CC BY
54
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (155-156), 2013
Исследовали активность окислительно-восстановительных ферментов у разных по устойчивости к заразихе генотипов подсолнечника. В ходе эксперимента было установлено, что активность ферментов зависела от генотипа. В отдельных случаях наблюдали позитивный гетерозис по показателям активности ферментов, который зависел от подбора родительских форм. Активность полифенолоксидазы и каталазы у исследуемых генотипов достоверно превышала показатели линии-стандарта восприимчивости, что указывает на возможность прогнозирования устойчивости к заразихе по этим показателям.
T.V. Chigrin. The activity of redox enzymes in sunflower genotypes with different resistance to broom-rape.
The article presents the research on the activity of redox enzymes in sunflower genotypes with different resistance to broomrape. In the experiment it was determined that the enzyme activity depended on the genotype. In some cases was observed the positive heterosis on the index of enzymes activity that depended on the selection of the parent forms. The polyphenol oxidase and catalase activity in the studied genotypes was significantly higher than the susceptible line-standard indexes that indicate the ability to predict resistance to broomrape on these factors.
АКТИВНОСТЬ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ У РАЗНЫХ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ЗАРАЗИХЕ ГЕНОТИПОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА
Т.В. Чигрин,
аспирант*
* научный руководитель Петренкова В.П., доктор с.-х. наук, профессор, чл.-кор. НААН Украины
61060, Украина, г. Харьков, Московский пр., 142
e-mail: kaskavella18@mail.ru
Институт растениеводства им. В.Я.Юрьева НААН Украины
Ключевые слова: полифенолоксидаза, пе-роксидаза, каталаза, устойчивость, генотип, заразиха
УДК 633.854.78:632.9
Введение. Заразиха (Orobanche ситапа Wallr.) паразитирует на культурном подсолнечнике (Helianthus annuus L.), в результате чего потери урожая семян подсолнечника в странах средиземноморья и Восточной Европы составляют 50-90 % [1].
На подсолнечнике известно восемь рас О. ситапа: А, В, С, D, Е, F, G, Н. Три последние из них - самые вирулентные, на протяжении последнего десятилетия были обнаружены сначала в Румынии, затем в Испании и Турции. В этих странах были созданы дифференциаторы устойчивости подсолнечника к каждой из них.
В последние годы в регионах юга РФ и в основных регионах Украины, где возде-лывается подсолнечник, тоже начали рас-
пространяться новые расы заразихи, начавшие поражать весь отечественный сортимент и гибриды иностранной селекции. Актуальными стали все аспекты борьбы с этим злостным паразитом [7].
Для создания устойчивых форм подсолнечника к данному паразиту обязательным условием является проведение предварительной оценки исходного материала. Такая оценка может проводиться различными, доступными для исследователей методами: морфологическими [2], гистологическими [3; 4], биохимическими [5; 6], молекулярными [1].
Выявить новые расы с помощью линий-дифференциаторов не всегда возможно. Анализ устойчивости исходного материала с помощью морфологических и гистологических методов отличается высокой трудоемкостью. Идентификация генов устойчивости к определенным расам заразихи методами молекулярной генетики затруднена из-за отсутствия маркеров к новым агрессивным расам и высокой стоимости этих методов. В связи с этим целесообразна разработка новых экспрессных и надежных методов оценки устойчивости исходного материла подсолнечника к заразихе без учета расы паразита.
Известно, что при внедрении паразита в корневую систему растения-хозяина происходит усиление метаболизма фе-нольных соединений, которые концентрируются в местах внедрения, образуя защитный слой [4].
В этом процессе участвуют полифено-локсидаза (ПФО) (КФ1.10.3.1), перокси-даза (ПОД) (КФ1.11.1.7), каталаза (КАТ) (КФ1.11.1.6), которые играют важную роль в ответе растения на заражение и в формировании устойчивости к паразитам [8; 9]. Активность этих ферментов исследовали у пшеницы, ячменя, перца, капусты и других сельскохозяйственных культур в связи с их устойчивостью к биотическому стрессу [2; 3]. Для подсолнечника данные об активности ферментов в условиях биотического стресса ограничены.
Так, показано, что при поражении корзинок подсолнечника возбудителем серой гнили (Botrytis cinerea Fr.) активность ПФО у устойчивых сортов возрастала. У восприимчивых растений при поражении патогеном активность полифенолоксида-зы повышается незначительно или не изменяется. По мнению авторов, в корзинках устойчивых растений в ответ на поражение возбудителем серой гнили происходит быстрое окисление фенолов, вследствие чего скорость образования химического барьера из его продуктов опережает скорость проникновения гриба [10;11].
У генотипов подсолнечника, устойчивых к возбудителю ложной мучнистой росы (Plasmopara halstedii (Farl.) Berlese et de Toni) [7], а также Alternaria helian-thini (Hansf.) Tub. et Nish. [12], выявлена повышенная активность пероксидазы.
Установлена также более высокая активность пероксидазы у устойчивых форм подсолнечника, инокулированных возбудителем заразихи, по сравнению с восприимчивыми. После инокуляции Orobanche cumana Wallr., активность фермента восприимчивых генотипов не имела существенных отклонений от активности его у неинокулированных или даже снижалась [13].
Таким образом, литературные данные показывают, что под влиянием патогенов у разных сельскохозяйственных растений изменяется активность оксидаз. Вместе с тем, закономерной связи уровня активности пероксидазы, полифенолоксидазы и каталазы с уровнем устойчивости подсолнечника к заразихе не выявлено.
Ранее мы исследовали у подсолнечника активность ПФО, ПОД, КАТ при инокуляции растений заразихой [14; 15; 16]. Результаты показали, что у пораженных заразихой растений подсолнечника активность этих ферментов была выше, чем у растений, выращенных без инокуляции. При этом показатели ферментативной активности у устойчивых образцов сущест-
венно превышали показатели восприимчивых.
В связи с вышеизложенными данными целью нашей работы было определить активность этих оксидаз у генотипов подсолнечника на неинфекционном фоне и установить возможность прогнозирования уровня устойчивости по этому показателю для создания экспресс-метода оценки на устойчивость к заразихе.
Материалы и методы. Материалом для исследований были 14-дневные проростки стерильных материнских и фер-тильных отцовских линий подсолнечника и их гибриды селекции института растениеводства им. В.Я. Юрьева НААН, занесенные в Государственный реестр сортов растений Украины (перечень приведен в таблице).
Предварительная оценка исследуемого материала, проведенная нами традиционным (морфологическим) методом, показала, что отобранные генотипы характеризовались разной устойчивостью к заразихе: низкоустойчивая линия-стандарт восприимчивости (100-90 % пораженных растений, среднее количество проростков заразихи 6,14 шт. на растении), средне- и высокоустойчивые ^ числом клубеньков заразихи от 0,83 до 4,5 шт. на растении), в том числе и линия-стандарт устойчивости (таблица). Эти результаты совпадают с оценкой устойчивости по Каталогу [17; 18].
Растения выращивали в условиях искусственного климата при 22-25/18-20 оС (день/ночь) и фотопериоде 16 часов. Исследовали по 10 растений каждого генотипа. С каждого растения брали навеску 500 мг надземной массы и растирали в фарфоровой ступке с 1/15 М фосфатным буфером. Полученную ферментную вытяжку центрифугировали 10 мин на центрифуге ЦУМ-1 (Завод физических приборов, Киргизская ССР) и в суперна-танте определяли активность ферментов фотоколориметрическим методом на фо-тоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ 4.2 (РСФСР). Активность полифенолоксида-
зы (ПФО) определяли по скорости окисления ферментом пирокатехина (длина волны 420 нм), пероксидазы (ПОД) - по скорости окисления гваякола (длина волны 470 нм) [19], каталазы (КАТ) - по оптической плотности раствора комплексного соединения молибдата аммония и перекиси водорода (длина волны 405 нм) [20].
Активность ферментов выражали в условных единицах на грамм сырой ткани (ус. ед./г тк.) и обрабатывали стандартными методами вариационной статистики [21].
Результаты и обсуждение. Результаты определения активности ПФО показали, что у всех материнских и отцовских линий, а также у их гибридов активность этого фермента была существенно выше, чем у линии-стандарта восприимчивости (таблица). Активность ПФО у большинства линий и гибридов была ниже или такая же, как у линии-стандарта устойчивости. Только у линий С х 2552А и Сх1006А, а также у гибридов С х 908А/Х114В и С х 2111А/Х711В активность ПФО была выше, чем у линии-стандарта устойчивости (таблица). Поскольку активность этого фермента у линии-стандарта устойчивости существенно более высокая, чем у линии-стандарта восприимчивости, и при этом она более высокая у исследованных линий и гибридов, это позволяет предположить, что ПФО является одним из важных компонентов формирования свойства устойчивости подсолнечника к заразихе.
Определение активности пероксидазы показало, что у большинства материнских и отцовских линий, а также у гибридов ее активность была существенно более низкой, чем у линии-стандарта восприимчивости. Только у материнской линии Сх 1006А, отцовских линий Х711В, Х7620В и гибридов Сх503А х Х114В и Сх1006 х Х720В она была более высокой, чем у линии-стандарта восприимчивости (таблица).
Таблица
Активность оксидаз у линий и гибридов подсолнечника с разным уровнем устойчивости к заразихе, усл.ед./г тк.
Линия, гибрид Число клубень ков, шт./раст. Активность ферментов
полифенолоксидазы перок-сидазы каталазы
Стерильные материнские линии
Сх503А 0,83±0,2* 76,3+2,4* 10,1±1,3* 6,3+1,4*
СХ2111А 1,0±0,3* 69,1+1,3* 7,7±0,5* 3,4+0,6*
Сх1002А 2,22±0,6* 79,1+2,4* 13,6±1,6* 4,0+0,5*
Сх1012А 1,14±0,4* 70,0+3,0* 15,6+1,7 2,7+0,6
Сх2552А 4,5±0,6* 82,5+1,1* 14,5±2,3 10,1+0,7*
Сх1006А 2,0+0,3* 82,2+2,4* 19,1+1,4 2,6+0,4*
Фертильные отцовские линии
Х114В 2,83+0,2* 72,0+3,3* 9,2+1,0* 3,4+0,5*
Х711В 3+0,4* 72,0+3,3* 28,3+3,6* 2,8+0,4*
Х720В 3,5+0,6* 78,0+1,4* 20,5+2,4 7,1+1,3*
Х762В 1,0+0,3* 71,3+4,7* 8,3+1,1* 7,7+2,0*
Х526В 3,3+0,8* 73,0+5,0* 5,7+1,0* 1,9+0,3
Гибриды
Сх503А/Х114В 4,56±1,0* 78,7+0,8* 20,1+1,2 3,2+0,4*
Сх908А/Х762В 4,0+0,8* 80,2+0,9* 7+1,6* 4,6+0,5*
Сх1006А/Х720В 4,9+0,9* 73,9+1,3* 19,2+7,3 3,1+0,3*
Сх1012А/Х526В 2,8+0,3* 73,5+1,2* 8,1+0,9* 6,6+0,4*
Сх2111А/Х711В 2,44+0,4* 83,5+2,1* 13,9+2,4* 6,2+0,5*
Сх908А - стандарт восприимчивости 6,14+1,1* 56,7+2,4* 17,6+2,4* 2,0+0,4*
РЯ64А71 - стандарт устойчивости 0,0+0 77,25±1,5 12,8+2,9 5,6+0,64
*Разница между показателями опытных образцов и линии-стандарта восприимчивости достоверна при Р<0,05
Активность ПОД у большинства материнских линий (у четырех из шести), у двух отцовских (из пяти) и трех гибридов (из пяти) была более высокой, чем у линии-стандарта устойчивости. То есть у большинства исследуемого материала активность этого фермента была ниже, чем у линии-стандарта восприимчивости, но выше, чем у линии-стандарта устойчивости (таблица). Так как активность этого фермента у линии-стандарта устойчивости ниже, чем у линии-стандарта восприимчивости, то, по-видимому, он также играет определенную роль в физиолого-биохимических механизмах формирования устойчивости подсолнечника к зара-
зихе. Однако, судя по нашим данным, активность пероксидазы в защитных реакциях этого растения в ответ на заражение в меньшей мере значима, чем активность полифенолоксидазы.
Результаты определения активности каталазы показали, что у подавляющего большинства линий и гибридов она была более высокой и только у отцовской линии Х526В такой же, как у линии-стандарта восприимчивости. По сравнению с активностью этого фермента у линии-стандарта устойчивости у исследованных линий и гибридов она была или более высокой или более низкой, что может свидетельствовать о разном уровне устойчивости к заразихе исследуемых образцов подсолнечника, а также о влиянии особенностей генотипа на уровень устойчивости (таблица).
Поскольку уровень активность катала-зы у исследованных линий и гибридов совпадает с уровнем ее активности у линии-стандарта устойчивости, превышая активность линии-стандарта восприимчивости, то это позволяет считать, что этот фермент является одним из важных элементов, составляющих физиолого-биохимическую систему формирования устойчивости подсолнечника к заразихе.
Таким образом, результаты опытов позволяют предположить, что исследованные оксидазы являются компонентами физиолого-биохимических защитных механизмов подсолнечника при поражении заразихой. Более четкая связь устойчивости исследованного материала к этому патогену выявлена с помощью активности полифенолоксидазы и каталазы. Это позволяет считать, что повышенная активность этих ферментов у исследованного материала, как и у линии-стандарта устойчивости, может служить критерием оценки его устойчивости к заразихе. Поскольку методики определения активности полифенолоксидазы и каталазы относительно простые, не требуют значительных затрат времени, как традиционный (морфологический) метод, и дорогих
реактивов и оборудования, как молеку-лярно-генетические методы, то целесообразно использовать показатели активности этих ферментов для оценки и идентификации исходного материала подсолнечника, устойчивого к заразихе.
Список литературы
1. Задорожна О.А. 1дентифшащя у соняшнику гену стшкосп до вовчка Or5 за допомогою молекулярних маркерiв // Аграрний вюник причорномор'я. - 2012. - Вип. 61. - С. 158-163.
2. Кириченко В.В. Селекция и семеноводство подсолнечника (Helianthus annuus L.). - Харьков: Институт растениеводства им. В.Я. Юрьева, 2005. - 385 с.
3. Панченко А.Я, Антонова Т.С. Особенности защитной реакции устойчивых форм подсолнечника на внедрение заразихи // Сельскохозяйственная биология. - 1974. - V. 9. - № 4. - C. 554-557.
4. Echevarria-Zomeno Sira, Perez-de-Luque Alejandro, Jorrin Jesus, Maldonado M. Ana Pre-haustorial resistance to broomrape (Orobanche œmana Wallr.) in sunflower (Helianthus annuus L.): cytoche-mical studies // Jornal of Experimental Botany. -2006. - Vol. 57. - November. - Р. 41894200.
5. Авраменко Р. С. Изучение качественных особенностей различных по устойчивости к заразихе сортов подсолнечника: автореф. дис. канд. биол. наук. -Воронеж, 1973. - 23 c.
6. Antonova T.S., Terborg S.J. The role of peroxidase in the resistance of sunflower against Orobanche cumana in Russia // Weed Research. - 1996. - 36. - № 2. -P. 113-121.
7. Антонова Т.С., Арасланова Н.М., Рамазанова С.А., Гучетль С.З., Челюст-никова Т.А. Вирулентность заразихи, поражающей подсолнечник, в Волгоградской и Ростовской областях // Масличные культуры: Науч.-техн. бюл. ВНИИМК. - 2011. - Вып. 1 (146-147). -С.127-130.
8. Serghini K., Perez de Luque A.,
Castejon-Munoz M., Garcia-Torres L., and Jorrin Jesus V Sunflower (Helianthus annuus L.) response to broomrape (Orobanche cernua Loefl.) parasitism: induced synthesis and excretion of 7-hydroxylated simple coumarins // Journal of Experimental Botany. - 2001. - Vol. 52. - № 364. -Р. 2227-2234, November 2001.
9. Vanacker H., Carver T.L.W., Foyer C.H. Early H O accumulation in mesophyll
cells leads to induction of glutathione during the hyper-sensitive response in the barley-powdery mildew interaction // Plant Physiology. - 2000. - V 123. - P. 1289-1300.
10. Аксенова В.А., Кожанова О.Н. О механизме активирования пероксидазы у устойчивых и восприимчивых растений при заражении // Физиология растений. -1976. - Т. 23. - Вып. 2. - С. 391-396.
11. Чигрин В.В., Шутова Е.А., Саутич М.А. Изменение активности пероксидазы у устойчивых и восприимчивых сортов пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной // Физиология растений. -1973. - Т. 20. - Вып. 1. - С. 79-85.
12. Anjana G., Kini K.R., Shetty H.S., Prakash H.S. Changes in peroxidase activity in sunflower during infection by necrotro-phic pathogen Alternaría helianthini // Archives of Phytopathology and Plant Protection. - 2008. - V. 41. - № 8. - P. 586596.
13. Pacureanu-Joita М., Ciuca M., Stanciu D., Sava E., Stanciu M., Procopovici E. Resistance and sensitivity in the parasitic system Helianthus annuus - Orobanche Cumana // COST 849, Parasitic Plant Management in sustainable Agriculture Meeting on Breeding for Orobanche Resistance in Sunflower, Bucharest, Romania, 4-6 November 2004. - Bucharest, 2004. - P. 144.
14. Чигрин Т.В., Задорожна О.А., Петренкова В.П. Актившсть полiфенол-оксидази у рiзних за стшюстю до вовчка генотитв соняшника // Физиология и биохимия культурных растений. - 2012. -№ 4. - С. 355-360.
15. Чигрин Т., Задорожна О. Вар^ван-
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 2 (155-156), 2013
ня активносп каталази у рiзних за стшюстю до вовчка (Orobanche cumana Wallr.) зразюв соняшнику // Вicник Львiвcького ун-ту. Серiя бiологiчна. -2013.- Вип. 61. - С. 189-194.
16. Чигрин Т.В., Задорожна О.А. Актившсть пероксидази у батьювських лшш та гiбридiв соняшнику при шокуляцп вовчком // Вicник Харкiвcького нащонального унiверcитету iM. В.Н. Каразiна. Серiя: бiологiя. - 2012. - Вип. 15. - C. 109-115.
17. Каталог гiбридiв соняшнику селекцп 1нституту рослинництва iM. В. Я. Юр'ева / В.В. Кириченко, К.М. Макляк, В.П. Коломацька [та ш.]. - Харюв, 2010. -44 с.
18. Каталог рабочей коллекции самоопыленных линий подсолнечника Института растениеводства им. В.Я. Юрьева / В.В. Кириченко, З.К. Аладьина, А.Д. Гуменюк [и др.]. - Харьков, 1996. - 88 с.
19. Ермаков А.И. Методы биохимии-ческого исследования растений. - 1987. -430 с.
20. Goth L. A simple method for determination of serum catalase activity and revision of reference range // Clinica chimica acta. -1991. - 196. - P. 143-152.
21. Вольф В.Г. Статистическая обработка опытных данных. - М: Колос, 1966. - 255 с.
