защитными при его загрязнении в процессе централизованного приготовления.
В свете современной эпидемиологической конъюнктуры требуется резкое усиление работы по внедрению на молочных заводах и комбинатах комплекса мероприятий по недопущению возникновения эпидемических вспышек дизентерии. Сегодня именно здесь находится центр приложения усилий по предупреждению «молочных» вспышек дизентерии Зонне.
Первоочередного решения требует задача производства гарантированной в эпидемиологическом отношении сметаны, загрязнение которой вызывает в настоящее время наибольшее число вспышек, а также кефира и других молочных продуктов (например, творожных сырков с различными добавками, которые также выступали в качестве факторов передачи шигелл во время вспышек), не подвергаемых дополнительной термической обработке.
Проблема эффективной профилактики дизентерии, разумеется, не сводится только к этим мероприятиям, однако успешное их выполнение в ближайшее время откроет реальные перспективы резкого снижения заболеваемости населения
дизентерией и другими острыми кишечными инфекциями.
Литература
1.
Блюгер С. 59—
2. 3.
4.
Дизентерия (шигеллезы) / Покровский В. И., А. Ф., Солодовников Ю. П. и др. — Рига, 1979. — 87; 273—297.
Покровский В. И., Солодовников 10. П. // Журн. микф
робиол. — 1978. — № 2. — С.
Солодовников С. 11—23. Солодовников тики острых 1985. —С. 10-
Ю. П.Ц Гиг
101 — 106. и сан. -
1970. —№ 11.
5.
6.
7.
Ю. П. // Актуальные вопросы профилак-кишечных заболеваний. — Таллинн, 12.
Солодовников Ю. П., Чикова С. С., Милованова Т. Я.// Эстонский респ. съезд эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов и гигиенистов, 5-й: Тезисы докладов. — Таллинн, 1987.— С. 43—44.
Солодовников Ю. П., Чикова С. СМилованова Т. И. и др.//Молдавский респ. съезд гигиенистов, санитарных врачей, микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, 2-й: Тезисы докладов. — Кишинев, 1987.— С. 199—201.
Чикова С. С., Милованова Т. //.//Узбекский респ. съезд гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов, 5-й: Тезисы докладов. — Ташкент, 1987. — С. 265—267.
Поступила 21.04.88
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК 616.36-008.931-02:614.7]-092.9-07
В. А. Тутельян, Н. В. Лашнева, Г. К. Сороковая, Л. В. Кравченко,
Г. В. Чичиланова, Г. Ф. Иваненко, 3. М. Гадоюиева
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА КСЕНОБИОТИКОВ
В ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ ДИФЕНИЛОВ
Институт питания АМН СССР, Москва
При токсиколого-гигиенической оценке загрязнителей окружающей среды важное значение имеет изучение их влияния на ферментные системы, участвующие в процессах биотрансформации и детоксикации поступающих в организм ксенобиотиков. При этом весьма актуальным является выяснение вопроса о возможности использования показателей, характеризующих активность данных ферментных систем, в качестве критериев неблагоприятного влияния на организм вредных химических соединений.
К числу загрязнителей окружающей среды, представляющих экологическую опасность, относятся полихлорированные дифенилы (ПХД) — длительно применявшиеся в промышленности, чрезвычайно стабильные в природных условиях, устойчивые к биодеградации соединения, получившие в настоящее время повсеместное распространение в биосфере. Они обнаруживаются в воде," почве, воздухе, пищевых продуктах животного и растительного происхождения, грудном молоке, жировой ткани людей, не имевших профессионального контакта с этими соедине-
ниями [8, 25, 26]. Опасность указанных галоге-нированных углеводородов для здоровья челове-^ ка связана с их выраженными кумулятивными свойствами. Зарегистрированы случаи массовых отравлений населения в Японии и на Тайване вследствие употребления в пищу рисового масла, загрязненного коммерческими препаратами ПХД [8, 26].
Одним из наиболее характерных эффектов воздействия ПХД на организм является поражение печени, сопровождающееся индукцией мик-росомальной монооксигеназной системы, играющей ключевую роль в метаболизме большинства эндо- и экзогенных гидрофобных соединений [8, 12, 23, 26]. Учитывая, что промышленные препараты ПХД, как правило, представляют собой сложные смеси гомологов и изомеров хлор-производных дифенила и в объектах окружающей среды и тканях животных обычно содержатся разные изомеры ПХД, токсичность и индуцирующие свойства которых существенно раз-^ личаются [12, 23, 26], мы сочли важным выяснить особенности изменения процессов биотранс-
ф
формации ксенобиотиков при воздействии как отдельных представителей ПХД, так и их смесей.
В наших предыдущих исследованиях [7, 10] было показано, что смесь ПХД отечественного производства — совол — оказывает мощное индуцирующее действие на МОС печени крыс, вызывая резкое, длительно сохраняющееся увели-1|ение содержания основного компонента системы — цитохрома Р-450 и стойкое повышение скорости окислительного метаболизма субстратов I и II типов в микросомах печени подопытных животных. Целью настоящей работы явилось дальнейшее изучение влияния смеси ПХД на ферменты, катализирующие реакции метаболизма ксенобиотиков.
Исследования проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 210—280 г, находившихся на общевиварном (I серия опытов) либо полноценном полусинтетическом (II серия опытов) рационе. Смесь ПХД совол, содержащий главным образом пента- и тетрахлордифенилы, а также небольшие количества три-, гекса- и гепта-- хлордифенилов, вводили крысам внутрижелудоч-*но однократно в виде раствора в кукурузном масле в дозах 10, 20, 30 или 50 мг на 1 кг массы тела. Контрольные животные получали равные объемы кукурузного масла. Крыс декапити-ровали через 4—5 дней после введения совола.
Гомогенаты печени готовили общепринятым методом, используя в качестве среды гомогенизации 0,15 М KCl в 0,02 М трис-НС1-буфере pH 7,4. Микросомы печени осаждали из пост-митохондриальной надосадочной жидкости (10 000 g) при 105 000 g в течение 60 мин. Над-осадочную (105 000 g) фракцию получали после осаждения микросом. В гомогенатах печени определяли общее содержание цитохрома Р-450 [20], скорость окисления амидопирина [5] и Скорость аскорбатзависимого перекисного окисления липидов (ПОЛ) [37]. В изолированных микросомах печени определяли количество цито-хромов Р-450 и Ь5 [22], активность НАДФ-Н-цитохром P-450-редуктазы [16], скорость N-де-метилирования амидопирина [5], О-деметилиро-вания п-нитроанизола [18], гидроксилирования бенз(а)пирена [15], активность эпоксидгидрола-зы [6], п-нитрофенол-УД Ф-глюкуронозилтранс-феразы [13], скорость НАДФ-Н-зависимого и аскорбатзависимого ПОЛ [3]. В надосадочной фракции оценивали активность глутатионтранс-феразы [17] и супероксиддисмутазы [21]. В ткани печени исследовали уровень общих и небелковых тиолов [24], а также содержание микроэлементов: железа, меди и цинка [2]. Полученные данные обрабатывали методом вариацион-
V \
ной статистики с использованием критерия Стьюдента. Для гистологических исследований ^кусочки печени фиксировали в 10 % растворе формалина. Парафиновые и криостатные срезы
окрашивали по методу Гольдмана, а также гематоксилином и эозином.
В I серии опытов была предпринята попытка уточнить чувствительность системы цитохрома Р-450 к индуцирующему действию смеси ПХД при ее однократном введении в возрастающих дозах. Исследования, проведенные совместно с В. Ю. Ишковой, показали, что однократное введение совола в дозах 10, 20, 30 или 50 мг/кг не оказывало влияния на общее состояние, массу тела, абсолютную и относительную массу печени животных (при дозах 30 и 50 мг/кг отмечалась лишь тенденция к увеличению относительной массы печени). Через 4 дня после введения смеси ПХД в дозе 10 мг/кг уровень цитохрома Р-450 в печени крыс существенно не изменялся. При повышении дозы до 20 мг/кг количество цитохрома Р-450 в гомогенатах печени увеличивалось на 34 % (до 46,6±2,48 нмоль против 34,9± 1,69 нмоль на 1 г печени в контроле; р<С0,05), а при дозах 30 и 50 мг/кг количество фермента возрастало по сравнению с контролем в 1,7 и 1,9 раза, достигая 59,9±3,64 и 67,8± ±3,88 нмоль/г соответственно (средние данные 7—9 опытов). Начиная с дозы 20 мг/кг отмечалось также достоверное повышение скорости Ы-деметилирования амидопирина в гомогенатах печени крыс (до 533,6±27,3 нмоль/мин против 428,9±28,3 нмоль/мин на 1 г печени у животных контрольной группы; р<0,02). При дозе 30 мг/кг окисление амидопирина в печени крыс ускорялось в 1,7 раза (р<0,001). Следовательно, уже при однократном внутрижелудочном введении в дозе 20 мг/кг совол оказывал заметное стимулирующее влияние на систему цитохрома Р-450. Важно подчеркнуть, что эта доза составляет около 1/300 ЬО50 (5,75 г/кг) совола для взрослых крыс, т. е. более чем в 20 раз отличается от максимально индуцирующей дозы препарата [9, 10]. Примечательно, что в указанной дозе совол не стимулировал аскорбатзави-симое ПОЛ в гомогенатах печени крыс, а при введении более высоких доз смеси ПХД скорость ПОЛ возрастала на 26—33 %.
На рисунке представлены данные II серии опытов по изучению влияния однократного введения совола в дозе 50 мг/кг на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков. Из рисунка видно, что двукратное увеличение общего содержания цитохрома Р-450 в микросомах печени подопытных животных сопровождалось некоторым приростом уровня цитохрома Ь-0 и активности НАДФ-Н-цитохром Р-450-редуктазы (до 143—132 % от контроля). При этом скорость реакций Ы-деметилирования амидопирина, О-де-метилирования р-нитроанизола и гидроксилирования бензпирена в микросомах печени крыс повышалась соответственно в 1,7, 2,1 и 2,2 раза (расчеты на 1 г печени). Необходимо заметить, что наряду с одновременным увеличением как Ы-деметилазной, так и бензпиренгидроксилазной
6
6
200-
100
К
12 34567
8910
1112
Активность ферментов I (а) и II (б) фазы метаболизма ксенобиотиков и скорость ПОЛ (в) в печени крыс после однократного введения совола (50 мг/кг).
По оси ординат—активность ферментов, % от контроля; по оси абсцисс: /( — контроль; 1 — НАДФ • Н-цитохром Р-450-редуктаза; 2 — цитохром Р-450; 3 — цитохром 4 — Ы-деметилирование амидопирина; 5 — О-деметилирование п-нитроанизола; 6 — гидроксили-рование бенз(а)пирена; 7 — эпоксидгидролаза; 8 — п-нитроанизол-УДФ-глюкуронозилтрансфераза; 9 — 4-гидроксидифенил-УДФ-глюк-уронозилтрансфераза; 10— глутатионтрансфераза; 11 — НАДФ-Н-зависимое ПОЛ; 12 — аскорбатзависимое ПОЛ. Звездочка —
р>0,05, в остальных случаях р<0,05.
активности в микросомах печени крыс, получавших совол, отмечались изменения спектральных характеристик цитохрома Р-450: максимумы поглощения СО-комплексов восстановленного ге-мопротеида смещались до 448—449 нм. Это может свидетельствовать о том, что под влиянием совола в печени стимулируется синтез различных изоформ цитохрома Р-450. Такая стимуляция характерна для других промышленных смесей ПХД, в частности арохлора 1254 [11, 26]. По данным Г. А. Белицкого и соавт. [1], совол, подобно арохлору 1254, индуцирует образование в микросомах печени по меньшей мере 5 изоформ цитохрома Р-450, идентичных формам ге-мопротеида, индуцируемым барбитуратами и по-лициклическими ароматическими углеводородами [1].
Обращает на себя внимание тот факт, что параллельно с индукцией микросомальных моно-оксигеназ в печени крыс, получавших совол, повышалась активность и других ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков. Так, активность эпоксидгидролазы, ответственной за метаболизм эпоксидсодержащих соединений, после введения совола возрастала в 1,9 раза, активность глутатионтрансферазы и УДФ-глюкуро-нозилтрансферазы (субстрат — р-нитрофенол), осуществляющих реакции конъюгации, — в 1,5— 2,3 раза соответственно {р<0,01). Изменения активности 4-гидроксидифенил-УДФ-глюкуро-нозилтрансферазы из-за значительных индивидуальных колебаний оказались недостоверными.
Следует отметить, что активность микросо-мальной НАДФ-Н-зависимой системы ПОЛ у крыс, получавших совол, имела лишь тенденцию к повышению (45,44=2,73 нмоль/мин на ] г пе-
чени в опыте и 38,04=2,09 нмоль/мин на 1 г печени в контроле; /?>0,05), а скорость неферментного аскорбатзависимого ПОЛ в микросомах печени подопытных животных в данной серии опытов практически не изменялась. Что касается супероксиддисмутазы — одного из ферментов антиоксидантной защиты, то ее активность у подопытных и контрольных животных была практически одинаковой. ^
В связи с тем что тиоловые соединения, главным образом восстановленный глутатион, играют важную роль в процессах детоксикации ксенобиотиков, а также учитывая данные литературы об участии глутатиона и серосодержащих аминокислот в связывании и выведении метаболитов ПХД из организма [19], представляло интерес изучить влияние введения смеси ПХД на уровень общих тиолов в печени экспериментальных животных. Исследования показали, что концентрация общих тиолов в печени крыс, получавших совол в дозе 50 мг/кг, существенно не изменялась: у подопытных животных она составляла 19,94=0,31 мкмоль на 1 г печени, а у контрольных — 21,84=0,29 мкмоль/г; р>0,05. При^ повторении эксперимента на другой группе жи" вотных нам также не удалось выявить достоверных изменений уровня общих и небелковых тиолов после введения указанной дозы совола (концентрация общих тиолов была равна 13,94= 1,1 и 16,3=1=1,8 мкмоль на 1 г печени, а небелковых тиолов — 8,8=ь1,6 и 9,24=1,1 мкмоль/г у крыс опытной и контрольной групп соответственно). По всей вероятности, при введении совола в использованной дозе внутриклеточный фонд БН-содержащих соединений существенно не изменяется.
После введения совола в дозе 50 мг/кг в печени крыс не было обнаружено достоверных изменений концентрации изученных микроэлементов, имеющих, как известно, важное значение дл4 функционирования целого ряда ферментных систем, в том числе электронтранспортных систем микросом. Содержание железа, меди и цинка в печени крыс опытной группы составляло 88, 98 и 95% (р>0,05) от соответствующих величин у контрольных животных (70,34=3,0, 7,84=0,2 и 43,04=0,3 мкг на 1 г печени).
По данным гистологических исследований, у крыс, получавших совол (50 мг/кг), содержание жира в печени было несколько повышено (отмечалось увеличение как числа, так и размера жировых капель); чаще, чем в контроле, встречались гепатоциты с крупными ядрами в средней и периферической зонах долек, а также клетки с лизирующимися ядрами в центре долек; у большей части крыс в центральной зоне долек выявлялись очаги пролиферации купфе-ровских клеток. Изменения структуры печени у подопытных животных по своему характеру бы^ ли сходными с наблюдавшимися нами ранее после введения крысам совола в дозе 500 мг/кг
[4], но были выражены в значительно меньшей степени. Эти изменения, по-видимому, можно расценивать как проявление гепатотоксического действия, свойственного ПХД и их промышленным смесям.
Таким образом, однократное введение совола в сравнительно низкой дозе, составляющей около 1/100 ЬО50, вызывало у крыс значительную Активацию ферментных систем, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков, и сопровождалось характерными для действия ПХД морфологическими изменениями в печени. Примечательно, что в ответ на воздействие смеси ПХД в печени крыс значительно повышалась активность ферментов, катализирующих реакции как I, так и II фазы метаболизма ксенобиотиков. Такая координированная стимуляция ферментов, осуществляющих реакции окисления, гидролиза и конъюгации, может способствовать ускорению детоксикации и выведения ПХД из организма, т. е. являться одним из механизмов защиты от действия этих высоколипофильных, медленно экскретируемых соединений. Вместе с ^тем индукция микросомальных ферментов мо--жет приводить к усилению процессов метаболической активации данных ксенобиотиков и, следовательно, к усилению их токсического действия. Согласно имеющимся сообщениям [27], продукты окислительного метаболизма некоторых ПХД более токсичны, чем исходные вещества. В ряде работ [12, 23] отмечена корреляция между токсичностью ПХД и их способностью индуцировать определенные изоформы цитохрома Р-450 и связанную с ними моноокси-геназную активность. В этой связи заслуживает особого внимания тот факт, что изученная нами смесь ПХД совол оказывает индуцирующее действие на систему цитохрома Р-450 уже при однократном введении внутрь в дозах, значительно отличающихся от ЬО50. Как отмечалось выше, отчетливый прирост общего содержания цитохрома Р-450 в печени крыс вызывает доза совола, составляющая около 1/300 ЬБбо препарата.
Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что индукция цитохром Р-450-содержа-щей монооксигеназной системы печени и других ферментов метаболизма ксенобиотиков, в частности эпоксидгидролазы и УДФ-глюкуронозил-трансферазы, является весьма чувствительным показателем биологического действия ПХД, а также указывает на целесообразность изучения активности этих ферментов при гигиеническом
регламентировании их как загрязнителей окружающей среды.
Литература
1. Белицкий Г. А., Фонштейн Л. М., X у долей В. В. и др. // Экспер. онкол. — 1987. — Т. 9.— С. 20—23.
2. Вайнфорнер Д. Спектроскопические методы определения следов элементов. — М., 1979.
3. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисле-
• ние липидов в биологических мембранах. — М., 1972.
4. Гаджиева 3. М., Лашнева Н. В., Хан А. В. // Вопр. питания. — 1987. — № 1. — С. 45—50.
5. Карузина И. И., Арчаков А. И. // Современные методы в биохимии.— М., 1977.— С. 49—62.
6. Кранаускас А. Э., Кравченко Л. В., Тутельян В. А. // Вопр. мед. химии. — 1986. — № 1, —С. 37—39.
7. Лашнева Н. В., Тутельян В. А.// Фармакол. и ток-сикол. — 1984. — № 6. — С. 77—80.
8. Полихлорированные бифенилы и терфенилы. — М., 1980.
9. Тутельян В. А., Лашнева Н. В. Полихлорированные бифенилы. — М., 1988.
10. Тутельян В. А., Хан А. В., Лашнева Н. В. и др.// Бюл. экспер. биол. — 1986. — № 1. —С. 38—40.
11. Alvares A. P., Kappas A. //J. biol. Chem. — 1977. — Vol. 252. —P. 6373—6378.
12. Anders J., Robertson I., Bandiera S. et al. // Toxicol, appl. Pharmacol. — 1983. — Vol. 70. — P. 204—215.
13. Bock K. W., Clausbruch U. C., Kaufmann R. et al.// Biochem. Pharmacol. — 1980. — Vol. 29. — P. 495— 500.
14. Burchell ВWeatherill P. //Meth. Enzymol. — 1981.— Vol. 77. — P. 169—176.
15. Dehnen W., Tomingas R., Roos J. // Analyt. Biochem.— 1973. — Vol. 53. — P. 373—383.
16. Guengerich F. P. // Principles and Methods of Toxicology/Ed. A. W. Hayes. — New York, 1982. — P. 609—634.
17. Habig W. H., Pabst M. J., Jacoby W. B.// J. biol. Chem.— 1974. — Vol. 249. — P. 7130—7139.
18. Kamataki Т., Kitada M., Shigematsu И., Kitagava H, // Jap. J. Pharmacol. — 1979. — Vol. 29. — P. 191—201.
19. Klasson-Wehler E., Bergman A., Kowalsky В., Brandt /.//Xenobiotica. — 1987. — Vol. 17. — P. 477— 486.
20. Matsubara Т., Koike M., Touchi A. et al. 11 Analyt. Biochem. — 1976. — Vol. 75. — P. 596—603.
21. Morimitsu Nishikimi, Rao N. A., Yagi K- // Biochem. biophys. Res. Commun. — 1972. — Vol. 46. — P. 849— 854.
22. Omura T.t Sato R. // J. biol. Chem. — 1964. — Vol. 239 _p 2370_2377
23. Poland A. //Biol Mech. Dioxin Act. — New York, 1984. —P. 109—117.
24. Sedlak Y. R., Lidsay R. H. //Analyt. Biochem. — 1968. — Vol. 25. —P. 192—196.
25. Wasserman M., Wasserman D., Cucos S., Miller H. J. // Ann. N. Y. Acad. Sei. — 1979. — Vol. 320. — P. 69—124.
26. WHO. PCBs, PCDDs and PCDFs: Prevention and Control o! Accidental and Environmental Exposures. — Copenhagen, 1987.
27. Yoshimura Yonemoto Y., Yamada H. et al. // Xenobiotica. — 1987, — Vol. 17. — P. 897—910.
Поступила 10.10.88