный скрининг 46 видов 10 семейств базидиомицетов выявил высокую активность ингибитора трипсина в 8 видах 5 семейств [6]. В 2000 г. были получены данные о наличии ингибитора трипсина в 54 изученных видах порядка Agaricales и Aphyllophorales [7].
Цель нашей работы - детальное исследование про-теолитической активности к природным и синтетическим субстратам, а также активности ингибитора трипсина и химотрипсина в базидиомицетах, наиболее распространенных в Краснодарском крае.
Исследовано 18 видов грибов порядков Boletales, Agaricales, Aphyllophorales, Russulales, относящихся к различным эколого-трофическим группам. Для экспериментов использовали сок плодовых тел базидиоми-цетов, полученный после измельчения, замораживания, размораживания и фильтрации. Сок хранили в замороженном виде при температуре -18° С.
Содержание растворимого белка определяли согласно [8], общего белка - по Кьельдалю [9], химазную (молокосвертывающую) активность, выраженную в единицах, - по [10]. Протеолитическую активность щелочных протеаз определяли по казеину методом [11], кислых протеаз - с использованием денатурированного гемоглобина методом [12]. Активность выра-
жали в единицах оптической плотности Е280. Трипсиноподобную, химотрипсиноподобную и эластолитиче-скую активности определяли по синтетическим субстратам М-бензоил-Д£-я-нитроанилида (БАПНА), М-сукцинил^-фенилаланин-п-нитроанилида (СФПНА)
[13], N-сукцинил-триаланин-п-нитроанилида (СТАПНА)
[14]. Активность выражали в микромолях расщепленного субстрата в минуту.
Активность ингибитора трипсина и химотрипсина определяли соответствующими методами [15, 16].
При определении оптимумов pH активности ферментов использовали растворы субстрата и образца, приготовленные на универсальной буферной смеси [17].
Содержание белка в исследованных грибах (табл. 1) не имело закономерного характера распределения по таксономическим группам и составляло от
1.3 до 7,2 мг/мл. Максимальное количество обнаружено в Suillusflavidus из порядка Boletales, минимальное
- в Pleurotus ostreatus из порядка Agaricales. Близкие по содержанию белка виды порядка Russulales: 1,5—2,2 мг/мл. Содержание общего белка, по нашим данным, составляет, г/100 г продукта: шампиньон 4,3; подосиновик 3,3; лисички 1,6; масленок 2,0; березовик 5,0; белый гриб 5,5; опенок 3,3. Исходя из этого, было рассчитано процентное содержание растворимого белка от общего, составившее от 2,8 до 10%.
Во всех видах обнаружена активность протеиназ к использованным специфичным синтетическим и природным субстратам (табл. 1). Использование синтетических субстратов позволило отнести определяемую активность к группе трипсиноподобных, химотрипси-ноподобных или эластолитических ферментов.
Активность трипсиноподобных ферментов колебалось в диапозоне от 0,3 до 2,2 мкМ. Наиболее высокой она была в порядке Boletales, где максимальная активность у видов Boletus edulis — 2,2 мкМ, минимальная — в Cantarellus aurantiaca — 1,4 мкМ. В порядке Agaricales наибольшая трипсиноподобная активность у вида Flammulina velutipes семейства Tricholomataceae —
1.3 мкМ, наименьшая - у вида Pleurotus cornucopiae семейства Pleurotaceae — 0,3 мкМ. В порядке Russulales наибольшее количество трипсиноподобных ферментов наблюдалось у вида Lactarius pubescens — 1,6 мкМ, а в порядке Aphyllophorales у вида Herricium erinaceus
— 0,9 мкМ.
Активность химотрипсиноподобных ферментов колебалась от 1,3 до 4,8 мкМ. Наиболее высокой она была в порядке Boletales, вид Boletus edulis. В порядке Agaricales высокой активностью отличался вид Flammulina velutipes — 2,4 мкМ, в порядке Russulales — Lacatarius piperatus — 2,7 мкМ. Наименьшей активностью обладали грибы порядка Aphyllophorales, вид Hericium erinaceus — 2,1 мкМ.
Таблица 1
Белок, мг/мл Активность по субстратам
Порядок, вид БАПНА, мкМ СФПНА, мкМ СИАПНА Молоко Казеин Оптимум pH Г емогло -бин, pH Оптимум pH
Boletales:
Boletus edulis 2,4 2,2 4,8 0,24
Leccinum auranticum 5,2 1,8 3,8 0,11
Leccinum melanum 5,6 1,5 2,4 0,14
Boletus castanus 3,5 2,1 1,9 0,12
Suillus flavidus 7,2 1,9 2,3 0,8
Cantarellus aurantiaca 1,9 1,4 2,4 0,09
Agaricales: Flammulina velutipes 4,1 1,3 2,4 0
Armmilaria mellea 1,9 1,1 2,3 0
Macrolepiota procera 4,5 1,2 1,9 0
Agaricus silvaficus 1,8 0,8 2,2 0
Amanita phaloides 3,6 0,4 1,9 0
Pleurotus ostreatus 1,3 0,2 2,2 0
Pleurotus cornucopiae 1,5 0,3 1,4 0
Russulales: Lactarius pubescens 2,2 1,6 2,7 0
Russula veska 1,9 1,2 2,5 0
Lactarius piperatus 1,54 0,9 2,9 0
Aphylloph orales: Coriolus versicolor 3,2 1,3 1,3 0
Hericium erinaceus 4,2 2,1 2,1 0
Между содержанием трипсиноподобных и химот-рипсиноподобных ферментов существует положительная корреляционная зависимость r 0,64.
Эластолитическая активность обнаружена только у видов порядка Boletales, где максимальной активностью обладал вид Boletus edulis — 0,24 мкМ, минимальной - Cantarellus aurantiaca — 0,09 мкМ.
Активность по молоку была в диапазоне 0,2—4,9 ед. Самая высокая молокосвертывающая активность наблюдалась у видов порядка Boletales: максимальная -у Boletus edulis — 4,9 ед., минимальная — у Leccinum melanum — 1,7 ед. В порядкеAgaricales этот показатель наиболее выражен у вида Flammulina velutipes — 1,7 ед., наименее — у Pleurotus ostreatus — 0,2 ед. В порядках Aphyllophorales и Russulales высокая активность была у видов Lactariuspubecens и Hericium erinaceus — 1,4 и 1,2 ед. соответственно.
Высокая активность щелочных протеаз отмечена у видов порядка Boletales: наибольшая в виде Boletus edulis — 0,78 ед., наименьшая — в Cantarellus aurantiaca
— 0,33 ед. Далее следуют виды в порядках Agaricales, Russulales. Наименее выражена активность щелочных протеаз в видах порядка Aphyllophorales. В порядке
4,9 0,78 8,5 0,26 3,5
2,8 0,64 8,5 0,41 2,5
1,7 0,57 8,5 0,38 2,5
3,4 0,67 9,5 0,33 3,0
2,2 0,73 8,5 0,22 2,0
2,2 0,33 8,0 0,35 3,5
1,7 0,76 8,5 0,22 3,5
1,2 0,38 8,5 0,11 5,0
0,6 0,45 8,0 0,24 3,5
0,8 0,53 9,5 0,25 3,0
0,4 0,28 8,5 0,12 3,5
0,2 0,14 9,0 0,38 3,0
0,3 0,28 9,5 0,12 3,0
1,4 0,23 8,0 0,13 2,5
1,2 0,26 8,0 0,17 2,5
2,4 0,33 8,5 0,19 2,5
0,8 0,18 8,5 0,12 3,0
1,2 0,26 9,0 0,16 2,5
Agaricales наибольшая активность по казеину у Пашшиііпа уеШіреі' - 0,76 ед., наименьшая - у Ріеигоїш віїгеаїш' - 0,14 ед. В порядках Кшзиіаіез и Аркуііоркогаіеі' высокой активностью по казеину обладали виды Ьасїагіиі' риЬеі'сет - 1,4 ед. и Негісіиш егіпасеш - 0,26 ед. Оптимум активности этих протеаз был в интервале pH от 7,5 до 9,5.
Активность кислых протеиназ обнаружена во всех видах. В порядке Боіеїаіеі' она наиболее выражена у вида Ьессіпиш аигапґісиш - 0,41ед., наименее - у вида 8иіііш' Jlavidus - 0,22 ед. В порядке Agaricales высокая активность наблюдалась у Ріеигои оіігеаи -0,38 ед., низкая у Агшшііагіа шеііеа - 0,11 ед. Виды порядков Аркуііоркогаіеі' и Кшзиіаіез схожи по активности расщепления гемоглобина, составляющей от 0,12 до 0,19 ед. Оптимум активности кислых протеаз находился при pH 2,5-3,5.
Установлена положительная корреляционная зависимость между молокосвертывающей активностью и активностями щелочных и кислых протеаз: г 0,68 и 0,36 соответственно, между активностями щелочных и кислых протеаз: г 0,37, между содержанием белка и активностью ферментов: г 0,64.
Таблица 2
Порядок, вид Ингибитор, мг/г
трипс ина химотрипсина
Boletales:
Boletus edulis 3,7 5,б
Leccinum aurantiacum 1,7 0
Leccinum melanum 5,3 5,9
Boletus castanus 1,8 0
Suillus flavidus 2,3 4,2
Cantarellus aurantiaca 3,б 0
Agaricales:
Flammulina velutipes 2,0 0
Armillaria mellea 2,0 7,8
Macrolepiota procera 1,1 0
Agaricus silvaficus 1,0 7,4
Amanita phaloides 1,2 0
Pleurotus ostreatus 1,9 0
Pleurotus cornucopiae 0,б 0
Russulales:
Lactarius pubescens 0,4 0
Rusula veska 0,3 0
Lactarius piperatus 1,1 0
Aphyllophorales:
Coriolus versicolor 0,2 7,2
Herricium erinaceus 0,4 0
Ингибиторы трипсина обнаружены во всех исследованных видах базидиомицетов (табл. 2). Внутри порядка Boletales максимальной активностью ингибитора трипсина обладал вид Leccinum melanum - 5,3 мг/г, минимальной - вид Leccinum auranticum - 1,7 мг/г. В порядке Agaricales этот показатель высок у видов Flammulina velutipes и Armmilaria mellea - 2,0 мг/г. В порядке Russulales высокая активность ингибитора трипсина наблюдалась у вида Lactarius piperatus -1,1 мг/г, в порядке Aphyllophorales - у вида Herricium erinaceus - 0,4 мг/г. Mежду содержанием ингибитора трипсина и количеством растворимого белка установлена положительная корреляционная зависимость: r 0,78.
Ингибитор химотрипсина обнаружен в б видах ба-зидиомицетов: Leccinu melanum, Boletus edulis,
Armillaria mellea, Agaricus slvaficus, Coriolus versicolor (табл. 2). Mаксимальной активностью обладал вид Armillaria mellea - 7,8, минимальной - вид Suillus flavidus - 4,2 мг/г.
Таким образом, во всех исследованных видах грибов обнаружена протеолитическая активность к природным и синтетическим субстратам. Анализ характера распределения протеолитической активности по таксономическим группам свидетельствует, что наиболее активными к природным и синтетическим субстратам были виды порядка Boletales, далее следуют Agaricales, Russulales и Aphyllophorales. Наиболее перспективными видами для поисков заменителя химозина являются Boletus edulis, Boletus castanus, Leccinum
auranticum, Cantarellius aurantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales. Эластолитиче-ская активность обнаружена только у видов порядка Boletales. Установлена положительная корреляционная зависимость между трипсиноподобными, химот-рипсиноподобными и эластазоподобными ферментами. Активность ингибитора трипсина обнаружена во всех видах, а ингибитора химотрипсина в 6 из 18 исследованных видов. На основании полученных данных можно предположить, что базидиомицеты могут служить сырьем для получения протеолитических ферментов и их ингибиторов, используемых в пищевой технологии и медицине.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белова Н.В. Базидиомицеты - источники биологически активных веществ // Раст. ресурсы. - 1991. - № 2. - С. 23-27.
2. Псурцева Н.В., Белова Н.В. Биотехнологические возможности использования коллекционных культур базидиомицетов // Биотехнология. - 1994. - № 7. - С. 35-39.
3. Kawai M. Productivity of proteolytic enzymec and distribution of its milk clotting activity among the Basidiomycetes // J. Agr. Chem. Soc. Japan. - 1973. - 47. - № 8. - P. 467-472.
4. Денисова Н.П. Природа и биологическая роль протеи-наз базидиальных грибов // Микология и фитопатология. - 1984. -№ 2. - С. 112-116.
5. Piligrim H., Darwaza M. Untersuchungen zur inhibitorsichen wirkung von wabrigen Entrakten aus basidiomyceten aur trypsin // Pharmazie. - 1985. -3. - P. 655.
6. Pilgrim H., Haasman S., Schroder K. Trypsin inhibitor activity of Basidiomycetes // Zentralb. Microbiol. - 1992. -147. -P. 400-404.
7. Vetter J. Eur Food Res Technol. - 2000. -211. - № 3. -P. 346-348.
8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitaion of microgram quantities of protein utilizing of protein - dye bindig // Anal. Biochim. - 1976. -72. - № 2. - P. 127-129.
9. Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985. -С. 315.
10. Пятницкий Н.П., Проскуряков М.Т. // Материалы 17-й науч. конф. физиологов Юга РСФСР. - Ставрополь, 1969. -С. 80-82.
11. Нортроп Д., Кунитц М., Херриот Р. Кристаллические ферменты. - М., 1950. - 346 с.
12. Anson M. L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with gemoglobin // J. Gen. Physiol. - 1938. -22. - № 1. -
P. 79-89.
13. Tuppy H., Winterberger E., Wiessbauer U.
Amino-soure-p-nitroanilide als substrat fur aminopeptidasen and andere proteolytycs fement // Hoppe Selers. Z. Physiol. Chem. - 1962. -329. -№ 6. - P. 278-288.
14. Katagiri K., Takeuchi T., Sasaki M. One step purification procedure of elastase frome pancreatic powder by affinity chromatography // Anal. Biochem. - 1978. -86. - P. 159-165.
15. Erlanger B.F. The action of chymotrypsin on two New Chromogenic Substrates // Arch. Biochem. Biophys. - 1996. -115. -P. 206-210.
16. Birk Y. Trypsin Inhibitor from Garden Bean (Phaseolus vulgaris) // Methods in Enzymology. -45. - N. Y. - S.F. - L.: Acad. Press, 1976. - P. 710-716.
17. Джоржеску П., Пуэнеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. - Бухарест, 1963. - 611 с.
Кафедра физиологии и биохимии человека
Поступила 07.02.05 г.
